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Informe 4 MICROBIOLOGIA -
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE
CULTIVO Y MANEJO DEL
AUTOCLAVE
Luis Angel L A T P Tamara Polo

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Report e microbiología Bt
SriveraV Rivera

Manual de Práct icas de Biología y Microbiología

Gloria Marisol Jauregui Minchan

Pract icas
Leonardo Jain Toral
 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y MANEJO DEL AUTOCLAVE

Elianeth Romero, José Cobo, Ketty Pérez Melendres & Luis Ángel Tamara Polo.
Universidad de Sucre
Programa de Biología
Microbiología General

INTRODUCCIÓN

Identificar una bacteria consiste en determinar la especie a la que pertenece y, en algunos

casos, el serogrupo e incluso la cepa. La primera fase, y quizá la fundamental para la
identificación de una bacteria, es la obtención de un cultivo puro utilizando las técnicas de
aislamiento. Una vez obtenido un cultivo puro, habitualmente se determina morfología y
agregación (coco, bacilo, cadenas, racimos, etc.), efectuando una tinción de Gram. Estos
datos permiten encuadrar la bacteria en alguno de los grandes grupos, como cocos Gram
positivos, bacilos Gram negativos, etc. A partir de este punto, se valoran las características
de crecimiento, lo que se efectúa sembrando la bacteria en diversos medios de cultivo y en
distintas condiciones de incubación [1].

Un cultivo puro es aquel que se obtiene de la multiplicación de una sola bacteria; se

supone que una colonia aislada proviene de una sola bacteria; el cultivo puro se incrementa
en un medio de cultivo apropiado, el cual se selecciona según la experiencia del técnico y la
información bibliográfica disponible [2].

Como ya se ha mencionado, en la naturaleza las bacterias conviven con gran variedad de

otros microorganismos y solo en muy raras ocasiones se encuentran como especie única.
Por ejemplo, en las muestras clínicas usualmente las bacterias patógenas se encuentran
junto con las de la flora indígena, por lo que es necesario aislar las primeras. En muchos
procesos industriales es necesario recuperar solo el agente de interés, dentro de una flora
mixta. Por estas y otras razones, se emplean técnicas que permitan la separación de los
diferentes tipos de bacterias presentes en una muestra, así como también que permitan
evaluar la pureza de un cultivo. Solo al tener la certeza de que el cultivo está puro, es
posible realizar cualquier estudio bacteriológico [3].

El objetivo de la práctica fue el obtener colonias de bacterias en cultivo puro mediante la

técnica de estriado. De igual forma desarrollar destrezas ante las técnicas de trabajo
aséptico y la manipulación adecuada de microorganismos.
 METODOLOGÍA

Los procesos llevados a cabo durante esta práctica se contemplan en el Diagrama 1.

Procedimiento

Siembra por estrías Siembra masiva

Se encendió el mechero y se
dispuso todo el material a utilizar Con un hisopo se tomó un poco
(Caldo). de muestra liquida (Caldo) y se
esparció por la superficie de la
caja de Petri.
Se anotó el color y la morfología
de las colonias seleccionadas A modo de estría uniforme que
para el aislamiento. recubriera gran la mayor parte de
la superficie del agar (Figura
Antes de la siembra se dividió el 2:C)
medio en tres sectores (a, b y c)
trazando una T en el exterior de Luego
las cajas de Petri (Figura 2:A)
Siembra en serpentina
Con la caja de Petri y cerca del
mechero, se abrió en forma de
Se procedió a sembrar un poco de
bisagra se procedió a realizar la
muestra sólida en serpentina
siembra.
(Figura 2:D) en la caja de Petri
sin dividir.
Se deslizó el asa sobre la placa con
agar nutritivo, partiendo del sector
Se llevaron las placas a la
a y manteniendo el anillo paralelo
incubadora.
a la superficie del medio, a partir
de la última estría del sector a, se Se evaluaron las placas a las 24
estrió nuevamente pero sin horas y se anotaron datos
sobreponer la líneas sobre la referentes a su morfología (forma,
superficie del sector b y luego se color y tamaño).
repitió lo mismo para el sector c en
forma de serpentina (Figura 2:B),
el proceso culmino con el cerrado
de la tapa.

Diagrama 1. Proceso general utilizado durante la práctica.

 RESULTADOS Y DISCUSION

El crecimiento de los microrganismos fue positivo para en el medio sólido y el medio

líquido. La única diferencia que se podría plantear es con respecto a la herramienta con la
que se sembró. De acuerdo con los resultados, la siembra con el Asa microbiológica fue
más efectiva para la diferenciación de colonias. A diferencia de la siembra con hisopo que
se ve reflejado como una especie de camino bacteriano casi uniforme del cual no se aprecia
bien la dispersión de colonias.

Partiendo de la morfología de la muestra inicial la cual presentaba colonias medianas,

convexas, de color blanco-amarillento, forma irregular y bordes ligeramente redondeados.
Se obtuvieron cultivos relativamente idénticos, con características morfológicas casi
exactas mencionadas anteriormente para el tipo de siembra en serpentina (Figura 1:C). Por
otro lado, en los cultivos por estría se observó una morfología colonial bacteriana
superficial plano-convexa, con formas coloniales redondeadas, de tamaño mediano-
pequeño y bordes onduladas (Figura 1:A). Pero para el cultivo masivo se observó una
morfología colonial plana-convexa con colonias de forma irregular y bordes ligeramente
redondeados (Figura 1:B).

Figura 1. Resultado de cada uno de os tipos de siembra empelados en la práctica. A:

Siembra por estrías, B: Siembra masiva y C: siembra por serpentina.

El uso de medios de cultivo adecuados debe dar como resultado el rápido crecimiento de
microorganismos viables que, directamente o mediante posteriores resiembras, formarán
colonias aisladas disponibles para su estudio. Cada colonia representa la descendencia de
una única bacteria o de un pequeño grupo de bacterias del mismo tipo, esto es ideal para
practicar taxonomía microbiana [4].

Al aislar las colonias de células bacterianas y sembrarlas por la técnica estriado y masivo de
la muestra, se obtienen cultivos puros, estos son esenciales para poder estudiar las
características de los microorganismo, para poder identificarlos con seguridad [5].
Cuando se inocula un medio como el agar nutritivo en cajas de Petri, por el método de
“siembra por estría cruzada en placa”, las células quedan separadas individualmente.
Durante la incubación, las células microbianas individuales se reproducen tan rápidamente
que en un tiempo de 18 a 24 horas producen masas visibles a simple vista, denominadas
colonias. Cada colonia que se observe diferente, presumiblemente es un cultivo puro de una
sola clase de bacterias. Si dos células microbianas procedentes del inóculo original quedan
muy cerca una de la otra sobre el medio de agar, las colonias que resultan pueden quedar
mezcladas o muy juntas [6].

Figura 2. Se muestran cada uno de los tipos de siembras utilizados durante la práctica.
A: Se muestra la manera como se dividió la caja de Petri la disposición de las letras a, b y c,
B: Siembra por estrías, C: Siembra masiva y D: Siembra en serpentina.

El empleo de medios sólidos en cajas de Petri permiten separar una célula o un grupo
pequeño, de modo que al multiplicarse cada célula (idealmente) o pequeño grupo forme una
colonia separada; estas colonias se pueden contar y con ello calcular el número de bacterias
en el cultivo original, o bien, manifestar sus características coloniales que son de gran
ayuda para evaluar la pureza del cultivo [7].

Entre los dos métodos tradicionalmente empleados para la obtención de cultivos puros
encontramos el aislamiento por vaciado y el aislamiento por estría. Por economía de tiempo
y materiales, el estriado es el que rutinariamente se emplea; sin embargo, requiere de
práctica pues depende de una habilidad y destreza que el estudiante debe desarrollar por sí
mismo, lo que tendrá oportunidad de realizar múltiples veces durante el semestre. La
calidad del rayado por estría dependerá de la cantidad de bacterias que se tomen en el
primer inóculo y ello depende de la concentración de bacterias en la muestra original.
Usualmente el principal problema es un inóculo excesivo, que no permite separar colonias
aun en la cuarta zona de rayado. En la tercera o cuarta zona de rayado debe tenerse cuidado
de no introducir el asa en la zona inicial, pues cargaría de bacterias nuevamente el asa y se
perdería la dilución que se venía realizando [8].

CONCLUSIONES

La siembra por estría permite aislar bacterias que dan lugares a colonias separadas y
posteriormente, transfiriendo una sola colonia a un medio nuevo, se permite el desarrollo de
un cultivo puro bacteriano. No obstante al realizar un proceso de distribución de una
población bacteriana en un espacio determinado, la probabilidad de separar colonias
dependerá del área se rayada, de ahí que las rayas deben ser lo más seguidas posible pero
sin traslaparse y tratando de rayar la mayor área posible de la placa. Entre más zonas
queden sin rayar menor será la probabilidad de separar colonias. Cuándos se realizan
siembras con el Asa microbiológica en superficie con medios sólidos debe tenerse en
cuenta que no debe enterrarse en el agar. Por lo regular se tiende a creer que para tener
éxito en el cultivo del microorganismo el asa de siembra debe traer una gran cantidad de
material, una colonia del tamaño de una cabeza de alfiler contiene varios millones de
células, de manera que una pequeñísima cantidad, a veces invisible, es suficiente. El asa se
desliza sobre la superficie trazando rayas o estrías con suma suavidad. Si se trata de un
medio líquido, el asa con el inóculo se sumerge en el medio y luego se agita.

CUESTIONARIO

1. Usted tiene un cultivo mixto y desea obtener cultivo puro. ¿Cómo procedería?

La obtención de un cultivo puro, a partir de una población mixta, se lleva a cabo en dos
etapas:

1. La muestra debe diseminarse de manera tal que los diferentes microorganismos queden
lo suficientemente separados sobre la superficie de un medio de cultivo sólido, de manera
que luego de la incubación ellos formen colonias visibles aisladas. Este proceso se conoce
como aislamiento. En esta placa tendremos diferentes tipos de colonias correspondientes a
los diferentes microorganismos presentes en la población original.

2. Luego de tener las colonias aisladas, éstas deben transferirse con el filamento a un tubo
que contenga agar nutritivo estéril para cultivar esa colonia aislada; este procedimiento se
conoce como transplante.

Para garantizar la pureza del cultivo obtenido, es conveniente, a partir de cada tipo de
colonia aislada, repetir el proceso de aislamiento antes descrito. Se considerará que se ha
obtenido un cultivo puro, cuando al realizar este proceso, todas las colonias obtenidas
presenten las mismas características [9].
2. ¿Qué es una colonia bacteriana?

Una colonia es una agrupación de bacterias formada a partir de la reproducción de una

Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio sólido; aunque varía de tamaño
generalmente es visible a simple vista. Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien
un grupo de microorganismos de una misma especie como en el caso de bacterias que
tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los estreptococos. Las
colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color
característicos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es
constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la forme
[10].

3. ¿A qué se le denomina cepa en microbiología?

Una cepa es un conjunto de células homogéneas, o clones, que deriva de la reproducción de

una célula inicial única, seleccionada y aislada. También suele referirse a las cepas como
colonias puras de bacterias

4. ¿Qué es una cepa pura? Investigue instituciones que se encarguen de venderlas.

Una cepa pura es un cultivo puro derivado de un solo aislamiento [12].

Las cepas ATCC son microorganismos certificados para el control de calidad en

microbiología y es utilizado en disciplinas como la clínica, alimenticia, farmacéutica,
cosmética o ambiental [13]. Algunas empresas encargadas de su comercialización son:

• D. Q. Microbiologia Laboratorios: Somos proveedores de Cepas ATCC en Alemania 100

Col. Col. México 68, Naucalpan de Juárez, Estado de México C.P. 53260. México.

• MDM Científica: Somos proveedores de Cepas ATCC en Calle 7 sur # 51A-90 Medellin,
Antioquia Colombia.

• Distribuidora LGSCIENCE: Ofrecemos cepas atcc microbiologics en Marte 103 - P. 2

Desp. Col. Guerrerro, Cuauhtémoc, Ciudad de México C.P. 06300. México.

5. Morfológicamente, ¿qué tipos de colonias bacterianas existen?

Las colonias son la manera macroscópica de observar la morfología que constituye una
agrupación de bacterias [14] [15]. La morfología de una colonia dependerá del borde y la
forma en que se eleva sobre el medio de cultivo. Así, se menciona que la forma de una
colonia puede ser:
• Circular: Pueden medir hasta 4,0 mm.
• Puntiforme: Denominados también en "cabeza de alfiler".
• Irregular: No representan una forma geométrica.
• Rizoide: Presentan una forma helicoidal.
• Fusiforme: En forma de husos.

En cuanto a los bordes estos pueden ser:

• Enteros: Son homogéneos en todo su recorrido.

• Ondulados: Presentan pequeñas fenestraciones.
• Lobulados: Sus bordes son curveados de manera irregular.
• Filamentosos: Presentan finos filamentos alrededor de toda la colonia.

La elevación de la colonia puede ser:

• Plana
• Convexa
• Elevada

Las colonias pueden presentar diferentes texturas, estas pueden ser:

• Lisas: Presentan una superficie homogénea.

• Concéntricas: Su textura se extiende de manera circular, por lo general de afuera hacia
adentro.
• Arrugadas: Su superficie presenta pequeñas áreas sobresalientes y leves depresiones.
• Con curvas: Llamadas también sinuosas, presenta una textura similar a la concéntrica, la
diferencia radica en que este presenta un contorno más irregular.

Las bacterias en conjunto, presentan también otras características como:

• Pigmentación: Que puede ser verde, amarillo o grisáceo.

• Olor: frutal o putrefacto.
• Consistencia: mucoide, liso o rugoso.
• Comportamiento óptico: frente a luz transmitida estos pueden ser opacos, translúcidos o
transparentes; frente a la luz reflejada estos pueden ser brillantes u opacos [16].

6. ¿Qué información proporcionan el desarrollo de bacterias en medios líquidos y

semisólidos?

Medios líquidos brindan información acerca el incremento de bacterias, determinación de

sus propiedades fisiológicas, para el incremento masivo de bacterias y hongos con fines de
experimentales (generalmente bajo agitación) y para estudios de crecimiento de
microorganismos. Industrialmente tienen uso en la preparación de productos accesorios al
crecimiento los microorganismos, ácidos orgánicos y antibióticos [17]. Por otro lado los
medios semisólidos brindan información sobre la movilidad de bacterias [18].

BIBLIOGRAFÍA

[1] De la Rosa Fraile, M., et al. (2011). Microbiología en ciencias de la salud: conceptos y
aplicaciones, Elsevier España, S.L.U.

[2] CIAT (1981) Enfermedades Bacterianas del Frijol: Identificación y control. Guía De
estudio.

[3] Cavallini, E. R. (2016) Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio.

2A. ED. Editorial de la Universidad de Costa Rica.

[4] Martos, P. G., et al. (1994). Microbiología clínica práctica, Servicio de Publicaciones.
Universidad de Cádiz.

[5] Madigan, Michael; Martinko, John; Parker, Jack. 2003. Brock: Biologia de los
microorganismos. 10ma edición. Pearson Prentice Hall. Buenos Aires.

[6] Alarcón, L. R. (2001). Manual de prácticas de Microbiología básica y Microbiología de

alimentos. Programa de Nutrición, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

[7] Jorge Luna, F. (2012). Manual de prácticas de laboratorio de Microbiología,

Universidad del Magdalena.

[8] Rodríguez, E., Gamboa, M., Hernández, F., & García, J. (2005). Bacteriología general:
Principios y prácticas de laboratorio. Costa Rica: Editorial Universidad de Costa
Rica.

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[11] Iquímicas. (2018).¿Qué son las cepas bacterianas?. [online] Available at:
https://iquimicas.com/que-es-una-cepa-bacteriana/ [Accessed 18 Mar. 2018].

[12] Rodríguez, J. Á. G., et al. (1999). Compendio de microbiología médica, ELSEVIER

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[13] MDM. (2018). La importancia de las cepas ATCC Microbiologics en tus cultivos para
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[14] Pírez M., Mota M.; Morfología y estructura bacteriana. 2008. [online] Available at:
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf/
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[15] Anónimo. Morfología de las colonias bacterianas. 2009. [online] Available at:
http://microdonto.files.wordpress.com/2009/03/morfologia-de-lascolonias-
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[16] Díaz G.A.; Morfología y estructura bacteriana. Centro de formación profesional.

Instituto Villaverde. 2009- 2010. [online] Available at:
http://microbitos.files.wordpress.com/2010/06/morfologia-yestructura-
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[17] Es.slideshare.net. (2018). MEDIOS DE CULTIVOS: METODOLOGÍA Y USOS......

[online] Available at: https://es.slideshare.net/WARAUYA20/medios-de-cultivos-
metodologa-y-usos [Accessed 18 Mar. 2018].

[18] Santiago (2018). Clasificación de los medios de cultivo (bacteriología). [online]

Es.slideshare.net. Available at:
https://es.slideshare.net/beatriznedsantiago/clasificacion-de-los-medios-de-cultivo
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