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UNIVERSIDAD CATOLICA SANTA MARIA

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL
CURSO: MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

PRACTICA 3

OBSERVACION DE BACTERIAS TEÑIDAS: TINCION SIMPLE,

Y TINCION GRAM
PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA IDENTIFCACION DE
MICROORGANISMOS

INTRODUCCIÓN

Como un resultado del tamaño pequeño de los microorganismos, la cantidad de información

acerca de sus propiedades y características que puede ser obtenida de cada individuo es limitada.
Por lo tanto se estudia poblaciones conteniendo millones ó billones de individuos.
Dichas poblaciones son obtenidas por crecimiento de microorganismos bajo condiciones bien
definidas llamadas Cultivos.
Dado que los microorganismos no requieren de mucho espacio para desarrollar, por lo tanto se
le puede crear un medio ambiente artificial en un tubo, frasco ó placa Petri, siendo éstos tres
tipos más comunes para dichos cultivos.

Teniendo en cuenta que los microorganismos son ubicuos es decir que se encuentran en
cualquier ambiente, pueden aislarse igualmente de diversos substratos, la decisión para elegir un
substrato de muestreo depende del grupo de Microorganismos de interés.

Las técnicas de aislamiento, permiten la obtención de microorganismos a partir de muestras

complejas (suelo, agua, aire, alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad microbiana, así
como para comprobar la pureza de los cultivos obtenidos.

Los cultivos puros están formados por un solo tipo de microorganismo; y son indispensables
para conocer las características morfológicas, propiedades de tinción, actividad bioquímica,
patogenicidad, sensibilidad a antibióticos e identificación de las especies microbianas.

Algunas veces los microorganismos se han adaptado a condiciones muy específicas y podrán
requerir procedimientos de trabajo para aislamiento y siembra especiales como es el caso de
microorganismos anaerobios, autótrofos, etc.

El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por métodos de dilución, en medios

sólidos por estría en placa o en medios líquidos. En el primer caso se considera que cada célula
bacteriana que se separa dará origen a una población que formará una colonia característica,
visible a simple vista.

La limitación principal de estas técnicas de dilución, es que no es práctica para el aislamiento a

partir de mezclas donde el microorganismo de interés se encuentra en pequeñas cantidades,
donde solamente se obtendrán las bacterias dominantes. Por lo que para favorecer el aislamiento
de cultivos de baja densidad, se aplican métodos de cultivo en medios que contienen nutrientes
especiales, antibióticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura
para favorecer el crecimiento del microorganismo de interés (medios selectivos).

Un medio de cultivo se define como un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos.
La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, al igual que la variedad de medios
de cultivo. Los cuales mayormente se comercializan en forma de liofilizados que es preciso
rehidratar, siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan
por filtración y se añaden al resto de los componentes previamente esterilizados en el autoclave.
Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: Agar, Extractos, Azúcares,
peptonas, etc
Los cultivos deben de ser hechos en forma completamente estéril,

OBJETIVOS
1. Que el alumno aprenda las diferentes técnicas de siembra microbiana existentes para
cultivos bacterianos.
2. Que el alumno indentifique las características del crecimiento bacteriano en los
diferentes medios de cultivo.

MATERIALES
 Placas Petri con Agar nutritivo
 Placas con agar sangre
 Placas con agar McConkey
 Tubo con agua destilada estéril
 Tubos con BHI
 Tubos con Manitol
 Mecheros
 Asa de inoculación
 Incubadora
 Muestras
 Autoclave

METODOLOGIA

A.- SIEMBRA

SELECCIÓN DE COLONIAS Y SIEMBRA EN TUBO

1. Técnica aplicable en caso de tener crecimiento de colonias en una placa petri.
2. Examinar la placa estriada y escoger una colonia aislada marcando su posición con un
circulo por el lado inferior de la placa petri.
3. Flamear la aguja de inocular.
4. Levantar la parte superior de la placa petri para sacar una porción del cultivo bacteriano
seleccionado.
5. Después de haber obtenido el inoculo colocar la tapa de la caja y tomar un tubo con
medio de cultivo líquido.
6. Quitar el tapón, flamear el borde de tubo y sumergir el inoculo dentro del caldo.
Sacudir la aguja.
7. Flamear el borde del tubo y volver a colocar el tapón correspondiente.
8. Flamear la aguja de inocular.
9. Identificar el tubo con la información necesaria.
10. Inocular el tubo de ensayo en forma similar a la descrita anteriormente

SIEMBRA EN PLACA (TÉCNICA DE ESTRÍA CRUZADA):

En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra con el
asa previamente flameada y fría, inocular la muestra haciendo 4-5 estrías simples muy juntas de
lado a lado sobre el primer cuadrante de la placa.
Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir
nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona
de estrías recién hechas.
Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías y hacer un segundo grupo
de estrías en el segundo cuadrante como en el caso anterior. Repetir el procedimiento anterior en
el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el último cuadrante, no se deberá flamear el asa de
siembra y se hará una estría más abierta (simple).

SIEMBRA EN AGAR INCLINADO:

Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inóculo que se
extiende sobre el agar inclinado deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag. En el
caso del medio TSI, la siembra se deberá realizar tanto en superficie (aerobiosis) como en la
profundidad del agar (anaerobiosis).
 Una vez sembrados, colocar los cultivos a incubar a 37 ºC de 24 – 48h o hasta que se observe
crecimiento bacteriano. Si la evaluación no se hace después del periodo mencionado, conservar
las placas petri y los tubos con cultivo a 4ºC.

Otros tipos de siembra:

1. Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa Petri y sobre el mismo se
vierte el medio de cultivo previamente fundido. Se utiliza para microorganismos
aerobios.
2. Siembra en doble capa: similar por inmersión. Una vez solidificado el medio se vierte
una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la capa . Este método se utiliza para
microorganismos anaerobios facultativos y microaerofílicos.
3. Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo
autoclavado se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inóculo, se extiende el
inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se
recomienda para microorganismos aerobios estrictos.

B.- EVALUACION DE LAS CARACTERISTICAS BACTERIANAS

Se debe de considerar los siguientes aspectos:

1. Cantidad de colonias:
2. Color: Blanco, gris, amarillo, naranja, etc
3. Forma: circular, irregular, filamentosa o rizoide.
4. Borde: entero, lobulado, aserrado.
5. Superficie: lisa o rugosa.
6. Aspecto de la colonia: húmeda, seca, butirosa.
7. Elevación: convexa, plana, hundida.
8. Luz transmitida: traslúcida, opaca.
9. Luz reflejada: brillante, mate.
10. Consistencia: dura, blanda, mucoide.
11. Hemólisis: Alfa, Beta . Alfa-Beta
CUESTIONARIO

1. Haga un resumen de la clasificación de los medios de cultivo en base a su

a. Composición química
b. A su función
c. A su consistencia

2. Cuál es la información que se obtiene de las siembras de cultivos bacterianos en tubos con
agar inclinado y en tubos con agar solidificado en forma recta?
3. Indique cuales son los componentes del Agar Mc Conkey, BHI, TSI, Agar sangre, Agar
nutritivo y sus características para el desarrollo de bacterias.
4. Definir los siguientes términos relacionados a la microbiología:
a. Agar
b. Azúcares
c. Extractos
d. Sistemas amortiguadores
e. Peptonas
f. Agentes reductores
g. Indicadores de pH
5. Recopilar la información de la caracterización colonial de cada cepa en el cuadro siguiente:
Morfología colonial de cultivos bacterianos

Microorganismo 1 Microorganismo 2 Microorganismo

3
Aislamiento por
Estría cruzada
Forma:
Color:
Tamaño (mm):
Borde:
Superficie:
Aspecto:
Elevación:
Luz trasmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:

6. De acuerdo a su caracterización, podría identificar cuales especies se encuentran presentes

en los cultivos?.
1. 1. •Desarrollada por el bacteriólogo ChristianGram en 1884•Permite la rápida
evaluación de morfología ycomplejidad bacteriana•Tinción rápida y
Económica•Puede variar según el protocolo usado(necesidad de estandarizar el
protocolo)
2. 2.  Portaobjetos Agua destilada Pipetas Pasteur, haza, Mechero. Cristal
Violeta Lugol Alcohol acetona Safranina (u otra tinción de contraste)
3. 3.  Colocar una pequeña gota de Agua destilada en el portaobjetos (con pipeta
por ejemplo) Re-suspender muestra en el portaobjetos. Secar al mechero. La gota
de agua debe Se debe calentar por 5 ser pequeña min aprox, hasta que toda el
agua se seque.
4. 4.  Se debe colocar Cristal Violeta cubriendo toda la muestra por 1min (variable
según lab.) Se lava con agua corriente Puede hacerse con gotario o pizeta
5. 5.  Luego debe agregarse el lugol. Este debe aplicarse como el cristal violeta y
también debe cubrir la muestra por 1 min. Luego se lava con agua corriente.
6. 6.  El cubrir la muestra con alcohol acetona para decolorarla es el paso más critico
del procedimiento. Este debe cubrir la muestra por el tiempo que puede ir de 15s a
30s según corresponda y la reacción debe ser detenida con el lavado con agua
corriente. El tiempo debe ser el mismo para todas las muestras. Al ser tiempos por
lo general muy cortos, se recomienda agregar el alcohol mientras ya se tiene la
llave del agua corriendo, listo para el lavado.
7. 7.  El último paso consiste en agregar una tinción de contraste, para teñir las
bacterias que pierden el cristal violeta. Para esto se agrega safranina cubriendo la
muestra por 15s o por 1min, dependiendo. Luego se lava con agua corriente y se
deja secar.
8. 8.  Bacterias Gram positivas: ◦ Corresponden a las bacterias que mantienen la
coloración del cristal violeta después del alcohol acetona, lo que les da un color
violeta/morado. Streptococcus pneumoniae Bacteria Gram positiva, desde cultivo
bacteriano en agar sangre.
9. 9.  Bacterias Gram negativas: ◦ Corresponden a las bacterias que pierden la
coloración del cristal violeta después del alcohol acetona y se tiñen con el
colorante de contraste (safranina), lo que les da un color rosáceo/rojizo.
Escherichia coli Bacteria Gram Negativa, cultivo desde agar Macconkey
10. 10.  Es conveniente estandarizar los tiempos de tinción para cada laboratorio, ya
que la calidad y concentraciones de reactivos pueden variar bastante. Lo más
recomendable es realizar el gram de los cultivos de agares enriquecidos y de
colonias aisladas y en crecimiento. Los gram directos de una muestra solo son
 útiles en ciertos casos. Las bacterias anaerobias son más difíciles de teñir, esto
puede mejorar si se agrega bicarbonato mezclado a las tinciones. La muestra no
debe ser excesiva para poder determinar las otras características de la bacteria,
como forma y agrupación.
11. 11. Se presentan las imágenes sin modificaciones usadas en la presentación
Reencuadre Brillo -27 Contraste -50 Reencuadre
12. 12. Brillo +38Contraste +22Brillo +29Contraste +26
13. 13. Brillo +80Saturación -31Luminosidad +6

1. •Desarrollada por el bacteriólogo ChristianGram en 1884•Permite la rápida evaluación

de morfología ycomplejidad bacteriana•Tinción rápida y Económica•Puede variar según el
protocolo usado(necesidad de estandarizar el protocolo)
2. 2. Portaobjetos Agua destilada Pipetas Pasteur, haza, Mechero. Cristal
Violeta Lugol Alcohol acetona Safranina (u otra tinción de contraste)
3. 3. Colocar una pequeña gota de Agua destilada en el portaobjetos (con pipeta por
ejemplo) Re-suspender muestra en el portaobjetos. Secar al mechero. La gota de agua debe Se
debe calentar por 5 ser pequeña min aprox, hasta que toda el agua se seque.
4. 4. Se debe colocar Cristal Violeta cubriendo toda la muestra por 1min (variable según
lab.) Se lava con agua corriente Puede hacerse con gotario o pizeta
5. 5. Luego debe agregarse el lugol. Este debe aplicarse como el cristal violeta y
también debe cubrir la muestra por 1 min. Luego se lava con agua corriente.
6. 6. El cubrir la muestra con alcohol acetona para decolorarla es el paso más critico del
procedimiento. Este debe cubrir la muestra por el tiempo que puede ir de 15s a 30s según
corresponda y la reacción debe ser detenida con el lavado con agua corriente. El tiempo debe ser
el mismo para todas las muestras. Al ser tiempos por lo general muy cortos, se recomienda
agregar el alcohol mientras ya se tiene la llave del agua corriendo, listo para el lavado.
7. 7. El último paso consiste en agregar una tinción de contraste, para teñir las bacterias
que pierden el cristal violeta. Para esto se agrega safranina cubriendo la muestra por 15s o por
1min, dependiendo. Luego se lava con agua corriente y se deja secar.
8. 8. Bacterias Gram positivas: ◦ Corresponden a las bacterias que mantienen la
coloración del cristal violeta después del alcohol acetona, lo que les da un color violeta/morado.
Streptococcus pneumoniae Bacteria Gram positiva, desde cultivo bacteriano en agar sangre.
9. 9. Bacterias Gram negativas: ◦ Corresponden a las bacterias que pierden la coloración
del cristal violeta después del alcohol acetona y se tiñen con el colorante de contraste
(safranina), lo que les da un color rosáceo/rojizo. Escherichia coli Bacteria Gram Negativa,
cultivo desde agar Macconkey
10. 10. Es conveniente estandarizar los tiempos de tinción para cada laboratorio, ya que
la calidad y concentraciones de reactivos pueden variar bastante. Lo más recomendable es
realizar el gram de los cultivos de agares enriquecidos y de colonias aisladas y en crecimiento.
Los gram directos de una muestra solo son útiles en ciertos casos. Las bacterias anaerobias
son más difíciles de teñir, esto puede mejorar si se agrega bicarbonato mezclado a las
tinciones. La muestra no debe ser excesiva para poder determinar las otras características de la
bacteria, como forma y agrupación.
11. 11. Se presentan las imágenes sin modificaciones usadas en la presentación Reencuadre
Brillo -27 Contraste -50 Reencuadre
12. 12. Brillo +38Contraste +22Brillo +29Contraste +26
13. 13. Brillo +80Saturación -31Luminosidad +6

Preparación de un frotis bacteriano

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o
cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen
agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis
debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos
habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin
que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión
bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo
menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que
pudiera haber.

REALIZACIÓN DEL FROTIS

1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es

necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya
que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua,
que resulta suficiente.

2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad

del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la
mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede
bastante extendida para facilitar su secado.
Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los
dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión
bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.

3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta

a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar
demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.

FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS

4. Por calor: Pasar cinco veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos.
Dejar enfriar el porta entre los pases.

Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser
observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el
proceso de tinción.

TINCIÓN DEL FROTIS BACTERIANO

5. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que
indique el protocolo de cada tinción concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos. En
ocasiones el colorante tiñe sólo en caliente, por lo que el tiempo que dure su
actuación se deberá sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama del
mechero para que humee el colorante, pero teniendo mucho cuidado de que no
llegue a hervir ya que se produciría la destrucción de las células.

6. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se realiza
inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de
manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él,
pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la máxima cantidad de agua
de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la superficie de la
mesa de trabajo.
7. Secar el porta: en ningún caso se debe frotar el porta.

8. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento. Si se

quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersión.

MONTAJE DEFINITIVO DE LA PREPARACIÓN

La técnica siguiente es de aplicación para cualquier preparación microscópica que se

desee montar de forma definitiva. Se anotará en un extremo del portaobjetos el
contenido de la preparación, la fecha y, en su caso, el nombre del alumno.

9. Pasar sucesivamente los portaobjetos por las siguientes soluciones manteniéndolos

un mínimo de 5 minutos en cada baño. La serie de alcoholes puede modificarse en
función de la disponibilidad de los reactivos, pero el objetivo es que la preparación
quede totalmente deshidratada. Escurrir bien el reactivo antes de introducirlo en el
siguiente baño.

a Alcohol de 70º

b Alcohol de 95º

c Acetona pura

d Acetona-xilol (1:1)

e Xilol

Montar la preparación. Emplear bálsamo de Canadá, euparal o algún medio de montaje

sintético. Utilizar preferiblemente cubreobjetos