MICROBIOLOGÍA

AMBIENTAL

GUÍA DE PRÁCTICA N° 5
CULTIVO DE MICRORGANISMOS

ALUMNO (A): Mayerly Esther Jaramillo Mori

FECHA: 27/10/2022

1. Objetivo
• Adquirir conocimientos básicos teóricos y prácticos de la siembra y aislamiento de
bacterias.

2. Generalidades
En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos
complejas. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos
que dependerán del tipo de microorganismo y del período de tiempo de conservación
que se requiera. Para ello existen técnicas de siembra, conservación y mantenimiento de
los cultivos microbianos.
Una técnica esencial en Microbiología es la de obtención de cultivos puros, a partir de
los cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. Un
cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para poder
obtenerlo es necesario concurrir a las técnicas conocidas como aislamiento.

3. Fundamento Teórico
3.1. Siembra de microorganismos
Gracias a la aplicación de los medios de cultivo, se ha llegado a conocer ampliamente
el comportamiento cultural y fisiológico de la variada flora microbiana que pulula en
los ambientes, permitiéndose la identificación específica. Para ello es necesario
considerar la metodología que conduzca a la exacta determinación de la especie en el
laboratorio.

3.2. Concepto de Siembra

Acondicionamiento de un microorganismo en un medio de cultivo, de acuerdo a sus
exigencias vitales, para que, en condiciones óptimas de temperatura y tiempo de
incubación, pueda desarrollar y multiplicarse in vitro.
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Para ello una pequeña porción de cultivo o muestra, que se denomina inóculo se
transfiere al medio con precauciones especiales de asepsia a fin de evitar la introducción
de otros microorganismos ajenos al inóculo. El conjunto de pasos a efectuar para lograr
una siembra correcta, se conoce como técnica aséptica.

La toma del inóculo es simple, pero se requiere tener en cuenta lo siguiente:

• La siembra siempre debe realizarse al abrigo de las corrientes de aire (cerrar bien
puertas y ventanas), con movimientos pausados, poco amplios, sin brusquedad
y sin hablar.
• Coloque frente a usted el mechero y la preparación o muestra que contiene los
microorganismos, así como el resto del material necesario (portaobjetos, tubos,
placas).
• Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad y sin tropiezos.
• Se debe trabajar a una distancia no mayor de 15 cm. de la llama de un mechero.
• El asa o aguja de siembra se esteriliza por llameado directo (flaméelo hasta que
alcance un rojo incandescente) y antes de retirar el inóculo debe facilitarse su
enfriamiento, a fin de evitar el deterioro del material a sembrar (enfríelo en la
proximidad de la llama unos 10 segundos).
• Una vez realizada la siembra se esteriliza nuevamente el asa o aguja a la llama
del mechero antes de depositarla sobre la mesada de trabajo.
• Nunca debe depositarse un tapón sobre la mesada o gradilla, pues estos
elementos están cargados de microorganismos.
• Cuando esté destapado, mantener el tubo en la forma más horizontal posible para
evitar que los microorganismos del ambiente, en su caída, tengan acceso al
interior.
• Las bocas de los tubos de donde se toman los cultivos y la de aquellos a donde
serán transferidos, deben pasarse ligeramente sobre la llama inmediatamente
antes de que el asa o aguja sea introducida (Figura 1). También se debe flamear
la boca del tubo antes de taparlo. Este procedimiento fija al vidrio los
microorganismos que pueden estar en dicha boca y tiende a crear corrientes hacia
afuera (el aire tiende a salir), disminuyendo así el riesgo de contaminación.
• Para retirar el inóculo o sembrar medios de cultivos en cajas de Petri, coloque la
placa invertida sobre la mesada de trabajo y levante la parte que contiene el
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medio de cultivo con los microorganismos. Llévela a la proximidad de la llama

del mechero y tome el inóculo con el asa de siembra. Otro método permitido
consiste en retirar el inóculo o sembrar, levantando la tapa solo lo suficiente para
permitir la introducción del asa o aguja, para evitar que los microorganismos
ambientales se depositen en la superficie del medio.
• Si la siembra se realiza con pipeta, ésta debe estar convenientemente preparada
y esterilizada hasta el momento de su empleo. Una vez utilizada se descarta
introduciéndola en una solución antiséptica.
• Transfiera el inóculo a otro medio de cultivo estéril, tomando las mismas
precauciones en su manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en la
proximidad de la llama, etc.)

La finalidad de una siembra puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento:

a) para hacer un trasplante o transferencia: Se efectúa con cultivos puros (una sola
especie bacteriana), ya sea con el objeto de renovar el medio de cultivo para perpetuar
la especie, o bien para conocer alguna de sus propiedades culturales o bioquímicas.
b) para hacer un aislamiento: El aislamiento, en cambio, se realiza a partir de un
material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para
obtener cultivos puros.

3.2.1. Toma del Inóculo

Si la muestra proviene de un medio líquido, el inóculo se toma agitando el suavemente
el asa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensión superficial en el
extremo del filamento del asa de siembra.
Si el medio es sólido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (caja de Petri),
tome una pequeña porción de cultivo mediante un ligero roce con el asa de siembra. Si
la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de flauta),
hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequeña porción de la misma.
Flamee la boca del tubo antes de taparlo y colóquelo en el soporte necesario.

4. Transferencia
La técnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo
de recipiente que los contiene. Se pueden presentar los siguientes casos:
(a) Siembra de medio líquido a medio líquido: El procedimiento se puede realizar con
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asa en anillo, aguja o pipeta y en tubos de ensayo, matraces o frascos.

(b) Siembra de medio sólido a medio líquido: El procedimiento se puede realizar con
asa en anillo o aguja y en tubo de ensayo, matraces o frascos.
(c) Siembra de medio sólido a medio sólido: El procedimiento se puede realizar con asa
o aguja y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en caja de Petri, en
superficie.
(d) Siembra de medio líquido a medio sólido: El procedimiento se puede realizar con
asa en anillo, aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad
o en caja de Petri, ya sea en superficie o por homogenización.

5. MÉTODOS DE AISLAMIENTO EN PLACA

A.- Aislamiento por el método de estriado
El método de estrías en placa es el procedimiento clásico para aislar cepas de bacterias.
Este método consiste en la separación de un determinado microorganismo del resto de
microorganismos que le acompañan. Estriar para aislar implica una sola inoculación de
una sección de la placa de Petri y a continuación, disminuir la colonia arrastrando
microorganismos de la sección inicial a dos o tres secciones adicionales, achicando
eficazmente la población de microorganismos. Generalmente es utilizado para separar
un cultivo mixto de bacterias.

a) Estría Simple: Esta técnica es ampliamente utilizado para la visualización de ciertas

propiedades metabólicas tales como la producción de enzimas hidrolíticas (a través de
la hidrólisis de las sustancias - yema de huevo, sangre) y la producción de pigmento.
Técnica 1: Transferir una asada al medio sólido de placa de cultivo y estriar en forma
de zig-zag en toda la placa.

Figura 1. Estría simple, técnica 1

Técnica 2: Se divide la placa Petri por la mitad. Colocamos el inóculo en el extremo de

la placa y sembramos en forma de zigzag decreciente, luego se esteriliza el asa al
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mechero. Nuevamente tomamos el inóculo y lo sembramos de la misma manera en la

otra mitad de la placa. Se puede diferenciar la forma y el color de colonias.

Figura 2. Estría simple, técnica 2

b) Estriar para aislar

Estriar para aislar implica una sola inoculación de una sección de la placa de Petri y a
continuación, disminuir la colonia arrastrando microorganismos de la sección inicial de
dos o tres secciones adicionales, achicando eficazmente la población de
microorganismos. Generalmente utilizado para separar un cultivo mixto de las bacterias,
los bacteriólogos también utilizan este método para aislar una línea de bacterias que
nacen de un solo progenitor.
Estría en T: Se dibuja una T en la placa y se procede a estriar en 3 cuadrantes (A, B,
C)

Figura 3. Estría en T
c) Estriado por agotamiento sobre cuatro cuadrantes
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Este es también un método de estriado para el aislamiento, pero utiliza cuatro secciones
en lugar de tres. Divide la placa de Petri en cuatro partes iguales con un marcador
permanente.
Consiste en sembrar uno a uno los cuadrantes, sin flamear el asa entre estría y estría, de
tal forma que, en el cuarto cuadrante, al ir agotando la muestra del asa, tendremos los
microorganismos aislados. Objetivo: obtener colonias aisladas.
Es importante no volver a repasar el cuadrante que ya hemos sembrado. Para conseguir
que al final de la estría tengamos colonias aisladas
Es importante no cruzar las estrías (no tocar con el asa la estría anterior) para reducir el
inóculo a cada estría y obtener colonias aisladas. Puede, alternativamente, flamear el asa
al terminar cada cuadrante y tocar la punta del asa la última estría anterior para
arrastrando un pequeño inóculo a la siguiente estría.
También es importante que en los primeros cuadrantes hagamos la estría más junta y
que la cantidad de muestra tomada en el asa sea la adecuada, y que en los últimos dos
cuadrantes hagamos las estrías más separadas.

Figura 4. Estriado por agotamiento sobre cuatro cuadrantes

B.- Aislamiento por diseminación
El método de aislamiento por diseminación en placa es un procedimiento en el cual el
investigador coloca una muestra diluida sobre una superficie de agar estéril en una placa
de Petri, y disemina uniformemente la mezcla diluida de células sobre una superficie de
agar, utilizando una varilla doblada de vidrio (Asa de Digralsky), esterilizada. Los
cultivos son incubados por un periodo de tiempo específico. Y posteriormente, en el
medio sólido aparece un crecimiento macroscópicamente visible esto se debe a que cada
célula forma una colonia separada, por lo tanto, cada colonia representa un cultivo puro.
Luego de que las colonias han crecido, son contadas y se calcula el número de bacterias
en la muestra original.
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Figura 5. Técnica de aislamiento de diseminación

C.- Aislamiento por Difusión
El procedimiento de placa vertida se utiliza extensivamente con bacterias y hongos y
también puede producir colonias aisladas. Se prepara una muestra bacteriológica
diluida. El investigador introduce una pequeña cantidad de muestra dentro de una placa
petri vacía. Se vierte agar derretido o fundido dentro de la placa petri que contiene la
muestra. El agar y la muestra se mezclan meticulosamente al tapar la placa y realizar
giros suaves sobre la mesa. Se le da tiempo para que el agar se vuelva gel mientras se
asienta sobre la superficie plana. Finalmente, las placas se invierten y se dejan incubar
por un periodo de tiempo específico. Las colonias son luego observadas y contadas, y
se registra la información.

Figura 6. Técnica de aislamiento por difusión

6. MÉTODOS DE SIEMBRA EN TUBO

Estriado en tubos de ensayo
Siembra en tubos de cultivo con medio sólido:
Las siembras en tubos con medio sólido, por lo general se emplean para la conservación
de un cultivo puro proveniente de una placa o para la siembra de pruebas bioquímicas.
El pico del tubo del medio con agar se inocula por punción (cuando es necesario), o por
una estría en el pico del tubo desde el fondo a la parte superior con un movimiento en
“S” a medida que se retira el asa.
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Figura 7. Siembra en tubos

7. Criterios para la diferenciación de colonias

El aspecto de las colonias, su coloración, tamaño, etc. permiten diferenciar diferentes
bacterias, aunque son propiedades generales muy influenciadas por las condiciones de
cultivo, por lo que a continuación se realiza una descripción muy general. Las colonias
pueden ser opacas, translucidas o transparentes.
Algunas producen pigmentos fluorescentes cuando se iluminan con luz ultravioleta. Otras
aparecen con superficie pulverulenta, otras son lisas, o rugosas, o poseen anillos
concéntricos. En ocasiones el olor es también característico.

Estudio de la morfología de la colonia

Cuando se cultivan los microorganismos sobre medios de cultivo sólidos, las células
aisladas se multiplican sucesivamente hasta dar un crecimiento visible conocido con el
nombre de colonia, las características de estas colonias son estudiadas y se usan en la
identificación de las especies.
Las características que se le estudian a las colonias son: Forma, elevación, margen,
superficie, color.
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Figura 8. Morfología de colonias

8. Materiales para práctica en laboratorio

Describa los materiales, insumos, equipos y servicios utilizados en el desarrollo de
la práctica:
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9. Procedimiento
Describa detalladamente el procedimiento realizado en laboratorio.
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10. Resultados
Adjuntar fotografía de su siembra en laboratorio
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11. Cuestionario
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8. Referencias Bibliográficas
Luna, F. (2012). Manual de prácticas de laboratorio de Microbiología. Editorial
Unimagdalena.
Lynch, M.J. (1972). Métodos de Laboratorio 2ª. Ed. México: Editorial Interamericana.
Madigan, M., Martinko, G., Parker, J. (2004). Biología de los Microorganismos. Ed.
Pretice Hall. 8ª edición.
Prescott, L.M. (2004). Microbiología (5ª ed.). Madrid: Mc Graw Hill. Disponible en
Biblioteca UC: 616.01 / P85 2004)
Thomson, R., & Miller, J. (2003). Specimen collection, transport, and processing:
bacteriology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R.
H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for
Microbiology, Washington, D.C.
Tortora, G., Funke, B., Case, C. (2004). Microbiology an introduction. 8th ed. San
Francisco: Benjamin Cummings.
Wistreich, G., & Lechtman, M. (1983). Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed.
Limusa México.