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I.

INTRODUCCION

En la naturaleza la mayora de los microorganismos no se encuentran aislados,
sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos
microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y
trabajar con especies aisladas. Obteniendo cultivos axnicos o puros.
Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene un solo tipo de
microorganismo y que procede generalmente de una sola clula; el crecimiento
de esta origina, en medio slido, una masa de clulas fcilmente visible que
recibe el nombre de colonia.
En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones
mixtas con otros tipos de microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se
llaman por ello cultivos mixtos. Sin embargo, el conocimiento de los
microorganismos se consigue mediante el estudio de cepas aisladas,
cultivadas en el laboratorio en cultivos puros(o axnicos). En ocasiones el
estudio molecular. Conduce a la caracterizacin de los microorganismos, an
en poblaciones mixtas. Sin embargo la identificacin bacteriana y la
caracterizacin completa solo son posibles tras el aislamiento de la bacteria y
la obtencin de cultivos puros. Por ello el primer problema al estudiar una
bacteria es su aislamiento del resto de los microorganismos presentes (en una
muestra patolgica, de agua, de suelo, de alimentos, etc.). Una vez que se ha
logrado el aislamiento es posible obtener la bacteria de inters en cultivo puro.
II. OBJETIVOS

Aislar un microorganismo de una mezcla de varios (suelos, vegetales y
alimentos en descomposicin, etc.).
Obtencin de cultivos puros de microorganismos a partir de un cultivo
mixto, mediante estra en medio slido.

III. MARCO TEORICO

En la naturaleza, la mayora de
los microorganismos no se
encuentran aislados, sino
integrados en poblaciones
mixtas. Para llevar a cabo el
estudio de estos
microorganismos y de sus
propiedades, es necesario
separar unos de otros y trabajar
con especies aisladas,
obteniendo cultivos axnicos o puros. Un cultivo axnico o puro es aquel que
contiene un slo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una
sola clula; el crecimiento de sta origina, en medio slido, una masa de
clulas fcilmente visible que recibe el nombre de colonia. Para obtener
cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin microbiana mixta, se
utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas
durante el siglo XIX.
En un principio, Lister utiliz diluciones seriadas en medio lquido con esta
finalidad, pero la presencia de contaminacin, es decir, de microorganismos no
deseados, dificult el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los
medios slidos, complementados con agar, y las placas de Petri en
Bacteriologa, permitiendo as la separacin fsica de las colonias sobre la
superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las
colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas.

Tcnicas:

1) Aislamiento por el mtodo del estriado:
Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del
cultivo de microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la
superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estras muy juntas, pero
sin hacer presin para no daar el agar.
Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada
previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas
estras. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al
comienzo de las sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la
temperatura adecuada, siempre en posicin invertida.
Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra
que contenga un elevado nmero de bacterias.

2) Aislamiento por el diseminacin:
Para esto sobre la superficie del medio previamente vertido y solidificado 0,1m
L del inoculo, el que se extiende uniformemente sobre la superficie del medio
utilizando una varilla de vidrio esterilizada. Esta tcnica permite el crecimiento
de todas las colonias sobre la superficie del medio y evita el contacto de las
clulas con el agar fundido.

3) Aislamiento por difusin (disoluciones seriadas):
Cuando se realiza un recuento en placa es importante que crezca solo un
nmero limitado de colonias en la placa porque si hay demasiadas colonias en
la placa algunas clulas se encuentran apiadas y no pueden desarrollarse.
Esta tcnica se utiliza en anlisis cuantitativos bacterianos. La convencin de
la FOOD AND DRUG ADMINISTRATION delos EE.UU. Dice que se cuenten
solo placas con 25 a 250 colonias.
Se inocula 1.0m L o 0.1m L de diluciones de la suspensin bacteriana en una
placa Petri. El medio nutritivo, en el que el agar se mantiene lquido en un bao
de agua a cerca de 45-50 C, se vierte sobre la muestra, que luego se mezcla
en el medio con una agitacin suave de la placa. Cuando el agar se solidifica la
placa se incuba. Con esta tcnica las colonias crecern dentro del agar
nutritivo (a partir de las clulas en suspensin en el medio cuando el agar
solidifica) as como en la superficie del agar.
Esta tcnica tiene algunos inconvenientes porque ciertos microrganismos
relativamente sensibles el calor pueden resultar daados por el agar fundido y
ser incapaces de formar colonias.


IV. MATERIALES



Cultivos de microorganismos
(planta piloto)
Medio de cultivo agar comn y
agar Sabouraud
Muestras de bacterias Agua destilada
Mechero de alcohol

Asa de siembra
V. PROCEDIMIENTO
























PLANTA
PILOTO
(10 minutos)
Como muestra se utiliz los cultivos del agar comn y agar
Sabouraud.
Estas se llevaron a la planta piloto, y fueron expuestas a este
ambiente para luego notar la presencia de bacterias.
En las mismas placas del agar se sembr E. Coli y
Sacaromisa.
AGAR COMUN AGAR SABOURAUD

























Coloque 0.1 ml dela muestra bacteriana y depositar en la parte
superior de la placa.
Con el asa de siembra se distribuye el inoculo por toda la
superficie del medio; hasta que est completamente seco.
Finalmente incubar la placa a 37C durante 24 horas.
VI. RESULTADOS

En la siembra a partir de una bacteria se formara una colonia.
Incubacin y observacin: se llevan las placas a incubar a 37C
(temperatura corporal), durante 24 h. tras este periodo se recogen las
placas y sin abrir se observa el crecimiento bacteriano.




























j
AGAR COMUN: se sembr Sacaromisa y E.
Coli notndose caractersticas muy
marcadas como la forma circular de estas.
Aqu se aprecia la presencia de bacterias
pero en menor cantidad.
AGAR SABOURAUD: en este se aprecia
mejor la formacin de colonias sobre las
placas de agar. Las bacterias presentes
son en forma de zigzag.
DISCUSIONES

1. (Garca Martos, 1994) El caldo nutritivo favorece mucho el desarrollo y
multiplicacin de las bacterias porque al difundirse estas por todo el medio
encuentran con facilidad las sustancias que necesitan para nutrirse. Si
aparece turbidez hay crecimiento.
2. (Negroni Marta.2005) El medio de cultivo; agar nutritivo, puede dejarse
solidificar con el tubo inclinado para obtener una mayor superficie de
siembra (agar inclinado o pico de flauta o slant) o dejarse enfriar con el
tubo en posicin vertical (agar columna). Los medios slidos se utilizan
para aislar e individualizar los distintos tipos de microorganismos presentes
en una muestra.
Al someter a incubacin los tubos a 37C por 24 horas, ya se puede
determinar las caractersticas de crecimiento de la bacteria; por ejemplo la
forma de crecimiento sobre el agar inclinado es filiforme, sobre el caldo
nutritivo se dio la formacin de una pelcula y sobre el agar vertical el
crecimiento es limitado a la lnea de inoculacin.
3. Gerard J. Tortora 2007) El mtodo de siembra por estra en placa funciona
bien cuando el microorganismo que se desea aislar est presente en
grandes cantidades en relacin con la poblacin total. En cambio, cuando
el microorganismo que se desea aislar est presente solo en cantidades
muy pequeas estas deben incrementarse mediante el empleo de un
enriquecimiento selectivo antes de que se lo pueda aislar con el mtodo de
siembra por estra con placa.
4. El mtodo de siembra por estra se hicieron en placas con agar Mac
Conkey y agar manitol. segun Albert Pahissa Berga (2009) El medio
selectivo ms empleado en los laboratorios clnicos para aislar
Staphylococcus aureus es el medio agar sal manitol (medio chapman), que
por su elevado contenido en sal inhibe el crecimiento de la mayora de las
bacterias gramnegativas. Ademas, este medio permite realizar una
identificacin presuntiva basndose en la coloracin amarilla caracterstica
que adquieren las colonias.

CONCLUSIONES

1. Siembra es el proceso mediante el cual se lleva una porcin de una
poblacin de microorganismos (inoculo) de un cultivo bacteriano a un
medio nutritivo para sui crecimiento.
2. Para estudiar una bacteria determinada, es necesario destruir todos
aquellos microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los
instrumento de trabajo.
3. Esterilizacin es el proceso que consiste en conseguir que todos los
microorganismos mueran desde el punto de vista microbiolgico.

BIBLIOGRAFIA

1. Garca Martos, Pedro et al. (1994) Microbiologa clnica prctica. Editorial
Servicio Publicaciones UCA, Cdiz. pp. 52.
2. Negroni, Marta. (2005) Microbiologa Estomatolgica. Fundamentos y gua
prctica.Ed Mdica Panamericana. Buenos Aires.pp.553.
3. Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case (2007) Introduccin a
la microbiologa.Ed Mdica Panamericana. EE.UU.pp.117.

LINKOGRAFIA:
http://www.fagro.edu.uy/~microbiologia/docencia/materiales%20teoricos
/Siembra%20y%20aislamiento.pdf
http://www.buenastareas.com/ensayos/Tecnica-De-Cultivo-De-
Microorganismos/24186858.html
http://bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/HB/CE/PA/ES-PA-
254447.pdf


CUESTIONARIO

1. Mencione dos tipos de siembra y aislamiento bacteriano.
Tcnica A:Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estras
paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa, se quema el
ansa, se enfra, se gira la placa a 90 y se vuelve a estriar tocando 3 o
4 veces el rea sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de la
placa. Por ltimo, sin quemar el ansa, se estra el resto de la superficie
sin sembrar.
Tcnica B: Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estras; se quema el
ansa, se hacen 3 o 4 estras perpendiculares a las anteriores, se
quema el ansa y se repite el procedimiento hasta agotar la superficie de
la placa.
2. Por qu la placa se debe incubar con el medio de cultivo hacia abajo?
Existen varias formas de almacenar las placas de agar, dependiendo de
qu suplementos contengan. Si contienen suplementos sensibles a la
luz, las placas deben guardarse en la oscuridad, envolvindolas en
papel aluminio o dejndolas dentro de un contenedor en el que no entre
luz. Las placas se almacenan siempre en una habitacin fra o en un
refrigerador a 4 C o 39,2 F. El fro evita o minimiza el crecimiento de
contaminantes microbiolgicos no deseados.
Las placas que no se usan son siempre invertidas o apoyadas sobre las
tapas durante el almacenamiento. Esto para evitar la evaporacin si la
placa es almacenada durante perodos prolongados de tiempo, la que
puede afectar las eficiencias del crecimiento bacteriano, o permitir el
crecimiento de organismos indeseados, como el moho.
Una vez que se ha colocado la suspensin de bacterias en la placa, se
debe dejar que se evapore una parte antes de comenzar la incubacin
durante toda la noche. Sin embargo, quedar una cantidad moderada
de humedad. Si la placa no es invertida durante la incubacin, la
bacteria no podr colonizar el agar apropiadamente, lo que evitar que
crezca y forme colonias adecuadamente, o estimular el crecimiento de
otros microorganismos. Cualquiera de estas dos consecuencias
invalidar el experimento. Adems, la condensacin o humedad puede
causar vetas, lo que har que elegir y analizar colonias separadas sea
mucho ms difcil. Una vez que la bacteria ha formado colonias, la
placa tambin debe ser almacenada hacia abajo para mantener los
niveles de humedad.

3. Qu importancia tiene el aspecto de una colonia?

As se puede conocer de manera cualitativa directo del cultivo que
genero bacteriano puede ser, adems los cultivos tienen sustancias
nutritivas pero tambin indicadores (que maneja un pH) con el que
ayuda a reconocer los gneros que crecen en dichos cultivos.
Cuando las bacterias crecen en la superficie de un medio nutritivo
solidificado con agar o gelatina, las clulas que proliferan quedan
prcticamente en posicin fija y forman masas de millones y millones de
clulas observables a simple vista. Las colonias as formadas tienen
dimensiones desde las mnimas apenas visibles hasta masas de varios
milmetros de dimetro. Presentan caractersticas no solo de volumen
sino tambin de forma y textura, y en algunos casos de color que, si
bien hasta cierto punto depende de la naturaleza del medios de cultivo
y de las condiciones de incubacin, en circunstancias establecidas son
constantes y muchas veces de gran valor diferencial. La morfologa de
las colonias constituye una de las caractersticas morfolgicas de las
bacterias indispensables para su aislamiento.
La dimensin de las colonias bacterianas es muy uniforme para cada
especie o tipo. La forma de la colonia depende de su borde y de su
espesor. El borde puede ser liso o irregular, y aserrado en mayor o
menor grado. Cuando el espesor es mucho mayor en el centro y
disminuye uniformemente hacia el borde, se dice que la colonia es
elevada, en ocasiones tanto que casi tiene forma hemiesfrica o puede
ser uniforme.
La consistencia y la textura de la masa de clulas tambin son
caractersticas disitintivas de la morfologa colonial. La pigmentacin es
ms frecuente en las bacterias saprofitas, y la masa celular puede tener
color rojo, anaranjado, amarillo, etc., por la presencia de pigmentos
carotinoides y es verde en caso de algunas bacterias fotosintticas que
contienen bacterioclorina.
Como estas caractersticas ocurren en grados y combinaciones
variables segn los tipos de bacteria, el aspecto de la colonia muchas
veces es plenamente caracterstico y pueden distinguirse tipos de
bacterias entre s en cultivos mixtos o contaminados. Sin embargo, la
diferenciacin por la morfologa de las colonias no solo ha sido
provisional; se necesita un estudio detallado de la fisiologa y las
caractersticas inmunolgicas de una bacteria para identificarlos.

4. Qu le indicara la presencia de un bacilo o un coco en la coloracin de
una suspensin hecha a partir de una colonia?
La presencia de esas bacterias te indica amenos la forma en la que se
encuentran por ejemplo, cuando la bacteria tiene forma esfrica recibe
el nombre de coco y a su forma se la denomina cocoidea; cuando la
bacteria adopta forma cilndrica recibe el nombre de bacilo y a su forma
se le denomina bacilar.La frmula del agar se dise para mejorar la
inhibicin de la proliferacin de la especie, lograr una diferenciacin
ms definitiva de los organismos fermentadores y no fermentadores de
lactosa y alcanzar un crecimiento superior de las bacterias entricas.
En el agar, las peptonas proporcionan los nutrientes. El cristal violeta
inhibe las bacterias gram positivas. La diferenciacin de los
microorganismos entricos se logra mediante la combinacin de lactosa
y el indicador de pH rojo neutro. Se producen colonias incoloras o de
color de rosa a rojo segn la capacidad del aislado para fermentar los
carbohidratos.

5. Porque el medio agar sabouraud, no puede crecer bacterias y en el agar
comn no puede crecer hongos?

Agar Sabouraud es un medio de uso general para el cultivo de
dermatofitos1,2. Hoy en da se utiliza para el aislamiento y cultivo de
todos los hongos3-5. Las peptonas en Agar Sabouraud son fuentes de
factores de crecimiento nitrogenado. La glucosa aporta una fuente de
energa para el crecimiento de microorganismos. La alta concentracin
de glucosa presenta una ventaja para el crecimiento de hongos
(estables osmticamente), mientras que la mayora de las bacterias no
tolera la alta concentracin de azcar. Adems, el bajo pH es ptimo
para los hongos pero no para muchas bacterias3. Agar Sabouraud es
slo levemente selectivo frente a las bacterias.
Las placas de agar pueden ser elaboradas como no selectivas, donde
puede crecer cualquier organismo sin especificacin, o pueden ser
selectivas, donde solo crecen organismos especficos.
4
Esta
especificidad, puede ser por un requerimiento nutricional ( por ejemplo
lactosa como nica fuente de carbono, permitiendo crecer de esta
manera solo microorganismo capaces de metabolizar lactosa), o
agregando antibiticos u otras sustancias con el fin de volver al medio
selectivo. Esto se relaciona con las definiciones de medios definidos e
indefinidos; los medios indefinidos hechos de productos naturales,
contienen una gran variedad de molculas orgnicas, y es ms
permisivo en sentido que provee de nutrientes a una amplia gama de
microorganismos, mientras que los medios definidos pueden ser
precisamente elaborados para seleccionar microorganismos con
propiedades especficas. Las placas e agar, tambin actan como
indicadores, donde los organismos no son seleccionados en base al
crecimiento, sino por un cambio de color en algunas colonias,
generalmente causada por la accin de una enzima del
microorganismo, sobre un componente del medio