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MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
INFORME
Preparado por:
YULEIS CASTRO
Código:
ANGÉLICA PATRICIA GONZÁLEZ BERNAL.
Código: 35355132
KELLY MARTINEZ
Código:
LEIDY JOHANNA ORTIZ ORTIZ
Código: 1102718712
OMAR
Presentado a:
MARIA FERNANDA DOMÍNGUEZ
INGENIERIA AMBIENTAL
BUCARAMANGA, COLOMBIA
2014
PRACTICA 01. METODOS DE SIEMBRA
INTRODUCCIÓN
En este laboratorio se emplearon agares con papa para cultivo de hongos provenientes
de estado de descomposición de fresas, papaya y pan, además se contó con agares de
glucosa para las bacterias que fueron tomadas de una muestra de agua contaminada,
se empleó la técnica de siembra en estría en placa, se dejó a 37 ºC por algunos días.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Sistemas de Siembra
Marque correctamente los tubos con el número del grupo, sistema de siembra
utilizado y la fecha.
[1]
Sánchez, M. (2012). Medios de cultivo y métodos de siembra. Recuperado 20-04-14
de http://www.slideshare.net/tmfvidal/medios-de-cultivo-mtodos-de-siembra
Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee
la boca del tubo.
Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del
cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tápelo y déjelo en una gradilla.
Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Esterilice el asa en el mechero
después de usarla. Incube los tubos a 37ºC por 24 horas. Observar el crecimiento
obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda transparente. [1]
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/fig/fig31
9.jpg
Siembra en rejilla. Realice una estría que atraviese el centro del agar.
Luego realice estrías en ángulo recto con respecto a la estría inicial.
Voltee el agar en ángulo de 90 grados y realice estría hasta cubrir todo
el agar.
Tomado
de: http://www.umce.cl/delgenalaproteina/modulos/modulo04/modulo04_clip_image006.jpg
º Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur
plástica, transfiera 1 ml de éste cultivo a la base de la caja de petri estéril.
Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox.
º Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego realice
movimientos suaves sobre el mesón, en el sentido de las agujas del reloj, luego
al contrario, en forma de L y L invertida, y por último en forma de 8. Esto garantiza
una distribución homogénea de las bacterias en todo el agar para facilitar su
posterior recuento.
º Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar, márquelos
con el número de grupo, la fecha. Luego incube 37º c por 48 horas.
MATERIALES
1. Muestra contaminada con microorganismos
2. Agua peptonada al 0,1% estéril
3. Agar nutritivo en caja de Petri
4. Asa redonda
5. Gradilla
6. Mechero
7. Incubadora
8. Vinipel
9. Marcador de vidrio
Luego con la mano izquierda se abre la caja de Petri con preparación de Triglucosa de
yodo realizar las estrías, se esteriliza el asa cada vez que se hace el extendido.
Para terminar se marcan las cajas Petri en el borde de la base y se envuelven con papel
vinipel, después se disponen boca abajo a 37ºC. Se desinfecta el área de trabajo.
Nota: todo el procedimiento se realiza cerca al mechero con el fin de disminuir el riesgo
de contaminación, se debe además tener los equipos de bioseguridad.
Esterilizar el area
Tomar la muestra
•tubo de ensayo que contiene el agua peptonada
•Homogenizar
Incubación
•Tomar muestra con asa esterilizada
•Tomar caja petri seguir esquema
•Envolver
•Incubar a 37ºC
Tomamos los agares enriquecidos con anterioridad con papa-dextrosa para realizar
cultivos de hongos mediante la técnica de punción.
Se ubica el agar en medio de dos mecheros y tomamos la fruta con la muestra (fresa,
papaya y pan).
Luego se procedió tomar el asa recta que se esteriliza al ponerlo en el mechero hasta
que se pone roja, se deja enfriar un poco, luego se toma una muestra pequeña del hongo
que se encontraba en cada uno de los alimentos ya mencionado y esta es llevaba al
agar para la siembra, posteriormente se esterilizaba el asa y nueva mente se hace el
procedimiento mencionado anteriormente por 3 veces, formando un triángulo con cada
punción en el agar seleccionado.
Seguidamente se marca el cultivo y se envuelve con vinipel, se dejan a temperatura
ambiente para la producción de colonias para su posterior observación. Este mismo
procedimiento se repite para cada muestra, es decir, fresa, papaya y pan.
Selección
• Muestras a utilizar
• Agar enriquecido para (hongos)
Esterilización
• Area de trabajo
• Asa recta
Siembra
• Tomar uan pequeña cantidad de hongo
• Depositarlo haciendo un punto con la asa en el agar
• Repetir el procedimiento 3 veces para formar un
RESULTADOS Y ANALISIS.
A pesar de que en los procedimientos de las siembras se llevaron a cabalidad cada uno
de los pasos, resultado de colonias fue cero en los dos métodos empleados porque no
se pudo cumplir con la condición de temperatura todo el tiempo puesto que en las
instalaciones hubo un problema con la energía.
CONCLUSIONES
Por otra parte se puede decir que la siembra de punción es la más idónea a la hora de
elegir un método para cultivo de hongos puesto que su crecimiento es rápido y para
observarlos en el microscopio es mejor que estén aisladas las colonias.
BIBLIOGRAFIA.
Los microorganismos permiten fácilmente el paso de luz a través de sus cuerpos, lo que los hace
transparentes a la vista, a menos que contengan pigmentos que permitan su observación en el
microscopio. Es por ello que debemos teñir a los microorganismos con compuestos que se fijen a sus
estructuras y les confieran color, estos compuestos son los colorantes.
Un colorante es un compuesto orgánico que tiene grupos cromófobos y auxocromos unidos a anillos
bencénicos, conformando lo que se conoce como un cromógeno. Los grupos cromóforos son
radicales que le confieren la propiedad de color a los anillos bencénicos. El auxocromo es un radical
que imparte al compuesto la propiedad de disociación electrolítica, permitiendo con esto la fijación
del compuesto a diferentes materiales.
Para la tinción de las bacterias se pueden utilizar tinciones simples, diferenciales y selectivas. Las
primeras son aquellas en las cuales se utiliza un solo colorante y éste tiñe todo el protoplasma de la
célula, observándose ésta de un solo color uniforme. Las tinciones diferenciales son aquellas en las
cuales se utilizan dos colorantes y generalmente un mordente (compuesto que permite fijar el
colorante a un material) que permiten establecer dos grupos de bacterias, uno que acepta el primer
colorante y otro que acepta el segundo colorante, lo que le da un valor en la clasificación celular
(ejemplo: Tinción de Gram y Tinción de Ziehl Neelsen). Las tinciones selectivas utilizan también dos
colorantes, pero uno de ellos tiene afinidad por ciertas estructuras de la célula, lo que permite su
observación (ejemplo Tinción de esporas, de flagelos, de cápsula, de DNA, etc).
Cuando teñimos una bacteria requerimos hacer un frotis, es decir requerimos colocar una
pequeñísima muestra de una colonia bacteriana o una pequeña gota de un cultivo líquido, sobre un
portaobjetos, extenderla, dejarla secar y fijarla. En este punto podemos teñir a nuestra bacteria y
hacer la observación al microscopio para conocer la morfología que pueden tener los diferentes
organismos.
Debido al tamaño de las bacterias, todas las observaciones se realizan al microscopio con el objetivo
de inmersión.
OBJETIVO GENERAL.
Aplicar los conocimientos adquiridos en el curso para elaborar frotis que permitan una
observación correcta de algunos de los microorganismos que se cultivaron en el laboratorio.
OBJETIVO ESPECIFICOS
MARCO TEORICO
TÉCNICAS DE TINCIÓN
TINCIÓN NEGATIVA:
Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de
este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante
(nigrosina).
TINCIÓN SIMPLE:
Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la
tinción negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de
agrupación de las células. [2]
[3] López, M & Vinasco, M. (2011). Modulo didáctico de microbiología ambiental. Lección 29.
Técnicas de tinción. Universidad Nacional Abierta y a Distancia “Unad”. Bogotá. Recuperado
03-05-2014 de http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201504/contLinea/index.html
TINCIÓN DIFERENCIAL
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes. Se utiliza para
diferenciar la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos.). Esta
tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló
en 1844.
Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, Gram-positivas y Gram-negativas (en este caso, los términos positivo y negativo
no tiene nada que ver con carga eléctrica, sino simplemente designan dos grupos
morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas
tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus
paredes celulares.[3]
MATERIALES
1. Láminas
2. Laminillas
3. Agua destilada estéril
4. Asas bacteriológicas redonda y asa recta
5. Mechero
6. Azul de metileno
7. Cristal violeta
8. Lugol
9. Alcohol cetona
10. Fucsina básica o safranina
11. Tinta china
12. Microscopio óptico
13. Colonias aisladas de bacterias para observación de bacterias
14. Guantes de látex [4]
1. Coloración simple
[5]
Posteriormente se dispone en esta una gota del agua destilada estéril y con una asa
redonda en ambiente estéril se toma una muestra del cultivo bacteriano con ayuda del
asa redonda estéril extender la gota de suspensión a un área no superior a dos
centímetros cuadrados; hecho esto se deja secar la preparación.
[5]
Posteriormente se fija con calor, pasando tres veces seguidas, nuevamente se espera
un tiempo prudente mientras se enfría la lámina.
[5]
Fotografías tomadas en la realización de la práctica el 27-04-2014 en el laboratorio
del CEAD Bucaramanga.
[5]
Una vez terminada esta primera parte se procede a iniciar las coloraciones respectivas,
asi:
Dirigirse con los portaobjetos preparados al vertedero.
Tomar con una pipeta cantidad suficiente de azul de metileno como para cubrir
la suspensión.
Verter el colorante sobre el preparado.
[5]
Dejarlo fijar por 5 minutos, eliminar el colorante lavando con agua suavemente.
[5]
Disponer una gota del agua destilada estéril o una gota del cultivo bacteriano (portaobjetos)
Lavar
Secar y observar
2. Coloración compuesta
Por último se escurre el exceso de agua, deja secar y se monta al microscopio para
hacer las observaciones respectivas.
DIAGRAMA DE FLUJO (Coloración compuesta)
•Lugol (1 min)
Colorante 2
•lavar
•alcohol-acetona (25 s)
decoloración
•Lavar inmediatamente
3. Coloraciones especiales.
En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de agua, otra de tinta china y un poco de
cultivo bacteriano a estudiar. Todo se debe mesclar suavemente y sin extender. Seguidamente
colocar un cubreobjetos sobre la suspensión y presionar suavemente evitando la formación de
burbujas. Observar inmediatamente al microscopio y desechar el material en un recipiente con
antiséptico.
En un portaobjeto se
colocó agua,tinta
china y el cultivo
bacteriiano de E. coli.
BIBLIOGRAFIA