UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

COLORANTES Y COLORACIÓN.

I. INTRODUCCIÓN:

La coloración es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se

absorben a una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las
células de los microorganismos y poder realizar la observación en microscopio
óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el
medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse
claramente sin algún tratamiento previo.

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para

mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas
son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar
estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de
diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser
utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido o
incluso para resaltar organelos dentro de células individuales.

II. OBJETIVOS:

 Aprender a realizar las diferentes coloraciones, con el objetivo de poder

visualizar las paredes y/o formas de bacterias en las muestras
preparadas.

 Utilizar las técnicas sencillas para la observación de microorganismos.

 Conocer el manejo del microscopio óptico para la observación de

bacterias.

 Identificar y reconocer las distintas formas de bacterias que se observa

después de haber realizado la coloración.

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III. MARCO TEORICO:

1. COLORANTE:

Los colorantes son sustancias de origen químico o biológico, generalmente

tintes, pigmentos, reactivos u otros compuestos, empleados en la coloración de
tejidos microorganismos para exámenes microscópicos, debiendo tener al
menos, un grupo cromóforo que le proporcione la propiedad de teñir.

1.1. CLASIFICACIÓN:
Los colorantes se clasifican en naturales y sintéticos.

a. COLORANTES NATURALES:

Los colorantes naturales son básicamente histológicos, encontrándose entre

los empleados con mayor frecuencia, los siguientes:

Índigo: Se obtiene de diversas especies de plantas del genero indigófera que

contiene indican, el cual se fermenta para producir el colorante.

Carmín: Se produce, mediante el tratamiento con alumbre y otras sales

metálicas a hembras del insecto cochinilla "Coccus castis".

Orceína y Tornasol: Se obtiene mediante el procesamiento industrial de

líquenes de los géneros: Le canora tinctoria y Rosella tinctoria.

b. COLORANTES SINTÉTICOS:

Se obtiene de la anilina, o es más exactamente del alquitrán de hulla siendo

todos derivados del benceno. Atendiendo a su estructura química se agrupan
de la siguiente manera:

Los colorantes sintéticos se clasifican, teniendo en cuenta si la propiedad

tintorial se encuentra en el anión o el catión de su estructura química. Sobre
esta base se pueden dividir en tres grupos: básicos, ácidos y neutros.

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 Colorantes básicos:

La acción colorante está a cargo del catión, mientras que el anión no tiene esa
propiedad, por ejemplo: - cloruro de azul de metileno+.

 Colorante ácido:

Sucede todo lo contrario, la sustancia colorante está a cargo del anión,

mientras que el catión no tiene propiedad, por ejemplo: eosinato- de sodio+

 Colorantes neutros:

Están formados simultáneamente por soluciones acuosas de colorantes ácido y

básicos, donde el precipitado resultante, soluble exclusivamente en alcohol,
constituye el colorante neutro, que tiene la propiedad tintorial de sus
componentes ácidos y básicos, por ejemplo: la giemsa.

1.2. MÉTODOS DE COLORACIÓN O TINCIÓN:

A. TINCIÓN SIMPLE

En la tinción simple se utiliza un solo colorante con el que se tiñe rápidamente

el microorganismo, utilizándose fundamentalmente para observar su morfología
y tamaño. Los colorantes empleados con mayor frecuencia para este tipo de
tinción son los siguientes: azul de metileno, violeta cristal y fucsina fenicada,
entre otros.

B. TINCIÓN COMPUESTA:

En este tipo de tinción, se utiliza más de una sustancia tintórea. Los colorantes
se aplican, a la preparación, separados o juntos, formando parte de una
solución. En consecuencia, se puede determinar algunas características
propias de diversos géneros que permiten diferenciarlo de los demás, por lo
que reciben también el nombre de coloraciones diferenciales.

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Entre los métodos más utilizados se encuentran: La coloración de Gram. y la

de Ziehl Neelsen.

B.1. COLORACIÓN DE GRAM:

La tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado para la

visualización de bacterias, se utiliza tanto para poder referirse a la morfología
celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la
diferenciación bacteriana, considerándose bacterias gran positivas a las que se
visualizan de color morado, y bacterias gran negativas a las que se visualizan
de color rosa, rojo o grosella.

Procedimiento:

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1. Preparar un extendido fino del material en estudio y dejarlo secar al aire.

2. Fijar el material al portaobjeto de modo que no sea arrastrado durante el
proceso de tinción, pasando el portaobjeto 3 ó 4 veces por la llama de
un mechero de Bunsen.
3. Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie
con solución de Cristal Violeta por 1 minuto.
4. Pasando el minuto, lavar con agua destilada.
5. Cubrir el preparado con Lugol Gram por 1 minuto. Lavar nuevamente
con agua destilada.
6. Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie
con unas gotas del decolorante: alcohol acetona hasta no arrastrar más
colorante violeta. Esto, requiere habitualmente unos 30 segundos o
menos.
7. Lavar con agua destilada y colocar nuevamente el portaobjeto sobre el
soporte. Cubrir la superficie con Safranina (contracolor), durante un
minuto. Lavar con agua.
8. Colocar el preparado en un soporte de tinción en posición vertical,
dejando que escurra el exceso de agua y que se seque el extendido.
9. Examinar el extendido al microscopio con objetivo de inmersión (100X).

Las bacterias Gram positivas se observan de color azul intenso o violeta. Las
bacterias Gram negativas se observarán de color rojo o rosado.

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B.2. COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN:

La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere de calentamiento para que el

colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el
calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo
cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la
decoloración son de color rojo, sobre un color azul (que lo provee el colorante
de contraste Azul de metileno).

Procedimiento:

Frotis:

 Colocar los frascos con las muestras en orden consecutivo de izquierda

a derecha
 Poner las láminas en la mesa (en este caso dentro de la CSB) y
numerarlas con los números correspondientes a las muestras usando
1/3 de la lámina al reverso (para que al momento de hacer la
decoloración no se borre)
 Abrir el frasco de la muestra de manera firme y lenta.
 Ver el contenido del frasco y obtener la parte más purulenta.
 Con un palillo de madera escoger la porción más
purulenta/sanguinolenta/sólida, no se debe batir demasiado la muestra.
 Extender la muestra en un frotis de una capa no muy gruesa (sobre loso
2/3 de lámina sobrante) sin llegar a los bordes
 Si es necesario, desmenuzar las partículas grandes con las puntas del
palillo de madera quebrado por la mitad
 Desechar el aplicador en un frasco de boca ancha con alcohol o cloro
 Dejar secar el frotis
 Tomar la lámina por el extremo numerado con la muestra hacia arriba,
pasarla tres veces por la llama del mechero para fijar el frotis, dejar
enfriar el frotis (2-3 min.)

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Tinción:

 Cubrir todo el porta-objeto con fucsina filtrada

 Calentar hasta la emisión de vapores (aprox. 5 min.)
 Lavar con agua (poniendo la lámina de una manera inclinada para evitar
barrer la muestra) y escurrir
 Cubrir con solución decolorante durante 2 min.
 Lavar con agua (poniendo la lámina de una manera inclinada para evitar
barrer la muestra) y escurrir
 Cubrir con azul de metileno de 45 seg. -1min.
 Lavar con agua y luego poner en la tabla de secado (para escurrir)

IV. PROCEDIMIENTO DE OBSERVACION DE LA MUESTRA:

Para la realización de esta práctica realizamos la coloración de Gram donde

realizamos diversos pasos, además de utilizar un cierto número de materiales
utilizados para la observación de las muestras de nuestra siembra realiza en la
práctica anterior.

MATERIALES:

- Muestra de las colonias de siembra:

- Laminas porta objetos.
- Microscopio óptico.
- Reactivos.
o Azul de metileno.
o Agua destilada.
o Alcohol acetona.
o Safranina.
o Aceite de cedro.

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PASOS:
 Preparar un extendido fino de la muestra dejarlo secar al aire.

 Fijar el material al portaobjeto de modo que no sea arrastrado durante el

proceso de tinción, pasando el portaobjeto 3 ó 4 veces por la llama de
un mechero de Bunsen.

 Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie

con solución de Cristal Violeta por 1 minuto.

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 Pasando el minuto, lavar con agua destilada.

 Cubrir el preparado con Lugol Gram por 1 minuto. Lavar nuevamente

con agua destilada.

 Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie

con unas gotas del decolorante: alcohol acetona hasta no arrastrar más
colorante violeta. Esto, requiere habitualmente unos 30 segundos o
menos.

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 Lavar con agua destilada y colocar nuevamente el portaobjeto sobre el

soporte. Cubrir la superficie con Safranina (contracolor), durante un
minuto. Lavar con agua.

 Colocar el preparado en un soporte de tinción en posición vertical,

dejando que escurra el exceso de agua y que se seque el extendido.

Examinar el extendido al microscopio con objetivo de inmersión (100X).

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V. RESULTADOS:
En nuestro grupo de practica sobre la observación encontramos una gran
cantidad de bacilos además de cadenas de bacilos:
A continuación, señalare las muestras observadas.

Bacilos

Cadena de bacilos

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BACILOS GRAN NEGATIVOS BACILOS GRAM POSITIVOS

DIPLOCOCOS

VI. CONCLUCIONES:

 Logramos poder realizar la coloración de Gram, para poder observar las

muestras microscópicas.

 Identificamos las formas de bacterias que había en las colonias que

sembramos anteriormente.

 En nuestra muestra encontramos bacilos, diplococos y cadenas de

bacilos.

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 Logramos observar bacterias gram positivas y cadenas bacterias gram

negativas.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

- http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

- http://apuntesytrabajosdemicrobiologia.blogspot.pe/2014/06/tincion-de-
ziehl-neelsen.html

- https://es.slideshare.net/Mardj/prctica-2-tincin-de-gram

- Murray Patrick -2a Edición- 1993. Harcourt Brace- Microbiología Médica.

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- Restrepo Angela, Robledo Jaime. 6a Edición - Corporación

ParaInvestigaciones Biológicas. Fundamentos De Medicina-
Enfermedades Infecciosas

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