Departamento de Biología

Ingeniería Biotecnología
Asignatura Ingeniería Genética
Guias desarrolladas en colaboraicon de:
Dra. Claudia Muñoz, Dr. Felipe Reyes, Dr. Claudio Acuña, Dr. Javier Mena, Dr Kevin Maisey

Práctico 1: Análisis de secuencias y diseño de primers para PCR y RT-PCR

Introducción
Los primers son secuencias cortas de moléculas de ácidos nucléicos (entre
18 a 24 pares de bases) que son utilizados para la amplificación de un gen o un
fragmento de ADN de interés, mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR).
De tal forma que los cebadores o primers, son uno de los principales
ingredientes para una reacción de PCR, y de ellos depende la especificidad, porque
al unirse complementariamente a las dos cadenas de ADN de la secuencia molde,
fijan por así decirlo las coordenadas donde se llevará acabo la reacción.
Para poder obtener un par de primers eficientes, se necesita un análisis
cuidadoso de la región de interés porque hay muchos factores, que pueden influir,
por ejemplo, los primers podrían ser complementarios entre ellos o formar
estructuras secundarias, lo que podría resultar en obtener amplificaciones de
fragmentos no deseados fuera del blanco de la región de interés.
Sin embargo, gracias al diseño asistido por computadora, es relativamente
fácil poder obtener un par de buenos primers.

En este laboratorio verificaremos la identidad de una secuencia incompleta, se

buscará la secuencia del gen completo y su marco de lectura y se diseñarán
partidores para amplificarlo en toda su longitud para su clonamiento y amplificarlo
una pequeña parte para experimentos de RT-PCR.

A) Primers para PCR

La secuencia problema en formato “fasta” es:

>gen8_Covid
ACTCAACATCAACCATATGTAGTTGATGACCCGTGTCCTATTCACTTCTATTCT
AAATGGTATATTAGAGTAGGAGCTAGAAAATCAGCACCTTTAATTGAATTGTGC
GTGGATGAGGCTGGTTCTAAATCACCCATTCAGTACATCGATATCGGTAATTA
TACAGTTTCCTGTTTACCTTTTACAATTAATTGCCAGGAACCTAAATTGGGTAG
TCTTGA

Copie y pegue la secuencia problema en NCBI Blast Nucleotide (blastn)

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

Seleccione la búsqueda usando la base de datos Nucleotide collection

1
Obtendrá una página con todos los resultados coincidentes con su búsqueda

Seleccione alguno de los resultados con mejor Score y mejor e-value (cercano a
cero o un decimal muy pequeño). Haga click sobre el resultado seleccionado y se
abrirá la alineación de la secuencia problema con la secuencia de la base de datos:

2
Haga click en la opción Graphics, se abrirá una ventana con el resultado de la
alineación.

Usted puede desplazar con el cursor y ver la longitud del gen completo.

Posicione el cursor sobre el nombre del gen (orf8). Aparecerá información de la

secuencia tal como la ubicación en el cromosoma y la longitud del gen (360 nt).
Luego haga click en FASTA record.

Fijarse en la direccionalidad de la secuencia, puede estar en la hebra codificante o

en la hebra complementaria.

Obtendremos la secuencia nucleotídica del gen, fijarse que comience con el codón
de inicio ATG y al final tenga el terminador TGA

Si todo está correcto seleccionaremos Pick Primers en el costado derecho de la

página

3
En la herramienta Primer-BLAST aparecerá el código de la secuencia ya ingresado
en la caja de entrada. Usted tiene que especificar el PCR product size, la longitud
mínima de la secuencia deseada y la longitud máxima. Como el gen mide 360 nt,
usted ya sabe los límites necesarios.

En este ejercicio remueva la marca de Specificity check (Enable search for primer
pairs…)

4
Obtendrá una lista de partidores de la cual usted deberá seleccionar el par con
menor índice de complementariedad.

5
Características para elegir partidores para PCR:
Asegurarse que sólo exista un sitio de unión al ADN molde
Poseer un tamaño aproximando de 18 a 24 pares de base
Composición de bases: %GC de 50-60 para evitar regiones ricas en (A+T) y
(C+G)
Evitar tener más de 3 bases GC en los extremos del primer
No exceder una diferencia de Tm mayor de 2 a 3 unidades entre los primers
Preferir valores de Tm entre 55 y 80°C
Minimizar el efecto de estructuras secundarias

Para la amplificación del gen orf8 de virus coronavirus, se usó este par de partidores
Fw 5 CAA CTG TAG CTG CAT TTC ACC 3
Rv 5 ACC CAA TTT AGG TTC CTG GCA 3

B) Partidores para RT-PCR

Repetir el procedimiento anterior de Primer-Blast pero modificar las siguientes
parámetros:

6
Características para elegir partidores para RT-PCR

Tamaño del amplicón entre 90 a 120 nt

Tm de partidores ideal es 60°C
No deben formar estructuras secundarias entre ellos

C) Repita el mismo procedimiento realizado en A y B para el diseño de primers del

gen gfp, cuya secuencia parcial es la siguiente:

>gfp gene
GTTGAATTAGATGGCGATGTTAATGGGCAAAAATTCTCTGTCAGTGGAGAGGG
TGAAGGTGATGCAACATCGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGG
GAAGCTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCA
ATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGC
CATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTACAAAGATGACGGGA
ACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGA
ATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAA
ATGGA ATACAACTATAACTCACATAATGTATACAT

7
Práctico 2: Clonamiento del gen orf8 de COVID y transformación de E. coli

1) INTRODUCCION
Los fragmentos amplificados por PCR presentan la particularidad de tener
incorporado en sus extremos 3' un nucleótido extra de 2’-desoxiadenosina que no
está codificado en la hebra molde. Esto es una propiedad de la Taq DNA
polimerasa y que no la poseen normalmente otras DNA polimerasas.
Para clonar fragmentos de PCR, se utilizan vectores lineales que poseen una
T sobresaliente en sus extremos 3’, complementaria a la A de los fragmentos
amplificados. Existen vectores comerciales, como el vector pGEM-T easy
(Promega) que tienen esta T protuberante y permiten clonar fácilmente fragmentos
de PCR. Estos vectores: a) contienen además el gen de la beta-lactamasa que
confiere resistencia a ampicilina a las células que han incorporado el vector
(marcador de selección) y b) Poseen parte del gen de la -galactosidasa que es
interrumpido por un sitio de múltiple clonamiento (polylinker) lo que permite, en
presencia del inductor sintético del operón lac (IPTG) y el sustrato de la enzima X-
Gal, obtener colonias blancas en vez de azules cuando el vector ha incorporado el
fragmento amplificado (vector recombinante).
Para ligar el fragmento con el vector pGEM-T easy se utilizará la DNA ligasa
del kit que permite ligar extremos romos y cohesivos de manera rápida, ya que se
incuba sólo 10 a 20 minutos en vez de 3 horas como en el caso de las DNA ligasas
menos eficientes.
Para obtener clones recombinantes, la mezcla de ligación se agregará a
células de E. coli que se han sido tratadas para hacerlas competentes (células que
pueden incorporar DNA desde el medio externo). La competencia de E. coli se
obtiene al incubar las bacterias bajo condiciones muy controladas (en hielo) con el
catión bivalente Ca+2 o monovalente como el Rb+1. En principio, estos cationes se
unen a la membrana interna de la bacteria y neutralizan la carga negativa de la
membrana incluyendo las regiones de discontinuidad (zonas de adhesión) que
están presentes en células creciendo en fase exponencial. Con este tratamiento
se evita la repulsión electrostática entre la membrana citoplasmática y las
moléculas de DNA plasmidial, ya que los cationes presentes en la suspensión de
células competentes también neutralizarán las cargas negativas del DNA,
facilitándose la interacción entre ambos componentes. Luego, las células
competentes que han unido el DNA (en frío) son sometidas a un corto shock
térmico a 42ºC, lo que favorece que el DNA penetre al interior de las células.

A) TRABAJO PRÁCTICO

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 - Preparar la mezcla de ligación en condiciones estériles (al lado de la llama de un
mechero) en un volumen final de 10 µL y sobre hielo de la siguiente manera:

Reactivo Muestra Control Positivo Background

Buffer de ligación 5 µL 5 µL 5 µL
pGEM-T Easy 1 µL 1 µL 1 µL
Producto de PCR 2 µL - -
Control Inserto - 2 µL -
T4 ligasa 1 µL 1 µL 1 µL
Agua 1 µL 1 µL 3 µL

NOTA: Para decidir cuántos ng de producto de PCR se deben añadir a la mezcla

de ligación, éste debería estar purificado y cuantificado, de manera que se elige un
ratio de vector:producto de PCR adecuado con la siguiente formula:

𝑛𝑔 𝑑𝑒 𝑣𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑥 𝑡𝑎𝑚𝑎ñ𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡𝑜 (𝑘𝑏)

𝑛𝑔 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡𝑜 = 𝑥 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑣𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟: 𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡𝑜
𝑇𝑎𝑚𝑎ñ𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑣𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 (𝑘𝑏)

Por temas de tiempo, en este práctico asumiremos una relación de 1:2.

- Incubar 1 hora a temperatura ambiente.
- Descongelar 100 µL de células competentes en hielo, agregar los 10 µL de
mezcla de ligación a las células en condiciones estériles (al lado de la llama) y
dejar incubar durante 30 minutos en hielo.
- Incubar las células durante 40 segundos a 42ºC y luego por 5 minutos en hielo.
- Agregar en condiciones estériles a las células transformadas 1 mL de medio LB
e incubar por un tiempo mínimo de 45 minutos a 37ºC para permitir la expresión
del gen de la -lactamasa.
- Centrifugar el cultivo por 5 minutos a 10.000 rpm, descartar el sobrenadante y
resuspender el pellet en el medio LB residual.
- Abrir en condiciones estériles una placa que contiene 100 µg/mL de ampicilina
(los ayudantes se las entregarán), 100 mM de IPTG y 2 mg/mL de X-Gal.
- Sembrar en condiciones estériles 50 l de medio con bacterias y repartir las
células homogéneamente sobre el medio sólido con ayuda de un rastrillo de vidrio.
Adicionalmente se le entregará una placa, la cual dividirá en 2, en una mitad
añadirá 50 l del medio utilizado en la etapa de recuperación y a la otra mitad no

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le añadirá nada, este será su control para verificar que las placas y/o el medio no
se encontraban contaminados.

- Cultivar las bacterias durante toda la noche en una estufa a 37ºC y analizar al día
siguiente si se observa crecimiento de colonias blancas.

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Práctico 3: Identificación de secuencia génica mediante PCR convencional

Introducción
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por su sigla del inglés Polymerase
Chain Reaction) es una técnica molecular descubierta por el excéntrico bioquímico
estadounidense Kary Banks Mullis (28/12/1944 – 07/08/2019), y que le permitió ser
galardonado con el Premio Nobel de Química en 1983. La técnica tiene particular
relevancia debido a que se necesitan cantidades significativas de una muestra de
DNA para los análisis moleculares, genéticos, y genómicos, estudios que serían
casi imposibles de realizar sin la amplificación por PCR. Del mismo modo, la técnica
se ocupa rutinariamente en diagnóstico molecular de patógenos y en pruebas de
paternidad, entre otros.
La PCR se basa en el principio de amplificación de una determinada región del
genoma de un organismo. Para conseguirlo, necesita de una enzima DNA
polimerasa – DNA dependiente (también llamada DdDp por sus siglas del inglés
DNA-dependent DNA polymerase, o simplemente DNA polimerasa) que incorpora
nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la
unión de los cebadores o primers a la hebra de DNA molde. Los análogos
termoestables de la DNA polimerasa I, como la Taq polimerasa, son una opción
ampliamente utilizada para llevar a cabo la PCR. Entre otras razones, tal decisión
se sustenta en su alta resistencia a la alta temperatura en cada uno de los ciclos,
así como a los cambios bruscos de temperatura (delta de casi 40 °C) en fracción de
segundos que debe soportar en su conformación íntegra. Esto es posible gracias a
que la Taq polimersa es una enzima termoestable purificada desde la bacteria
termófila (bacterias que se desarrollan a alta temperatura) Thermophillus aquaticus,
y por la cual se debe su nombre (Taq).
La Taq polimerasa tiene la capacidad de sintetizar una nueva hebra de DNA
mediante la adición de nucleósidos trifosfato (NTPs: dATP, dCTP, dGTP, and dTTP)
siguiendo la composición nucleotídica establecida por la hebra molde de DNA. La
reacción de amplificación se lleva a cabo siguiendo el principio de
complementariedad de bases, de manera que una adenina tendrá
complementariedad por una timina (A=T), y una guanina por una citosina (G≡C), y
viceversa. La PCR requiere de la utilización de dos cebadores (o también llamados
con su término en inglés primers): uno en sentido (o forward) u otro en antisentido
(o reverse). Los primers corresponden a secuencias cortas (idealmente alrededor
de 20 bases) de nucleótidos (por ello también se le llama oligonucleótidos). Tales
primers se desarrollan utilizando bases de datos del genoma que se desea
amplificar, de manera de asegurar su alta especificidad. En el caso que se desee
identificar un patógeno presente en el interior de un determinado organismo,
especial consideración se ha de tener también con el genoma de tal hospedero. Al
momento del diseño de los primers, se debe asegurar minimizar la presencia de

11
posibles estructuras secundarias (loop; hairpin), formación de dímeros
(homo/hetero dímeros), longitud (entre 18-25 bases), y contenido de G/C (entre 40-
60% del contenido total), los que, en su conjunto, interfieren en la obtención y
eficiencia de reacción (generalmente entre 30-40 ciclos de amplificación) para la
obtención del producto deseado.
La actividad de la Taq polimerasa requiere del ion magnesio (Mg2+) como cofactor.
Los iones de magnesio en el sitio activo de la enzima catalizan la formación de
enlaces fosfodiéster entre el 3′-OH del nucleótido presente en el primer y el grupo
fosfato de un dNTP. Además, el Mg2+ facilita la formación del complejo entre los
primers y la hebra de DNA molde al estabilizar las cargas negativas presentes en
los enlaces fosfato.
Generalmente, la etapa inicial de la PCR corresponde a un “Hot start”. Básicamente,
esta etapa corresponde a una fase de activación de la Taq polimerasa al
desprenderla de su inhibidor mediante aplicación de calor (94-95°C x 2-3 min). Entre
sus ventajas, este procedimiento favorece la actividad de la enzima a lo largo de los
30-40 ciclos de reacción, así como también reduce la generación de potenciales
productos inespecíficos previos al inicio de la PCR.
La PCR sigue la fórmula 2n, donde “n” corresponde al número de ciclos. De esta
manera, y asumiendo un 100% de eficiencia de los primers, debería obtenerse 2
copias (21 = 2 copias) en el primer ciclo completo de PCR. En general, una reacción
completa de PCR corresponde a 30-40 ciclos.
Un ciclo de amplificación contiene tres etapas. El paso inicial es la desnaturación y
se realiza habitualmente a una temperatura de 94-98 °C durante 1-3 min. El tiempo
y la temperatura según la naturaleza del DNA molde y las concentraciones de sal
del tampón. Por ejemplo, el DNA genómico de los mamíferos puede requerir
períodos de incubación más largos que los plásmidos y los productos de PCR,
según la complejidad y el tamaño del DNA. De manera similar, un DNA con alto
contenido de GC (p. ej., >65%) a menudo requiere una incubación más prolongada
o una temperatura más alta para la desnaturalización. Por su parte, los tampones
con alto contenido de sales (como lo requieren algunas ADN polimerasas)
generalmente necesitan temperaturas de desnaturación más altas (por ejemplo, 98
°C) para separar el DNA bicatenario.
La segunda etapa corresponde al annealing, en la cual se reduce la temperatura de
reacción para permitir la unión de los primers al DNA objetivo. A menudo, un tiempo
de incubación de 0,5-2 min es suficiente. La temperatura de hibridación entre el
primer y el DNA objetivo se determina calculando la temperatura de fusión (Tm, del
inglés melting temperature) de los primers para la amplificación por PCR. Una
recomendación general es comenzar con una Tm de entre 3-5 °C menor que la Tm
más baja de los primers.

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El tercer paso corresponde a la extensión. Básicamente, consiste en extender el
extremo 3' de los primers ya hibridados en la hebra de DNA. En este paso, la
actividad polimerasa 5′→ 3′ de la ADN polimerasa incorpora dNTP y sintetiza las
cadenas hijas. La temperatura de reacción se eleva hasta la temperatura óptima de
la enzima para su actividad máxima, que generalmente es de 70-75 °C para las
ADN polimerasas termoestables. Si la temperatura de hibridación del primer está
dentro de los 3°C de la temperatura de extensión, tanto la temperatura de
hibridación como la de extensión se pueden combinar en un solo paso llamado PCR
de dos pasos, en lugar de la PCR de tres pasos convencional. La PCR de dos pasos
acorta el tiempo necesario para el proceso de PCR, ya que no es necesario cambiar
ni estabilizar las temperaturas entre el recocido y la extensión. Esta es una
estrategia que se utiliza tradicionalmente en el PCR en tiempo real.
En este práctico, se identificará la presencia de la secuencia correspondiente al
Open Reading Frame (ORF) 8 (ORF8) del genoma de SARS-CoV-2 mediante PCR
convencional. Para ello, se dispondrá de un plásmido de expresión que contiene la
secuencia codificante de ORF8. Para su identificación, se utilizarán primers
previamente diseñados para ORF8 siguiendo las recomendaciones establecidas en
el “Práctico 1”

Procedimiento experimental
Descongelar el tubo que contiene el plásmido de expresión que con la secuencia
codificante de ORF8.
Preparar la mezcla de amplificación por PCR en un tubo Eppendorf de 0.6 mL:
2.5 µL de buffer de amplificación 10X
1.5 µL de MgCl2 50 mM
2.5 µL de dNTPs (2 mM)
1 µL de primer forward ORF8 (10 µM)
1 µL de primer reverse ORF8 (10 µM)
14.5 µL de agua destilada libre de nucleasas
1 µL de plásmido de expresión 1 µg/µL
Volumen final (Vf) = 24 µL
Poner el tubo con la mezcla de reacción en el termociclador, realizar una primera
etapa de 4 minutos a 94ºC (hot start) y agregar 1 µL de Taq DNA polimerasa (Gibco,
BRL) correspondiente a 5 unidades (Vf = 25 µL)

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Realizar 40 ciclos de amplificación (1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC y 1 minuto a
72ºC) y una etapa final de 7 minutos a 72ºC para permitir la elongación de los
fragmentos cuya síntesis haya sido incompleta.
Preparar un gel de agarosa al 1% con Sybr safe.
Tomar un volumen de 10µL de la reacción de PCR, mezclar con 2 µL de buffer de
carga 6 X (como en el práctico anterior) y cargar en un pocillo del gel de agarosa
1%.
Cargar en el primer pocillo del gel de agarosa (ángulo superior izquierdo) 6µL de
estándar de peso molecular (100bp).
Visualizar el fragmento de DNA amplificado en un transiluminador de luz ultravioleta
y guardar un registro fotográfico de su resultado.

Bibliografía
• National Human Genome Research Institute. National Institutes of Health.
Polymerase Chain Reaction. http://www.genome.gov/10000207
• Joseph Sambrook and David Russell. Molecular Cloning: A laboratory manual.
Third edition. 2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
New York. Chapter 8.

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Práctico 4: Purificación de plásmido de expresión mediante lisis alcalina

Introducción
Un plásmido es una molécula de DNA pequeña, circular y de doble cadena que se
diferencia del DNA cromosómico de una célula. El DNA plasmidial (llamado de
ahora en adelante “plásmido”) contiene un origen de replicación y por tanto tiene
capacidad autorreplicativa, de forma natural, mientras que el DNA cromosómico se
replica con el genoma. Por su parte, el DNA cromosómico es vital para el correcto
funcionamiento y reproducción celular. Los plásmidos existen naturalmente en las
células bacterianas y también se encuentran en algunos eucariotas.
La consideración principal para la purificación de plásmidos es la separación del
DNA plasmidial del DNA cromosómico y el RNA celular de la bacteria huésped. Se
han desarrollado varios métodos para generar un lisado aclarado que no solo
elimina proteínas y lípidos, sino que también elimina de manera eficiente el DNA
cromosómico contaminante y deja el plásmido libre en solución. Los métodos para
la preparación de lisados aclarados que se enriquecen con DNA plasmidial incluyen
la lisis alcalina con SDS, la precipitación con SDS con sal, y la ebullición rápida.
El método de lisis alcalina con SDS es un procedimiento popular para purificar
plásmidos debido a su versatilidad y consistencia generales. Originalmente fue
descrito por Birnboim & Doyle (1979) y por Ish-Horowicz & Burke (1981). Esta
estrategia se ha convertido en uno de los más utilizados por su simpleza, bajo coste,
y alta reproducibilidad de la técnica.
Esta técnica aprovecha la diferencia en las características de desnaturación y
renaturación del DNA plasmidial circular cerrado covalentemente y de los
fragmentos de DNA cromosómico. En condiciones alcalinas, tanto el DNA plasmidial
como el cromosómico se desnaturalizan eficazmente. La neutralización rápida con
un tampón con alto contenido de sal, como el acetato de potasio, en presencia de
SDS tiene dos efectos que contribuyen a la eficacia general del método. Primero, la
neutralización rápida hace que el DNA cromosómico se empareje de bases dentro
de la cadena, formando un agregado insoluble que precipita de la solución. La
naturaleza covalentemente cerrada del plásmido circular promueve la rehibridación
entre cadenas, permitiendo que el plásmido permanezca en solución. En segundo
lugar, la sal potásica del SDS es insoluble, por lo que la proteína y el detergente
precipitan y agregan, lo que ayuda a atrapar el DNA cromosómico de alto peso
molecular. La separación del material soluble e insoluble se logra mediante un
método de limpieza (por ejemplo, filtración, limpieza magnética o centrifugación). El
plásmido soluble está listo para ser purificado adicionalmente. Hay varios métodos
disponibles para purificar plásmidos a partir de lisado aclarado. Éstas incluyen unión
del plásmido a la sílice en presencia de altas concentraciones de sales caotrópicas;
precipitación diferencial del plásmido a partir de soluciones acuosas de sal
caotrópica/etanol; Cromatografía de intercambio iónico sobre membranas de

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celulosa modificada con DEAE; precipitación con polietilenglicol extracción orgánica
con fenol.
Para purificar un plásmido con un inserto de interés es fundamental que el cultivo
bacteriano escogido para su replicación provenga de una única colonia
transformada y escogida (tradicionalmente) desde una placa de agar. La colonia
transformada escogida es transferida a un medio de cultivo líquido y en el cual
comienza su replicación (bajo condiciones de idoneidad de crecimiento; esto es, con
agitación, temperatura, y aireación disponible en el matraz de cultivo). El crecimiento
de este cultivo se lleva a cabo hasta que alcanza la fase “log” de crecimiento
bacteriano, para lo cual se realizan mediciones sistemáticas en espectrofotómetro
(A= 600nm). Además, el cultivo bacteriano se realiza en presencia de antibiótico
asegura la selección positiva del clon de interés.

Procedimiento experimental
Día previo al práctico (24 horas de antelación al inicio del práctico): Se seleccionarán
5 colonias fenotípicamente transformadas (colonias blancas) y una colonia no
transformada (colonias azules) con ayuda de un mondadientes (previamente
esterilizado). La colonia seleccionada se crecerá en 2 ml de medio Luria-Bertani
(LB) (Bertani 1951) en presencia de antibiótico fresco (100 µg/ml de ampicilina)
El cultivo bacteriano se centrifugará (1000 rpm x 10 min x temperatura ambiente
(TA)). Resuspender el pellet bacteriano en 100 µl de solución I (50 mM glucosa, 25
mM Tris-HCl pH=8.0, 10 mM EDTA pH=8.0). Agite suavemente por inversión (5-10
veces). Incubar a TA x 5 min.
NOTA: Asegúrese que la solución I se encuentre fría previo a la centrifugación.
Agregue 200 µl de la solución II (0.2 N NaOH, 1% SDS). Agite suavemente por
inversión (5-10 veces). Incubar en hielo x 5 min.
NOTAS:
i) Para maximizar la acción detergente de la solución II, la suspensión
bacteriana resuspendida en solución I y la solución II deben estar a una temperatura
entre 25-37C°.
ii) Nunca agitar vigorosamente luego de agregar la solución II.
iii) La solución de NaOH debe estar recién preparada al momento de su uso.

Agregue 150 µl de solución III (3M acetato de potasio, 2M ácido acético). Agite
suavemente por inversión. Incubar a -20°C x 10 min.
Centrifugar 10.000 rpm x 10 min x TA en la centrífuga para tubos de 1.5 ml.

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Recuperar el sobrenadante y agregue 1 ml de solución fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico (25:24:1). Agite vigorosamente en un vortex (15s).
Centrifugue a 12.000 rpm x 5 min x TA.
Retire la fase acuosa (correspondiente a la fase superior de la solución original) y
transfiera a un tubo nuevo previamene rotulado.
Agregar 2 volúmenes de etanol absoluto frío (-20°C) y deje precipitar -20°C x 1h.
Centrifugue a 12.000 rpm x 10 min. Descarte el sobrenadante.
Lavar el pellet (correspondiente a DNA plasmidial) con 1 ml de etanol al 75%.
Centrifugar 12.000 rpm x 10 min x 4°C.
Resuspender el DNA plasmidial en 30 µl de agua libre de nucleasas, agregar 2 µL
de RNasa A (10 mg/ml), e incube por 30 min x TA para degradar cualquier traza de
RNA presente en la muestra.
Preparar un gel de agarosa al 1% en buffer TAE 1X.
Cargar 10 µl de DNA plasmidial mezclado con 2 µL de buffer de carga 6X, y 6 µl de
estándar de DNA (100bp o similar) con buffer de carga. Realizar una electroforesis
a 90 Volts durante 1 hora.
Observar el resultado de la corrida de electroforesis en un transiluminador de luz
ultravioleta y guardar un registro fotográfico.
Identificar las colonias recombinantes analizando el gel de agarosa.
Bibliografía
• Joseph Sambrook and David Russell. Molecular Cloning: A laboratory
manual. Third edition. 2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York. Chapter 1.
• Birnboim HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 1979 Nov 24;7(6):1513-23. doi:
10.1093/nar/7.6.1513.
• Ish-Horowicz D, Burke JF. Rapid and efficient cosmid cloning. Nucleic Acids
Res. 1981 Jul 10;9(13):2989-98. doi: 10.1093/nar/9.13.2989.
• BERTANI G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by
lysogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 1951 Sep;62(3):293-300. doi:
10.1128/jb.62.3.293-300.1951.

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Práctico 5: Liberación de inserto con enzimas de restricción desde plásmido
recombinante purificado

Introducción
La liberación de inserto con enzimas de restricción es una estrategia rutinaria y
comúnmente utilizada en clonamiento. Para este propósito, se utilizan enzimas de
restricción compatibles con el inserto que permiten el corte del plásmido en las
zonas flanqueantes a la secuencia clonada. Una enzima de restricción es una
proteína aislada de bacterias que escinde secuencias de DNA en sitios específicos
de secuencia, produciendo fragmentos de DNA con una secuencia conocida en
cada extremo. El uso de enzimas de restricción es fundamental para ciertos
métodos de laboratorio, incluida la tecnología del ADN recombinante y la ingeniería
genética.
Los plásmidos (ya sea de clonamiento o de expresión) tienen una región llamada
sitio de múltiple clonamiento (MCS, del inglés multiple cloning site). En su mapa, los
plásmidos ofrecen una amplia gama de enzimas de restricción que hacen posible
(de forma específica) el corte en la región flanqueante de la secuencia clonada (esto
es, río arriba de la región 5’-P, y río debajo de la región 3’-OH de la secuencia
clonada). La liberación del inserto hace posible la confirmación de la presencia del
inserto en el plásmido. La forma más sencilla para confirmar la presencia de un
inserto es mediante determinación estimada del peso molecular del inserto. El
inserto del plásmido visualizado desde el gel de agarosa se puede repurificar tal
banda. Posteriormente, es posible secuenciarlo para confirmar tanto la presencia
del inserto como la secuencia nucleotídica del propio inserto.
En este práctico, se utilizará la enzima NheI y XhoI, ya que el vector pcDNA3.1
posee sitios de corte en el sitio de múltiple clonamiento (ver mapa del vector), y
porque no existe otro sitio de corte para esta enzima en la secuencia nucleotídica
del inserto ni en el plásmido.

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Procedimiento experimental.
Descongelar en hielo cada una de las muestras con plásmidos purificados en la
actividad práctica anterior.
Preparar el mix de reactivos para realizar la digestión:
5 µl de DNA plasmidial (2 µg)
1 µl de buffer 10X para XXXXX (AQUÍ HAY QUE PONER EL BUFFER DE LA
ENZIMA)
2 µl de XXXXX (20 Unidades)
2 µl de agua libre de nucleasas
Volumen final (Vf) = 10 µl
Incubar la solución a 37°C x 1 hora en un incubador termorregulado.
Preparar un gel de agarosa al 1% (p/v) en buffer TAE.

19
Para confirmar la liberación del inserto, agregar en un pocillo del gel de agarosa los
10 µl de solución y agregar 2 µl de buffer de carga. Recordar agregar el estándar
de peso molecular de DNA (100bp o similar) en uno de los pocillos. Esto permitirá
estimar el peso molecular del posible inserto.
Realizar una electroforesis a 90 Volts durante 1 hora. Posteriormente, visualizar la
corrinda en un transiluminador. Sobre la imagen, determinar si la migración de los
plásmidos indica la presencia del inserto.

Bibliografía:
• Joseph Sambrook and David Russell. Molecular Cloning: A laboratory
manual. Third edition. 2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York. Chapter 1.

20
Practica 6. Transfección y expresión en Eucariontes

La transfección es una técnica fundamental en la biotecnología, ya que permite la

introducción controlada de material genético en células eucariontes. Esta
herramienta ha transformado la investigación biomédica y la ingeniería genética al
facilitar el estudio de genes específicos, la producción de proteínas recombinantes
y la modificación de genomas.
En este contexto, la transfección se ha convertido en una herramienta esencial para
comprender mejor la biología celular y molecular, así como para desarrollar terapias
génicas y avanzar en la medicina regenerativa.
Los protocolos y las técnicas varían ampliamente. A grandes los mecanismos de
transfección se pueden clasificar en tres categorías principales:
1. Transfección química o lipofección: En el cual se suelen utilizar lípidos catiónicos,
que se mezclan con el material genético, formando complejos lipídicos que pueden
fusionarse con la membrana celular y liberar los ácidos nucleicos en el citoplasma.
2. Transfección por electroporación: En este enfoque, se aplican pulsos eléctricos
cortos pero intensos a las células, que se encuentran suspendidas en una solución
que contienen el material genético deseado. Estos pulsos eléctricos crean poros
temporales en la membrana celular, permitiendo que los ácidos nucleicos entren en
las células.
3. Transfección por vectores virales: Los virus modificados genéticamente, como los
lentivirus o los adenovirus, pueden utilizarse como vectores para introducir material
genético en las células. Estos vectores virales se han diseñado para ser seguros y
eficientes en la entrega de genes a las células sin causar enfermedades.
Es importante elegir el método de transfección adecuado según el tipo de células
que se estén utilizando y el propósito de la investigación. Cada método tiene sus
ventajas y limitaciones, por lo que es esencial considerar factores como la eficiencia
de transfección, la toxicidad para las células y la capacidad de expresión a largo
plazo al seleccionar el enfoque más apropiado para un experimento específico.
En este trabajo practico, exploraremos los principios básicos de la transfección
enfocándonos en los mecanismos de lipofeccion y electroporacion.

Protocolo Transfección por Electroporación

Materiales:
- Placas 35 mm
- Medio sin suplementar (DMEM)
- Medio suplementado (DMEM)(10%SFB, 1% penicilina y fungizona)

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 - PBS
- Cubeta de electroporación
- Plásmido
- Células
Metodos:
1. Preparar placas de cultivo de 35 mm con 2 mL de medio suplementado
SIN ANTIBIÓTICO. ROTULAR.
2. Agregar a una cubeta de electroporación 300 uL de PBS.
3. Cosechar las células desde una placa de células confluente al 70-80%,
agregando 1mL de tripsina 1X. Resuspender en 1 mL de PBS 1X.
4. Asegurarse que las células queden separadas (confirmar por
microscopio que no haya cúmulos de células).
5. Agregar a la cubeta 200 uL de células y el plásmido correspondiente
(la cantidad de plásmido depende de la línea celular, para HEK293T son 12,5
ug de plásmido).
6. Configurar el electroporador (protocolos preestablecidos>células de
mamifero>293) y transfectar.
7. INMEDITAMENTE verter el contenido de la cubeta en las placas de 35
mm previamente preparadas.
8. Observar 5 hrs después si las células se adhirieron.
9. A las 24 horas se cambia el medio de la placa y se comienza la
selección con el antibiótico correspondiente.
Protocolo Transfección por Lipofectamina 2000
Materiales:
- Opti-mem sin suplementar
- Opti-mem suplementado (10%SFB, 1% penicilina y fungizona)
- PBS 1X
- Placa de cultivo de 24 pocillos
- Lipofectamina 2000
- Plásmido
- Células
- 3 tubos de 1,5 mL
Metodos:
1. EL DÍA ANTES. Sembrar 1,5x 105 células por pocillo en una placa de
24 (deben estar entre 70-90% de confluencia el día de la transfección).
*Preparar dos tubos de 1,5 mL, rotular uno como optimem-lipofectamina y el
segundo como optimem-DNA*

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 2. Agregar 8 uL de lipofectamina a 200 uL de opti-mem sin suplementar.
(TUBO OPTIMEM- LIPOFECTAMINA)
3. Agregar 5 ug del plásmido a 250 uL de opti-mem sin suplementar.
(TUBO OPTIMEM- DNA)
4. Añadir 200 uL del tubo de opti-mem con plásmido al tubo de opti-mem
con lipofectamina y se incuban por 5 minutos a temperatura ambiente.
(SOLUCIÓN LIPOFECTAMINA-DNA)
5. Mientras se incuba la mezcla de DNA con Lipofectamina, se
prepararán las células para transfectar. Para ello se reemplazará el medio de
las células a transfectar, se lavarán con 350 uL de PBS y se añadadirán 500
uL de opti-mem suplementado.
6. Luego de la incubación de la mezcla DNA-Lipofectamina, Se añadirán
50 uL de mezcla por pocillo (agregar suavemente). Luego de agregar agitar
la placa suavemente.
7. CONTROL NEGATIVO: se añaden 50 uL de opti-mem sin suplementar
con 2 uL de lipofectamina a un pocillo.
8. Incubar por 24 a 72 horas a 37°C pCO2 5%.
9. Se cambia el opti-mem por medio suplementado con el antibiótico de
selección correspondiente.
OJO: Este protocolo alcanza para 4 pocillos de tratamiento y 1 pocillo de control en
una placa de 24 pocillos.

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Práctico 7. Detección de células transformadas, citometría.

La Citometría de flujo consiste en el análisis rápido de células en suspensión dentro

de un sistema de flujo laminar, sobre el que incide un haz de luz que proporciona
información acerca de sus características físico-químicas.
Un citómetro de flujo se compone de tres sistemas instrumentales:
Sistema de inyección
Sistema óptico
Sistema informático
1. Sistema de inyección y manejo de la muestra:
Consiste en un mecanismo hidráulico presurizado compuesto por jeringas o bombas
de inyección, conductos y electroválvulas. Este sistema tiene como misión recoger
la muestra, y a través de una corriente de solución salina, conducirla hasta el canal
de flujo, comúnmente formado por un elemento de cuarzo en su centro.
De este modo, al quedar sometida la muestra a una presión envolvente por el
tampón, se induce su flujo hacia el canal capilar de contaje en forma de elementos
alineados sobre los que incidirá la luz del sistema óptico.
La inyección se realiza habitualmente por un sistema volumétrico compuesto de
bomba y jeringa, capaz de inyectar un volumen exacto de la suspensión celular, y
el sistema consta de un contador volumétrico para el recuento de las unidades
celulares que fluyen por el capilar.
2. Sistema óptico:
Según el carácter del haz luminoso, se distinguen dos tipos de citómetro de flujo:
• De lámpara de mercurio
• Multiparamétricos o de luz láser, que han ido
sustituyendo a los anteriores, por sus propiedades de
intensidad, estabilidad y monocromaticidad.
Existen diferentes tipos de láser, el más frecuentemente utilizado es el de ión argón,
que emite a una longitud de onda de 488 nm, también se utiliza de kripton.
Otros elementos de importancia dentro del sistema óptico son las lentes colectoras,
los filtros ópticos, los espejos dicroicos y los fotodetectores.

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3. Unidad informática
En general consta de:
- Diversos amplificadores de señal.
- Un transformador analógico-digital, para convertir los pulsos
electrónicos en información digital.
- Un ordenador de gran capacidad que almacena y analiza
los datos, proporcionando estudios estadísticos y representación gráfica
de los mismos.
Funcionamiento de un citómetro
Tras la introducción del tubo de ensayo con la muestra problema, en la toma de
muestra del citómetro, ésta es succionada por la jeringa conectada a una bomba
hidráulica y mediante canalizaciones, es conducida hasta la cámara de contaje,
donde es envuelta por un fluido salino que rodea a las células alineándolas en su
centro hasta ser atravesadas por el haz de luz.
En ausencia de fluorocromos unidos a los elementos celulares, la incidencia del
láser sobre ellos proporciona dos tipos de señales ópticas en función del ángulo de
recolección de la luz dispersada que realizan dos fotodetectores diferentes.
Los ángulos de medida utilizados son:
Configuración frontal entre 1° y 20°
- Forward scatter (FSC)
- Nos da información del tamaño de la célula.
Configuración lateral a 90°
- Side scatter (SSC)
- Nos da información de la granularidad y rugosidad celular.

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Mediante el análisis de la información proporcionada por la configuración frontal y
lateral de los elementos que fluyen por el citómetro, es posible agruparlos en
distintas clases por tamaño y granularidad, de forma que el instrumento discrimina
entre ellas y es capaz de mostrarlas en diferentes zonas, a mayor FSC más
grandes, a mayor SSC más granulares y complejas. Con lo cual podemos
seleccionar la población que deseamos estudiar (en ventanas).
Por otro lado, cuando van marcadas con un fluorocromo, la señal producida
como consecuencia de la excitación del fluorocromo nos permitirá conocer el
porcentaje de células reconocido por el anticuerpo empleado.
El análisis estadístico de las poblaciones celulares (la total por un lado y la
seleccionada en las ventanas por otro) proporciona el canal medio de fluorescencia
(Mode Channel) en el que se distribuyen FSC y SSC, su desviación típica
y el coeficiente de variación.
Fluorescencia
La fluorescencia es una propiedad de ciertas moléculas (llamada fluorocromos) que,
al ser irradiadas con energía electromagnética de longitud de onda adecuada,
emiten radiación de longitud de onda característica permitiendo su cuantificación.
Las moléculas de un colorante fluorescente absorben luz en una longitud de
onda y convierten la luz absorbida de alta energía (longitud de onda más corta) en
luz de menor energía (longitud de onda más larga). Cada fluorocromo tiene un
espectro de emisión y excitación característico; si se utilizan dos con el mismo
espectro de excitación, pero distinto espectro de emisión, se pueden medir dos
características al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores o a veces de tres).

La inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la detección de anticuerpos que

reconocen antígenos de la superficie de células y tejidos. Para ello se emplean
anticuerpos preparados frente a la proteína que se desea detectar, marcados con
los fluorocromos. Se aprecia si hubo unión del anticuerpo con el antígeno por la

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fluorescencia emitida, antes se observaba bajo microscopio de luz ultravioleta,
hoy en día se hace con el citómetro de flujo.
Existen dos procedimientos:

• Inmunofluorescencia directa
• Inmunofluorescencia indirecta

En la inmunofluorescencia directa se marcan directamente los anticuerpos

necesarios para cada una de las proteínas a investigar. Tiene el inconveniente
de que hay que marcar con fluorocromos cada uno de los anticuerpos necesarios.
Se utiliza fundamentalmente en clínica donde normalmente se utilizan siempre los
mismos anticuerpos, ya que hay establecida una rutina, y las casas comerciales los
venden ya preparados.
En la inmunofluorescencia indirecta no se marca directamente el anticuerpo
específico de la proteína a estudiar, sino que se utiliza secundariamente una
antiinmunoglobulina marcada con fluorocromo, que reconocerá al anticuerpo
específico. Normalmente es el procedimiento a utilizar en investigación, donde se
utilizan muchos y diferentes anticuerpos cada vez, y no interesa marcar cada uno.
El fluorocromo más frecuentemente utilizado en citometría de flujo es el isotiocianato
de fluoresceína (FITC) con una absorción máxima a los 495 nm y emisión a 520
nm (emite luz color verde).
El segundo fluorocromo más utilizado es la ficoeritrina (PE) con una excitación
máxima a los 495 nm y emisión a 576 nm (emite luz color naranja) y es
especialmente útil en estudios de doble fluorescencia.
Los fluorocromos pueden unirse de forma covalente a los anticuerpos sin alterar la
capacidad de estos últimos para unirse a sus correspondientes antígenos. Por ello,
los fluorocromos vinculados a anticuerpos específicos constituyen un medio útil de
visualizar los lugares donde ocurre la reacción antígeno-anticuerpo.
El modo de unión a los anticuerpos depende del tipo de fluorocromo; así, por
ejemplo, el isotiocianato de fluoresceína se liga mediante enlace covalente con
los grupos amino y carboxilo de las proteínas a pH alcalino.

Cultivo y selección y ver por citometria y covers

La citometría de flujo es una técnica utilizada para analizar y clasificar células y
partículas microscópicas de manera rápida y precisa. En este trabajo practico,
exploraremos los conceptos básicos de la citometría de flujo. La citometría de flujo
se ha convertido en una herramienta esencial en áreas como la inmunología, la
oncología, la microbiología y la biología del desarrollo, ya que permite analizar
células individualmente por tamaño, forma y marcadores específicos de cada linaje
celular.
En este practico, utilizaremos la citometría de flujo para confirmar que las células
están expresando el gen transfectado en el trabajo practico anterior.

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Protocolo citometría de flujo
Materiales:
- Medio de cultivo suplementado (DMEM) (10%SFB, 1% penicilina y
fungizona)
- PBS 1X
- Tripsina 1x
- Células transfectadas
- Antibiótico de selección
- Tubos de 15 mL
- tubos de 1,5 mL
métodos:
1. luego de transfectar las células, se deben mantener en una incubadora
con un ambiente húmedo a 37°C, pCO2 5%. Se debe hacer recambio del
medio de cultivo (10 mL) cada vez que sea necesario, este debe estar
suplementado con el antibiótico de selección correspondiente.
2. Para cosechar las células, se debe retirar el medio de cultivo y lavar
con 1 mL de PBS suavemente.
3. Incubar 5 minutos con 1 mL de tripsina 1x a 37°C
4. Cosechar las células y transferir a un tubo de 15mL
5. Añadir 3 mL de medio de cultivo suplementado al tubo de 15mL con
las células
6. Centrifugar las células a 400g durante 5 minutos. Eliminar el
sobrenadante.
7. Resuspender el pellet en 1 mL de PBS y transferir a un tubo de 1,5
mL.
8. contar células
9. Centrifugar las células a 400g durante 5 minutos. Eliminar el
sobrenadante. Y resuspender en 200 µL de PBS.
10. Adquirir las células en el citómetro de flujo, primero con el control
negativo y luego las células transfectadas. Establecer las poblaciones para
analizar. Primero encontrar la población de interés en un grafico de tamaño
(FSC) vs granulosidad o complejidad (SSC).
11. Seleccionen la población de singletes
12. El transgén (eGFP) debe verse en un histograma para el canal de
fluorescencia verde o FL1.
13. Cuantificar la eficiencia de cada método de transfección realizado
(medir porcentaje de células positivas para eGFP).

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