IBT504-5

Procedimientos de Biología Molecular

Nombre: Geoconda Cañizares
Fecha de entrega: 12/12/2018
Resumen 4
Reacción en Cadena de la Polimerasa

La PCR es una técnica que nos permite seleccionar y amplificar un fragmento de ADN de
interés de manera rápida, barata y requiere de un profundo conocimiento; siendo esta una
técnica confiable, sensible y rápida. Desde su origen en el comienzo de los 80 la pcr ha sido
adaptad a un amplio rango de pruebas moleculares incluyendo el secuenciamiento de ADN,
mutagénesis in vitro, detección de mutaciones, clonación de cADN y ADN genómico además de
la tipificación de alelos. La PCR utiliza una variación de temperatura para comenzar y terminar
la síntesis de ADN mediada por una enzima.
La primera etapa es la desnaturalización del molde de ADN mediado por calor, usualmente
mayor a 90 °C. La segunda etapa es el alineamiento de dos primers de oligonucleótidos
sintéticos para la desnaturalización de ADN. Estos tienen de 20 a 25 nucleótidos de largo, son
diseñados con el conocimiento previo del ADN a ser amplificado. Estos dos son
complementarios a las secuencias en lados opuestos a la diana. La distancia que los separa
puede ser desde unos pocos nucleótidos hasta miles, y eso depende de las necesidades del
investigador.
La tercera parte es la extensión donde la síntesis del ADN comienza en el extremo 3 prima de
los primers unidos a la cadena. Esto ocurre a temperaturas de 55 hasta 70 °C en una reacción
enzimática catalizada por la ADN polimerasa termoestable. Este proceso se repite cerca de 25
a 35 veces y toma lugar en un termociclador.
Los productos de la primera ronda de síntesis son dos cadenas de ADN hijas que actúan como
moldes para la siguiente ronda de síntesis de ADN mediada por primers, generando productos
cuya longitud es igual al número de nucleótidos en el sitio 5’ de los dos primers.
Posteriormente la PCR procede con 25 o más ciclos hasta que la concentración del primer o de
los DNTPs es limitada. Las copias de la secuencia diana se duplican durante cada ciclo.
Los componentes esenciales de la PCR son:
ADN polimerasa termoestable. Existe un gran rango de estas que varía en su eficiencia,
fidelidad y habilidad para sintetizar ADN. Generalmente se ocupa la TAQ polimerasa que sigue
siendo la enzima de preferencia.
Un par de oligonucleótidos sintéticos para la síntesis de ADN. Diseñar primers
cuidadosamente es requerido para obtener productos deseados, para evitar la amplificación
de secuencias no deseadas y para facilitar la manipulación del producto amplificado. Los
prinmers influyen directamente en la influencia del resultado del PCR.
Diseño de primer. Composición de las bases: El contenido de guanina y citocina debe ser de un
40 a 60%. Longitud: la región del primer complementario al molde debería ser de 18 a 30
nucleótidos de longitud, los mas pequeños tienen a unirse de manera no específica a molde de
ADN más complejos y los primers mayores a 30 nucleótidos tienden a incrementar la
posibilidad de formar estructuras secundarias.
Estructuras internamente repetidas y complementarias entre sí. se debe tener en cuenta que
el primer no contenga secuencias repetitivas invertidas o complementarias entre si mismas
mayores a 3pb de longitud, ya que estas pueden inhibir el proceso de unión primer-cadena
molde.
Complementariedad entre los primers. la secuencia terminal 3’ de la secuencia del primer
primer no debería ser capaz de unirse a cualquier sitio del otro primer.
Temperatura de melting. La temperatura optima formada entre un primer y sus secuencias
diana es de 55 a 60°C. Esta temperatura esntre ambos primers no debe diferir entre 2 a 3.
Unión GC: La presencia de las GC entre la ultimas 5 bases del extremo 3’ ayudan a promover
una unión fuerte al extremo 3’ de la cadena diana debido al fuerte enlace de puentes de
hidrogeno que tiene G y C.
Adición de sitios de restricción y otras secuencias de importancia al extremo 5’ de los
primers. secuencias útiles no complementarias al ADN que pueden ser añadidas al extremo 5’
de los primers, sin embargo, los sitos de restricción terminales generalmente son cortados por
enzimas de restricción pobremente escogidas, por eso la longitud del primer deberías exceder
en al menos 3 nucleótidos al sitio de restricción.
False Priming. entre sitios homólogos cruzados incrementa el nivel de una amplificación no
específica.
Primers específicos de cDNA. El ADN genómico contaminado causa varios problemas con la
transcriptasa inversa, incluyendo un gran número de falsos positivos.
En ciertas situaciones es deseable amplificar varios segmentos de la cadena diana
simultáneamente, en esos casos es usada una reacción de amplificación llamada multiplex
PCR, la misma que incluye varios pares de primers en el reaction mix.
Las reacciones estándar de la PCR contiene entre 0,1 y 0,5 µmol de cada primer, la cantidad es
suficiente para al menos 30 sitios de amplificación de un segmento de ADN de 1 kb.
Generalmente los primers son modelados en una PCR normal pueden ser usados sin una
purificación, pero al tratarse de análisis genómicos es más eficiente utilizar primers purificados
en cromatografía.
Los DNTPs: una PCR estándar contiene cantidades equimolares de dATP,dTTP, dCTP y dGTP.
Las concentraciones de 200 a 250 µmol son recomendadas para la Taq polimerasa en
reacciones que contengan 1,5 mmol de cloruro de manganeso.
Cationes divalentes: Todas las ADN polimerasas libres requieren para su actividad, algunas
también pueden funcionar eficientemente con iones de magnesio.
Los iones Manganesos tienen dos funciones en la PCR: 1) reaccionar con los dNTPs para
formar complejos que son los sustratos para la Taq polimerasa y estabilizan el primer.
Buffer para mantener el pH: Se usa TRIS-Cl para mantener el pH entre 8,3 y 8,8 a temperatura
ambiente. Se incluyen los PCR convencionales a una concentración entre 10 mmol hasta 66
mmol, al aumentar la temperatura en la PCR el pH se estabiliza en 7,2
Cationes monovalentes: Además el buffer estándar de la PCR contiene 50 mmol de KCl y
funciona muy bien en la amplificación de segmentos de ADN mayor a 500pb, aumenta las
concentraciones de cloruro de potasio de 70 a 100 y mejora el resultado de cadena corta de
ADN.
Cadena molde de ADN: contiene el Target que va a ser añadida a la PCR en su forma singular o
de doble cadena, incluso el ADN circular pude ser amplificado, pero con menor eficiencia. Si
sobrepasa los 10kb la digestión podría mejorarse mediante una enzima d restricción que no
corte la secuencia de interés.
ADN Polimerasa Termoestable: Su vida media es de 9 minutos a 97,5 °C. Puede sintetizar 9000
bases en menos de 10 segundos. Recientemente se ha utilizado una mezcla de ADN
polimerasas de diferentes orígenes han probado aumentar la amplificación de ciertos DNAas
particularmente de cadena larga. Las más usadas son Tbr y la Taq.
Programando reacciones en cadena de la polimerasa
Desnaturalización: la temperatura aplicada de pende de la concentración de G y C; mientras
mayor sea la proporción de estas, mayor es la temperatura requerida y mientras más larga es
la cadena, mas tiempo necesita este proceso.
Temperatura de Annealing de primers: Si la temperatura es muy alta los primers se alinean
escasamente y la distancia amplificada del ADN sería muy corta o incluso se darían
alineamientos no deseados resultado en segmentos de ADN que no se están buscando. El
alineamiento ocurre de 3 a 5° menor a la temperatura de melting. La mejor opción para
optimizar las condiciones de annealing es realizando pcrs de prueba en temperaturas que van
de 2 a 10 C menor a la temperatura de melting de los primers.
Extensión de primers: Como una regla general la extensión se realiza por un minuto por cada
100 pb de producto.
Numero de ciclos: generalmente los productos de amplificación dejan de ser detectables
después de los 30 ciclos, conteniendo de 10 a 5 copias de la secuencia de interés; asumiendo
una eficiencia de 0,7 de la Taq polimerasa.
Componentes opcionales de la PCR
Algunos co-solventes y aditivos han sido probados para incrementar la eficiencia de
amplificación de cadenas ricas en G y C. Estos incluyen la formamida, DMSO, glicerol, betaina,
sulfato de amonio, entre otros.
Inhibidores: casi todo inhibe la PCR si se encuentra en exceso, entre las cuales incluye la
proteinasa K el fenol y el EDTA.
Seleccionar Primers para PCR
1. Analizar el gen de interés por potenciales sitios de priming para que no se produzca
una formación de estructuras secundarias.
2. Calcular la temperatura de melting mediante fórmulas.
3. Utilizar primers forward y reverse que sean similares en el contenido de G y C., que
generen un producto amplificado del mismo tamaño y composición de bases.
4. Redefinir la longitud y el lugar donde se van a localizar los primers tales que en
nucletido terminal del sitio 3’ sea una G o una C.
Detectando, analizando y cuantificando mRNAs
Norther hybridation: utiliza mRNA donde el ensayo se realiza a UARNm y se emplea para
estimar el tamaño del RNAm en diferentes tipos de células o tejidos. Requiriendo gran
cantidad de ARN, este es intensio y necesita de mucho tiempo.
Protección RNAsa: se puede detectar simultáneamente hasta 12 ARNm, se ua para detectar y
cuantificar una cantidad de RNAm en diferentes células y tejidos. Siendo un problema que este
requiera una sonda de hibridación en sentido contrario, usualmente radioactiva.
RT-PCR: generalmente se usa una muestra o varias en un ensayo multiplex, es un método muy
sensible en detectar ARNs incluso aquellos que están presentes en pocas copias en las células.
Se usa generalmente para calcular la abundancia relativa de ARNm.
Una desventaja es que, debido a la gran especificidad de los primers, los resultados falsos
positivos son una posibilidad, el proceso de la retrotranscripción es bastante variable.
qPCR en tiempo real: se utiliza para ARNm y ARNmi, generalmente se aplica un ARN, pero si es
una multiplex, se puede aplicar a muchos, es una técnica bastante sensible y precisa para
detectar el ARN de interés, incluso aquellos que se encuentran en concentraciones bastante
bajas. Esta técnica es más rápido sensible y acertado que cualquier otro método. También se
puede utilizar en análisis de microARNs. Una desventaja es la falta de estandarización en los
protocolos de RT- qPCR, perdiendo confiabilidad y reproductibilidad.