GUIA DE PROBLEMAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

BIOQUÍMICA- AÑO 2016

PROBLEMAS DE CLONADO, TRANSFORMACIÓN, PCR E HIBRIDACIÓN MOLECULAR

1) Se desea clonar en el sitio EcoRI del pUC19 un inserto de 800 pb cortado con la misma
enzima de restricción. Para esto se trata el vector con EcoRI y se realizan las reacciones de
ligación correspondientes. Los resultados de las transformaciones se indican a continuación:

i- mezcla de ligación compuesta por buffer, enzima T4 ADN ligasa, vector cortado (100 ng) y
el inserto (300 ng): 967 colonias azules y 2 blancas.
ii- mezcla de ligación conteniendo buffer, enzima T4 ADN ligasa y sólo vector cortado (100
ng): 962 colonias azules.
iii- vector cortado (100 ng): 914 colonias azules.
iv- vector sin cortar (2 ng): 1200 colonias azules.
v- sin ADN: no se encontraron colonias.

En las placas de Petri (todas conteniendo ampicilina, IPTG y X-Gal) se sembraron 100 µL del
volumen total (1 mL) de células transformadas.
a- Indicar qué controles representan los ítems ii-v y qué información se puede obtener de
cada uno de ellos.
b- Calcular la eficiencia de transformación.
c- ¿Por qué se obtuvieron tantas colonias azules en el ítem i?
d- Se realiza una minipreparación de plásmidos de una colonia azul y de una blanca
obtenidas en la transformación anterior. Los plásmidos son analizados mediante
electroforesis en gel de agarosa, obteniéndose el siguiente resultado:

Col. Col.
Patrón PM azul blanca

4500-

2200-
2000-

- ¿Cómo se explica que la diferencia en la migración de los plásmidos no sea 800 pb?
- ¿Cómo haría para estar seguro de que clonó el inserto correcto?

1
2) Se desea expresar un gen de superóxido dismutasa (SOD) de plantas para aislar suficiente
cantidad de proteína, con el objeto de obtener anticuerpos mediante la inmunización de
conejos. Se dispone de un plásmido que contiene la secuencia de ~1 kb de dicho gen bajo el
control de un promotor de plantas (CaMV35S), insertada en los sitios EcoRI/PstI. Ud. desea
expresar el gen bajo el control de un promotor bacteriano, como una proteína de fusión a fin
de poder purificarla.
A continuación se dan las secuencias de las regiones 5' y 3' del gen sod en donde están
señalados los sitios de restricción y se encuentran subrayados los codones de iniciación y
terminación de la traducción. El número entre paréntesis indica la posición de la base
adyacente.

1kbp
Eco RI

5'
35SCaMV Sma I
Eco RI
3' Pst I

EcoRI
5' AAA CCA GAT CGT GGG AAT TCA ATG ACT ATT (30) ....................

SmaI
(900) CCC GGG CTC CTG CTT CCG CGT GAA ATC CTG ATC CAG AAA GAT

CTG AAT TCG TAA CTG CAG CCC 3'

EcoRI PstI

a- En el laboratorio se dispone de vectores del tipo pGEX. Diseñe una estrategia de clonado
para expresar dicho gen en Escherichia coli y poder purificar la proteína de fusión.
b- Se realiza la transformación con la mezcla de ligación conteniendo pGEX más inserto,
digeridos con las enzimas de restricción que Ud. eligió. ¿De qué manera puede comprobar si
las colonias obtenidas en la transformación tienen el plásmido con inserto? Indique cuáles
de las construcciones obtenidas permitirán expresar la SOD. Exprese los tamaños de los
fragmentos de restricción con números aproximados.

3) Usted desea expresar el gen de la catalasa 2 de cebada como producto de fusión con
polihistidina. Para ello dispone de un cADN de ~1800 pb cuyos extremos presentan las
siguientes secuencias:

2
5' GGCTTAGATGGATCCCTGCAAGTTCTGC--------------- 1800 nt -------------
------------------AGGTCGACGGTAACCGCAGCGCATATAAAAAA 3'

Donde los tripletes subrayados indican los codones de iniciación y terminación,

respectivamente.
a- Diseñe una estrategia de clonado en un vector adecuado, sin emplear PCR.
b- ¿Qué controles debe efectuar sobre el fragmento antes de proceder al clonado?

4) Usted desea clonar un fragmento de 800 pb cortado en un extremo con la enzima BamHI y
en el otro con BglII. Con tal motivo, realiza una ligación del mismo con una determinada
cantidad de vector pUC19 cortado con la enzima BamHI, y transforma células competentes
de E. coli con una alícuota de la mezcla de ligación. Al observar las placas de Petri luego de
incubarlas una noche a 37°C, Ud. descubre que algo no anduvo bien. Como Ud. no se da por
vencido fácilmente, intenta nuevamente el clonado, claro que con algunas modificaciones.
Indique cuál, a su juicio, puede haber sido el problema durante el primer intento, si el
resultado obtenido fue: a) No se obtuvieron colonias. b) Todas las colonias obtenidas eran
azules. c) Todas las colonias obtenidas eran blancas. También eran blancas todas las colonias
obtenidas al utilizar para transformar una ligación control en la que el inserto fue omitido. d)
Ídem (c), otra alternativa. e) Se obtiene una gran cantidad de colonias blancas; también en el
control de transformación al que no se agrega ADN. f) No se obtuvieron colonias. El control
de transformación con plásmido no cortado dio una cantidad adecuada de colonias azules.

5) Usted desea clonar un fragmento de 1 kb proveniente de digerir un clon de cADN con las
enzimas SalI y BamHI. Para ello, efectuó reacciones de ligación utilizando el plásmido
pBluescript KS+ cortado con las mismas enzimas, seguidas de transformación de una cepa
adecuada de E. coli, según se describe:
i- la mitad de la reacción de ligación que contiene buffer, enzima T4 ADN ligasa, 100 ng de
inserto y 20 ng de plásmido.
ii- la mitad de la siguiente reacción de ligación: buffer, enzima T4 ADN ligasa y 20 ng de
plásmido.
iii- 2 ng de plásmido sin cortar.
iv- sin ADN.
La mitad de cada transformación fue sembrada en medio LB con ampicilina, X-gal e IPTG.
Suponga que obtuvo una eficiencia de transformación de 0,9 106 UFC/g de ADN.
a- ¿Qué número de colonias blancas y azules obtendrá en cada placa si el corte con ambas
enzimas tuvo una eficiencia del 100% y sólo un 1% del vector utilizado en la reacción de
ligación se ligó al inserto?
b- Qué habría obtenido (no dé números, sólo indique presencia o ausencia de colonias
azules o blancas en cada placa) si:
b1. La reacción de ligación no funcionó.
b2. Una de las soluciones de transformación estaba contaminada con pGEX-3X.
b3. Las células utilizadas para la transformación habían perdido el F’.
b4. Una de las soluciones de transformación estaba contaminada con pUC119.
b5. El corte con las enzimas de restricción fue poco eficiente.

3
6) Usted desea expresar la ferredoxina plastídica madura utilizando un vector de expresión
que permita su purificación en una única etapa por cromatografía de afinidad.
En el laboratorio donde Ud. trabaja se encuentran disponibles resinas de glutatión-agarosa y
de Ni2+-Sepharosa. El cADN que Ud. posee está clonado en el vector pUC9 en el sitio único
EcoRI. El fragmento, de 542 pb en total, incluye una secuencia 5´ no codificante, un marco
abierto de lectura y un fragmento 3´ no codificante. Las secuencias relevantes se muestran a
continuación:

1 11 21 31 41 51 61
5´ GAATTCATAT TGTTatggtt gggatccagt tcaaacctaa gtttagcctg cagcgcccaC TACTG
71 81 91 101 111
TGTCC CGGGTCGTAG GATCCTGTAG TCGTAGCGAG CTCCCATTGG CTACG--
511 521 531 541
------389 nt------ GTGACT GATGACTAGT CTAAATGTAC TGAATTGAAT TC 3'

Los tripletes subrayados indican los codones de iniciación y terminación, respectivamente, y

el fragmento en minúsculas corresponde al péptido tránsito.
a- Diseñe una estrategia de clonado utilizando los vectores que usted conoce. No utilice
adaptadores ni PCR en la estrategia de clonado.
b- ¿Qué controles debería efectuar sobre el fragmento antes de proceder al clonado?
c- ¿Qué controles debería efectuar para verificar que su clonado fue realizado
correctamente para obtener el producto deseado?

7) Para complementar una mutante en el gen birA de E. coli usted diseña una estrategia de
clonado en la cual se inserta la región codificante del gen birA en el sitio EcoRI del vector
pBluescript SK. Para ello efectúa la reacción de ligación con el vector e inserto digeridos con
dicha enzima. A continuación realiza las siguientes transformaciones con células
competentes de E. coli:

i- la mitad de la siguiente reacción de ligación: buffer, enzima T4 ADN ligasa, 400 ng de

inserto y 40 ng del plásmido tratado previamente con la enzima fosfatasa alcalina (4 colonias
azules y 136 colonias blancas).
ii- la mitad de la reacción de ligación compuesta por buffer, enzima T4 ADN ligasa y 40 ng de
plásmido tratado con fosfatasa alcalina (5 colonias azules).
iii- ídem al anterior pero sin el tratamiento con fosfatasa alcalina (48 colonias azules).
iv- 10 ng de plásmido sin cortar (330 colonias azules).
v- sin ADN (no se obtienen colonias).

a- Explique qué indican los resultados y para qué se hace cada una de las placas.
b- Calcule la eficiencia de transformación.
c- Se eligieron 10 colonias blancas y se hizo minipreparación para obtener plásmidos. ¿Qué
pasos le faltaría seguir para corroborar que las colonias seleccionadas respondan a la
inducción con IPTG?

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8) El siguiente fragmento de 2000 pb codifica para un factor de transcripción humano. Se
muestra el mapa de restricción del mismo (descartar la presencia de otros sitios).

/·············2000pb················/
EcoRI SmaI NcoI EcoRI

ADN 200 1500 300

PROT. H 2N COOH 66kDa

Se desea expresar la proteína en E. coli como parte de un trabajo práctico. Los alumnos
deducen que al cortar el fragmento con EcoRI y ligarlo en el sitio correspondiente del vector
pUC9 previamente tratado con fosfatasa alcalina, la proteína queda en fase. Realizan
entonces los siguientes pasos:
Paso 1: Transformación de E. coli
i- Mezcla de ligación: vector cortado + inserto, 200 colonias blancas y 40 azules.
ii- Mezcla de ligación: vector cortado, 50 colonias azules.
iii- sin ADN, 0 colonias.

Paso 2: Chequeo del plásmido.

Se tomaron dos colonias blancas (1 y 2) y una azul, y se realizaron minipreparaciones de
plásmido. Los vectores obtenidos se trataron con EcoRI y se chequearon en un gel de
agarosa:

Colonia Azul 1 2 PM

- 3000 pb
-2000 pb

Paso 3: Inducción de la proteína recombinante.

Se realiza el experimento de manera similar al TP, obteniéndose el siguiente Western blot.

/······Azul·····/·······1·······/······2········/ PM
IPTG: - + - + - +
-100 kDa

-70 kDa

-50 kDa

5
Responder:
a- ¿Qué control faltó realizar en el paso 1 y qué función cumple? ¿Hubiese sido de valor
teniendo en cuenta los resultados obtenidos?
b- En el Western blot se observó una banda presente en todas las calles. ¿Cómo podría
explicar estos resultados?
c- ¿Cómo explica las diferencias obtenidas entre las colonias 1 y 2?
d- ¿Qué modificación haría en el paso 2 para poder diferenciar entre las colonias 1 y 2?
Esquematice un gel de agarosa ilustrando los posibles resultados de su experimento.

9) Se desea expresar el gen de ferredoxina de espinaca como producto de fusión con un

hexámero de histidinas. Se dispone de un vector que contiene el cADN de ~500 pb y de los
vectores de la serie pQE30/31/32. Los sitios de corte para las enzimas de restricción
presentes en el ADN que codifica para la ferredoxina se muestran resaltados, y los sitios de
iniciación y terminación de la traducción se encuentran subrayados. Además, el gen posee
sitios internos para las enzimas SalI, PstI y KpnI. Considere que no existen otros sitios de
corte.

SacI
5'......AGT CGA GCT CAG GCC ATG AAA GGG ........

SmaI HindIII
.........ATG CCC GGG GGT ATC GAG TAA AGC AAG CTT CCC... 3'

a- Realice el clonado en el vector adecuado para obtener la proteína unida a una cola de
histidinas, y esquematice la zona de unión.
b- ¿Qué características del vector pQE resultan interesantes para la expresión de proteínas
recombinantes?

10) La siguiente secuencia corresponde a una parte de la región codificante de una proteína
involucrada en la regulación del desarrollo en vegetales. Con el objetivo de hacer estudios
funcionales se desea clonar en el vector pGEX-3X la zona comprendida entre los aminoácidos
120 y 450 aproximadamente (nucleótidos 300 a 1350 aproximadamente). Por diversos
motivos (secuenciación, clonado de otras regiones, etc.) en su laboratorio se encuentran
disponibles los oligonucleótidos que se enumeran más abajo (éstos han sido diseñados con
un sitio de restricción, adecuado para el clonado, agregado en el extremo 5´, el cual se
muestra subrayado y es en todos los casos el mismo).
a- ¿Podría usar algún par de estos oligos para amplificar la región deseada? ¿Cuáles?
b- En caso afirmativo, ¿qué tamaño de producto se obtendría?
c- ¿Qué protocolo diseñaría para esta reacción de PCR? Indique tiempos y temperatura para
cada ciclo. Considere el cambio en TM cuando se comienza a amplificar el sitio de restricción
agregado.
d- ¿Qué función cumple el MgCl2 en la reacción de PCR? ¿Qué efecto causa su ausencia? ¿Y
su exceso?

6
290 5’ AGTGGTCACATGGGCGGCTCTCAGATCATTCGTAAAGCTCCTGTAGCAGAGA----
3’ TCACCAGTGTACCCGCCGAGAGTCTAGTAAGCATTTCGAGGACATCGTCTCT----

---386 nt----AGAGTTCGTCGTGAGATTACTCGCATGTCCGACAGGGG---533 nt----

-------------TCTCAAGCAGCACTCTAATGAGCGTACAGGCTGTCCCC-------------

---TTCGATCTAACACTCACGTCTTCACAGTCAGGTCTCGGGAACACTAGAGAT 3’ 1350
---AAGCTAGATTGTGAGTGCAGAAGTGTCAGTCCAGAGCCCTTGTGATCTCTA 5’

Oligo 1 5´ GAATTCACATGCGAGTAATCTCACGA 3'

Oligo 2 5’ GAATTCAAGTGCAGAGTCAATGATC 3'
Oligo 3 5’ GAATTCGATTACTCGCATGTCCG 3’
Oligo 4 5’ GAATTCGGCTCTCAGATCATTCGT 3’
Oligo 5 5’ GAATTCGGAGCTTTACGAATGA 3'
Oligo 6 5’ GAATTCCACAGTCAGGTCTCGGGAA 3’
Oligo 7 5’GAATTCAGACCTGACTGTGAAGA 3'
Oligo 8 5’ GAATTCTGTACCCGCCGAGAGTCTAGTA 3’

11) Usted tiene en un tubo adecuado para poner en un termociclador un ADN genómico que
contiene entre otras la siguiente secuencia expresada según la convención 5'-3’:

5730 ACGTTTGCACGGATCCGATT-------345 nt----------AAACAGTACG

TGCAAACGTGCCTAGGCTAA-----------------------TTTGTCATGC

6105 TAGTCACAC--------234 nt----------------------TAGCCCACACA

ATCAGTGTG------------------------------------ATCGGGTGTGT

6359 TGCTGCACTCCCGGGATATATTGACACTGC-------432 nt----------

ACGACGTGAGGGCCCTATATAACTGTGACG-----------------------

6821 AACGTTGACCGTACGGTACCTTGGAACCCATGCGTA-----70 nt-------CTG

TTGCAACTGGCATGCCATGGAACCTTGGGTACGCAT-----------------GAC

6930 CATGCATGCACCAATGGCCA----------------504 nt-------CCGGTCAC

GTACGTACGTGGTTACCGGT-----------------------------GGCCAGTG

7462 ACATGTGTCGCACGCACTACTA
TGTACACAGCGTGCGTGATGAT

El ADN se encuentra en una concentración de 0,1 ng/mL. Este tubo contiene además un
buffer adecuado para la Taq polimerasa, 2 mM Mg2+, dNTPs (400 µM c/u), 2U de Taq
polimerasa y los oligonuleótidos que se encuentran subrayados en la secuencia.
Usted realiza la amplificación con un programa que desnaturaliza a 94°C-1 minuto, anilla a
55°C-1 minuto y medio, y extiende a 72°C-2 minutos.
a- ¿Cuáles son los productos que obtendrá luego de 30 ciclos con este programa?

7
b- ¿Qué sucederá si cambia la temperatura de desnaturalización a 97°C?
c- ¿Qué obtendrá si el tiempo de desnaturalización se extiende a 2 minutos?
d- ¿Qué productos y de qué tamaños obtendrá si la temperatura de anillado se eleva en 5°C?
¿Y si se eleva en 15°C?
e- Ídem d si la temperatura se disminuye en 8°C.
f- ¿Qué productos y de qué tamaño obtendrá si la elongación se extiende 1 min adicional?
g- ¿Qué productos obtendrá si la temperatura de elongación se aumenta en 5°C?
h- ¿Qué condiciones debería utilizar si quisiera obtener todos los productos posibles?
En todos los casos indique los productos, sus tamaños y con qué oligonucleótidos se
originarían.

12) La siguiente secuencia pertenece al gen citO el cual es un regulador transcripcional que
controla la expresión de los genes del metabolismo de citrato en Enterococcus faecalis. Se
desea amplificar la secuencia completa del gen, para ello:

a- Diseñe los cebadores necesarios para poder amplificar la secuencia codificante completa.
b- Indique el protocolo de amplificación que va a utilizar y el tamaño del producto
amplificado.
c- Mencione los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción.

5’AGGAAGAATGTAACAGTGTTTTCAGAAAATGAGGACAAATTCATATTTATAGGAGAAGAACATGAA
TCCAACGGTTGAAGCAGTAAAACGGAACTTAGATTTAACCAGCAGTAAACCTCTAAAAATTTGTACCT
ACGAAGCCTTTAAAAAAACCATTATTTTAGGGGATATTCCTGCGGGTGAACGGATTAACGAAAAAGAA
TTTTCCGAGCAATTAAACATTAGTCGGACGCCCATTCGCTTTGCTTTACAAGAATTGGTCAAAGAACA
ATTGGTGGAACATATACCTATGGTGGGTATCGTGGTTAAAGGGATTAGTATGAAAGATGCTTATGAAA
TTTATGATATTCGTAAATCTTTGGACACTTTAGCAACCATTAAAGCCATGGAACTCATGACACCAGAA
GATTTTGATGAATTGGAAGCCTTACTTCTCGAAGGAGAACAATACAATAAAAATAACCAAGTAGATGA
CTTACTACAGAACTTTTCAGATTTTAATTCCTTTATTTATACTAAGAGTCAGATGCTACGTTTAAAAA
AAATTGTGACTGATCTCCATGCTTACTTAATCTATTTCAGAGATATTGCGATTCGTGCCTCAGAACGT
CGTAGTATTGCCCTAGAAGAACATTGGTTAATTTTCCGCGGAATGAAAACAAAGAATATTGACCAGAT
CACACTTTTAACCCATGAACATCTAAATCGTTCGCTTCAATTTATTTTGAAAGAAATGGAACGTCGGC
AAATTGAATAAGAGAAAATTCTACTAGAAATGCAAAAAAGTACAAGAAGAAATCAT 3 ’

13) La siguiente secuencia obtenida por RT-PCR, corresponde a la región 5´no codificante del
cADN del virus de la hepatitis C (VHC). Se desea desarrollar un protocolo de amplificación
por PCR de dicha secuencia que será utilizado para el diagnóstico de infección por VHC.

5´...GTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTAT.....180....
...GCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTCGTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCA
TGAGCA...3´

a- Diseñe un par de cebadores adecuados (n  22) y un protocolo de PCR que permitan la

amplificación de la región de interés. Marque claramente en qué región hibridan los
oligonucleótidos diseñados y sus TM.

8
b- Indique el tamaño del producto de amplificación obtenido y qué sistema utilizaría para
visualizarlo.
c- ¿Qué control diseñaría para evaluar la presencia de sustancias inhibitorias en la muestra
de un paciente a procesar?
d- Realice un esquema de las bandas que visualizaría en un gel (de las características
especificadas en el ítem b) en el que se corrieron las siguientes muestras:

calle 1: control negativo.

calle 2: control positivo.
calle 3: muestra de un paciente positivo para VHC (obtenida con EDTA).
calle 4: muestra de un paciente positivo para VHC (obtenida con heparina) .
calle 5: marcador de tamaño molecular de tipo Ladder 100 pb.

14) La siguiente es la secuencia de un ARN mensajero que codifica para una proteína de
Arabidopsis thaliana. Usted obtuvo la secuencia a partir de una base de datos pero no
cuenta con el clon que la contiene (ni lo puede obtener) y le interesa hacer estudios de tipo
Northern blot. La idea es construir una sonda a partir de ARN mensajero total (mARN) de
flor, donde usted sabe que este gen es expresado en niveles elevados y de donde fue aislada
esta secuencia inicialmente.
a- Diseñe un juego de oligonucleótidos y un protocolo que le permita construir una sonda
utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para estudiar la expresión del gen.
b- Indique las condiciones (programa de la PCR) en las cuales realizará la amplificación.
c- Se ha encontrado una mutante de esta proteína en donde el codón GCG que está
subrayado se convierte en ACA. ¿Qué oligonucleótidos diseñaría si Ud. quisiera diferenciar
entre la secuencia normal y la mutada por PCR? Escriba la secuencia en sentido 5’3’.

1 5’-TAAGACCGAGAGTTAAGGTCAGCTGTTGCGAAGTATACGGTTATTTAGGTAGTCTCAAG
60 ATTGCTCGACTGGTGGCTCCGTCAACAATTGCTCGACTGGTGGACCAGGCATTACAAAT
119 GGCCATACCCTTCGGAGGCTCAGAAGCTGGCACTCTCCGAGTCGACAGGACAGCAAGAG
178 TTCATGAAAAAGAGAAAGAAAGGGAAGTTACCCAGGGAGAAGCTCGGTCAACAATTGCT
237 CGACTGGTGGCTCCGTCAACAATTGCTCGACTGGTGGACCAGGCATTACAAATGGCCAT
296 ACCCTTCGGAGGCTCAGAAGCTGGCACTCTCCGAGTCGACAGGACTTGACCAGAAACAG
355 ATAAACAACTGGTTCATTAACCAACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’

En todos los casos indique en la secuencia la región donde hibridarían sus oligonucleótidos.

15) Con objetivo de investigar la relación antagónica entre la superóxido dismutasa

mitocondrial humana (Mn-SOD) y el TNF (tumor necrosis factor) se propone generar una
sonda específica que permita su detección en bibliotecas diferenciales.
La síntesis de la sonda requiere de una amplificación inicial in vitro, aislamiento y
purificación del amplificado y una posterior marca radioactiva utilizando la enzima T4
polinucleótido quinasa.
Sobre la secuencia del cADN que se muestra más abajo:
a- Diseñe cebadores que permitan su amplificación in vitro utilizando la reacción en cadena
de la polimerasa. Indique (subraye) la región de hibridación de los cebadores diseñados.

9
b- Diseñe un protocolo para su amplificación (reactivos, tiempos y temperaturas) y calcule el
tamaño del producto amplificado.
c- Describa cómo procedería para su aislamiento y qué reactivos utiliza para marcar
radiactivamente el fragmento.

ATGGCTTTCG AACTTCCCGC CCTTCCCTAT GCCCATGATG CCCTGGCTTC GCTGGGCATG

TCGAAGGAGA CGCTCGAGTA TCACCACGAC CTGCACCACA AGGCCTATGT CGACAACGGC
AACAAGCTGA TTGCGGGCAC CGAATGGGAA GGCAAGTCGG TCGAAGAGAT CGTCAAGGGC
ACCTATTGCG CCGGTGCCGT GGCGCAATCG GGGATCTTCA ACAATGCCTC GCAGCACTGG
AACCATGCGC AGTTCTGGGA AATGATGGGG CCGGGCGAAG ACAAGAAGAT GCCGGGCGCG
CTGGAAAAGG CGCTGGTGGA AAGCTTCGGT TCGGTCGCGA AGTTCAAGGA GGATTTCGCC
GCTGCGGGCG CGGGCCAGTT CGGCTCGGGC TGGGCCTGGC TGGTGAAAGA CAGCGATGGC
GCGCTGAAGA TCACCAAGAC CGAAAACGGC GTCAATCCGC TCTGCTTCGG GCAGACCGCG
CTTCTGGGCT GCGACGTCTG GGAGCACAGC TATTACATCG ACTTCCGCAA CAAGCGCCCG
GCTTACCTCA CGAACTTCCT CGACAAGCTG GTGAACTGGG AAAACGTCGC CTCGCGGATG
TGA

16) Para la detección del virus del Herpes simplex (HSV) en su laboratorio han diseñado un
par de cebadores que permiten amplificar un fragmento del gen de la glicoproteína D. A
continuación se muestran subrayadas las regiones de anillado de los oligonucleótidos sobre
la secuencia del gen.

GTAGGAATCGCAGCGCCAGCGGTTGCAAGGTAAGGCCCCGGCGCGCTCCTTCCTCCTTCTCTGCTGGT
CTTTCTTGGCAGAACACAGGTCACACACACTCTGGATCCCGGGGAAACTGAGTCAGGAGGGATGCAGG
GCGGATGGCTTAGTTCTGGACTATGATAGCTTTGTACCGAGTTCTAGCCAGATAGAAGGTTACCGGGA
GCTGGGGAGCGTTGGATTTGCTGCTGGGCTGTGCCGGTGCCCAGAAGGCAGGACCTTGCAGAACCAGC
CAGGTCCCTGGGAGACTGTCAGACCCACCAACCTGGTGGCATTCGCAGAGCTGAGATGCATTGGAAAT
TGCCTTGGGCACATCCCCAAAGATCAGGATGTCCCACCCCAGTCTGAAGGAGATAAAGTTGGGGGTAG
GAGAGACGCAGATGCAAGTGATCAGTCTCAGTCCCAGACATTGCCTTGCTCTGCGGGTAGGAATTCAG
GATTCATTTTCCAGGGAAGTTCCTGACCTCTGAATGAGAGGGGCTGTGTAAGGCCAATGCCTGGGAGG
AAGGCAAGGATGAGTAGAGGTGGGGGGAAACAAGTGTCAGGAAGACTCAAAATCTTCCAGAGAAATTG
TGCAGGGTCTTACAGATCTGTCCTCAAAGCCATGCAAATTGCCTTCTTTGCAATGCATACAATGAGGT
GTCTCTGGGGGTCAGAACTGGTTATTAGGGAACTTCTAGCCAGGACTGCTAAATACGCGCTGTTGGCC
CACCAGGCTCACCTATAGCCTTCCTTCAGTCTGG

a- Escriba los 2 oligonucleótidos en la forma correcta como para poder encargarlos al

proveedor. Calcule la TM de ambos y el tamaño del producto amplificado.
b- Para la correcta optimización de la detección del virus usted desea conocer la sensibilidad
de la técnica de PCR puesta a punto. ¿De qué manera propone estudiarla?
c- Una vez que finalizó la puesta a punto de la reacción de PCR, ¿qué controles cree
conveniente realizar para una detección confiable del virus en muestras biológicas
humanas? ¿Qué pone en evidencia con cada uno de ellos?
d- En una oportunidad descubre que aparece una banda del tamaño esperado en el control
negativo de la reacción de PCR, ¿cómo procedería a detectar el origen de esa
contaminación? ¿Qué medidas cree conveniente tomar para evitarla?

17) Usted desea comprobar si el gen biot se expresa en tejido hepático sometido a una
droga mutagénica. Utilizando un programa de computación usted realizó el diseño de

10
cebadores para amplificar un fragmento del cADN de longitud entre 100 y 300 pb. La
siguiente secuencia de ADN genómico corresponde a una parte del gen biot que incluye un
intrón (sombreado) que abarca desde el nucleótido 2779 al 3061 (282 pb). Los cebadores
diseñados por el programa se encuentran subrayados en la secuencia y numerados del 1 al 6
entre paréntesis arriba de la secuencia doble hebra del ADN.

2730 (1) (2) 2788

5´-ACGTTTGCACGGATCCGATTAAACAGTACGAGTGGTCACATGGGCGGCTCTCAGATCAT
3´-TGCAAACGTGCCTAGGCTAATTTGTCATGCTCACCAGTGTACCCGCCGAGAGTCTAGTA

2797 3032 3045

TAGTCACAC--------234 pb----------------------TAGCCCACACATAG
ATCAGTGTG------------------------------------ATCGGGTGTGTATC

(3) 3075 3507

TGCTGCACTCCCGGGATATATTGACACTGC-------432 pb------------AGAT
ACGACGTGAGGGCCCTATATAACTGTGACG-------------------------TCTA

(4) 3571
AACGTTGACCGTACGGTACCTTGGAACCCATGCGTACTGTGGGCGGCTCTCAGATCATGCA
TTGCAACTGGCATGCCATGGAACCTTGGGTACGCATGACACCCGCCGAGAGTCTAGTACGT

(5) 3591 (6)

CATGCATGCACCAATGACCA----------------204 pb-------CCGGTCACCAT
GTACGTACGTGGTTACTGGT-----------------------------GGCCAGTGGTA

ACACGTGTCGCACGCACTACTA-3´
TGTGCACAGCGTGCGTGATGAT-5´

a- ¿Qué material de partida utilizaría para realizar el análisis de la expresión?

b- ¿Qué método utilizaría para medir la expresión del gen biot? Explique y justifique la
metodología.
c- ¿Qué controles son necesarios para la interpretación de los resultados de la expresión del
gen biot?
d- Escriba las secuencias de todos los oligonucleótidos y calcule las T M de los mismos.
e- ¿Qué par de cebadores elegiría y cuáles no? Considere todos los pares de cebadores
posibles y justifique su elección o no en cada caso.
f- Calcule el tamaño del fragmento amplificado con el par de cebadores elegidos y diseñe un
programa de PCR adecuado para llevar a cabo la reacción.
g- Si su muestra estuviera contaminada con ADN genómico, ¿los cebadores seleccionados le
servirían para distinguir esta contaminación? Justifique.
h- Proponga la amplificación de un producto que distinga tal situación.

18) La siguiente es la secuencia del cADN que codifica para una proteína que actúa como
factor de transcripción en plantas. Se encuentran subrayados los codones de iniciación y
terminación de la traducción.

11
a- Diseñe un par de oligonucleótidos que le permitan amplificar la secuencia codificante
completa para clonarla y expresarla en el vector pGEX-3X, utilizando los sitios EcoRI y BamHI.
b- Indique en qué región de la secuencia hibridan los oligonucleótidos diseñados y el tamaño
que tendrá el fragmento amplificado.
c- Indique las condiciones experimentales en las cuales va a hacer funcionar el
termociclador.

1 5’-TGTAATATTT GTGGGGTAAA AGCCATGATT CAGATAATTG GGGCTTGCTG ATGGGTACCA

61 ACATAAAGGC ATGATTGAAC TCTCCACTCC TTTCTTTATA ATCCCTTCCA CACGCACTTC
121 TCCACTTCAT AGTCACAACT AGAGATGACG GTTCAAAAGG AAGATTTGGG CTTGAGTCTA
181 AGTTTGAGCT TCCCTCTCCT CTCCTCTTCT CCTTCCAGCC ACAACCCTCA GAAACCCTCT
241 TGGAACGACC CTATTTTCAC TTCTTCAGGT GAAGCTGGAT CATTCCTCCG CGGAATCGAT
301 GTGAACCGTT TACCTTCTGT GGTTGATTGC GAAGAGGAAG CAGGTGTTTC ATCTCCAAAC
361 AGCACGGTTT CTAGCGTCAG TGGAAAGCGC AGCGAGAGGG AAACCAATGG AGAAGAAAAC
421 GACACAGACA GAGCTTGTTC CAGAGGCATC ATCAGCGACG AAGAAGATGC TGAAACCTCT
481 AGAAAGAAAC TTAGACTCTC CAAAGATCAG TCAATTGTCC TGGAAGAGAG CTTCAAAGAA
541 CACAACACTC TTAACCCCAA GCAAAAGTTG GCACTGGCGA AACAGCTGGG TCTTCGAGCG
601 AGACAAGTGG AGGTGTGGTT CCAGAACAGA CGGAGGAAAA AAAAAAAA-3’

19) Usted desea amplificar la región codificante de la siguiente secuencia para subclonarla
luego en un vector de expresión. Diseñe los oligonucleótidos (y escriba la secuencia de los
mismos) para realizar una PCR que permita introducir un sitio para el clonado del fragmento
en el plásmido pGEX-3X.

Met
CAATCTACACATCTTTTATTCAG ATG GAT TTT CAT GGA TTT GCC TCG GTG
GAA CAT GCA CTG GAA CTA CGC CTT AGT ACA ACA TCA TCG GTG GCC
GAA AAC ACA ACG AAT CCC ATC AAG AAG CCT AGC CCG AGT TCT GAT
CAT TGT CTT GAA CCA TCT CTA ACT TTG GCT CTT TCT GGT GAT TCA
TGC GGT GGT TCG TCG TTC TCT ATC GCT AGT GCG AAG AGG GAA AGA
GAG GTT CCG AGT GAA GAA TCG GAG AGA GGA GGA GAG AAC ACT AGT
GGT GAA GAA GAT GAA GAT GGT GGT GTG AAT GGT AAG AAG AAA CTC
AGG TTA ACT AAA GCT CAA TCT GGA CTA TTA GAG GAA GCC TTC AAA
CTT CAC ACA ACT TTA AAC CCT AAA CAA AAG CAA GAG CTT GCA GCT
TGT TGA TAATTGATTTTATATGTGGATTATGTTGCATAAAATTTAAATCACTCAATG
TGCACAGCCCCACCCTTTTTTCAGAGTCATGGGCTTATCTAGTGGTGGAAGAAATAATG

20) Usted desea amplificar por PCR un gen bacteriano cuya secuencia se muestra a
continuación (se subrayan los sitios de inicio y terminación de la traducción).

HindIII
5’GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG -582 nt- ACA TAA AAG CTT
ATC TTC AGC TGC ATT 3’

12
La proteína que codifica se debe obtener con todos los aminoácidos y se la quiere purificar
introduciendo una cola de histidinas amino terminal, para lo cual se realizará el clonado en
el vector pET-28. En el laboratorio se dispone sólo de las enzimas HindIII, BamHI y EcoRI, las
cuales no poseen sitios de reconocimiento dentro de la secuencia codificante.

a- Diseñe los oligonucleótidos que usará, introduciendo sitios de restricción para realizar el
clonado en el vector pET-28, teniendo en cuenta que tengan temperaturas de anillado
similares.
b- Especifique cómo se induce la expresión, cuántos aminoácidos tendrá la proteína y cómo
puede purificarla.
c- ¿Cómo puede eliminar la cola de histidina una vez purificada la proteína?

21) En su laboratorio desean clonar la enzima beta-lactamasa de Acinetobacter baumannii

como proteína recombinante en cepas de E. coli. La región codificante se encuentra
detallada a continuación (los codones de inicio y terminación están subrayados, en
minúscula se encuentra señalado el sitio de corte de la enzima BamHI, la secuencia no
cuenta con ningún otro sitio de corte).

GCGTGCTTAGGCAGGGCTAGATATTTCTTATTCGAAATTCAAGATGAAGCATTCTTCAGGACCAAAGA
GGggatccTCATCAGCAAAACGCCGGGTTATTCTTATTTGTCGCTTCTTTACTCGCCTTTATCGGCCC
TCACTCAAGGATGTATTGTGGTTATGCGTTATATTCGCCTGTGTATTATCTCCCTGTTTCCCACCCTG
CCGCTG---------------------------------100pb------------------------
GCATGGCCGCGACCCTGCGCAAGCTGCTTCCCAGCCAGCGTCTTCGCGCCCGTTCGCAACGGCAGCTG
CTGCAGTGGATGGTGGACGATCGGGTCGCCGGACCGTTTCTCCGCTCCGTGCTGCCGGCGGGCTGGAT
TATCGTCGATAAGACCGGAGCTAGCGAGCGGGGTGCGCGCGGGATTGTCGCCCTGCTTGGCCCGAATT
CCAAAG

Reactivos y materiales con los que cuenta en su laboratorio:

- Kit de pGEM-T Easy
- E. coli JM109 (endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F' traD36
proAB+ lacIq lacZΔM15] hsdR17(rK-mK+)
- E. coli BL21 (DE3) pLysS (F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR))
- Enzimas de restricción: EcoRI, BamHI
- Reactivos para PCR: Taq polimerasa, dNTPs, MgCl2, etc.
- Cebadores que hibridan en las regiones resaltadas con negrita en la secuencia del gen.
- Vectores de la serie pET-28.

a- Primero realiza una amplificación de la región codificante utilizando los cebadores

indicados en la secuencia.
a1- ¿Cuál es el tamaño del producto amplificado?
a2- ¿Qué vector (de los que dispone) utilizaría para clonar el fragmento amplificado por
PCR? Justifique.
A continuación incuba vector e inserto con una mezcla de ligación (ML), transforma una cepa
de E. coli y siembra sobre placas de LB-agar suplementadas con ampicilina e IPTG. Como
resultado, al día siguiente observa que sólo hay colonias blancas en las placas (inclusive en el

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control positivo en el que transformó las células con plásmido cerrado). No hubo desarrollo
bacteriano en el control negativo.
a3- ¿Qué cepa de E. coli (de las que dispone) usó para este propósito? Justifique.
a4- ¿A qué se puede deber que no haya al menos algunas colonias azules?

b- Posteriormente, una vez solucionado el inconveniente de la transformación, procede al

subclonado del fragmento de interés en otro vector, liberándolo con la enzima EcoRI.
b1- ¿En qué vector de los disponibles lo clonaría para expresar la beta-lactamasa?
b2- ¿Qué cepa de E. coli usaría para la inducción de la expresión?
Cuando realiza la transformación de esta cepa con el vector de expresión conteniendo el
inserto obtiene numerosas colonias blancas en placas de LB-agar. Toma algunas de éstas, las
inocula en medio fresco e induce la expresión con un inductor apropiado. Al chequear en gel
de poliacrilamida el resultado de la expresión observa que en algunos casos no se logró la
sobreexpresión de la proteína.
b3- ¿A qué puede deberse esta falla? Explique cómo debería resolverla.

22) En el laboratorio donde Ud. trabaja se plantea estudiar la expresión de la proteína pilina
de Pseudomonas aeruginosa (codificada por el gen pilA) durante el proceso de infección de
células humanas. Para ello Ud. debe obtener anticuerpos específicos contra dicha proteína
mediante sobreexpresión del gen pilA en células de E. coli, purificación de la proteína
recombinante a través de un método cromatográfico y posterior inoculación en conejo.
Diseñe una estrategia de clonado que le permita llevar adelante este objetivo, teniendo en
cuenta que las pilinas son normalmente sintetizadas como precursores y posteriormente
procesadas en su extremo amino-terminal por endopeptidasas que remueven el péptido
señal produciendo la proteína madura.
A continuación se muestra la secuencia del gen pilA de P. aeruginosa, en la cual se encuentra
subrayado el único sitio de restricción que posee (correspondiente a la enzima NheI).

ATGAAGTCGATGCGTCATCTCAACAAGCGTGTCCAGAAGGGTTTCACGCTGATCGAACTGATGATCGTGGTCG
CGATCGTCGGTATTCTGGCTGCGATTGCCATTCCGGCCTATCAGGACTACACGGTTCGTGCACGCGTGACGGA
AGGTCTGTCGCTGGCTGCGCAAGCCAAGGCGCTGGTGTCGGAAAACGCTGCCAATGCACAGTCTGACCTGTC
GGTGGGTTCGTCGGTGTTCACGCCCACCAAGAACGTTGCCAACTTGACGATTGCTGGTACGGGTACTGTTCCG
GGTCAGATCACCGTCACCTATACGACGGCAGCTGGCGGCGGCACGCTGGCTCTGGTTCCGACTGCGGCTGGTA
CTGCACTGCCGGTTAGCTCGGCACCGTCGGGCCCGATCATGTGGACCTGCTACGCTCAGAATAAGGCTCAGGC
TGCTAGCAGCGTTGCTCCGAGCGGTACGATGTCGCTGGCAGCGAAGTATGTTCAGCAGAATGTCGCTAA

23) La gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPN) es una enzima que se encuentra en

tejidos de plantas superiores y cuya secuencia se conoce en maíz y tabaco, entre otras
plantas. Para investigar la presencia de GAPN en trigo, se realizó un Southern blot con ADN
genómico de trigo usando como sonda un fragmento del gen gapN de maíz que contiene
200 nt de la porción 5'.
a- El Southern blot se realizó con ADN proveniente de hojas de trigo, digerido con EcoRI,
BamHI y HindIII, y la hibridización se realizó en condiciones tales que los genes con similitud
de secuencia pudieran ser detectados. La foto muestra el resultado obtenido en el Southern
blot. ¿Qué conclusión puede sacar del mismo?

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b- Usando oligonucleótidos degenerados de una región altamente conservada de la enzima
de maíz se obtuvo por PCR un fragmento probable de gapN de trigo, con el cual se aisló el
clon de longitud completa y se secuenció. A continuación se muestra la secuencia de las
regiones 5’ y 3’ del gen gapN de trigo, donde se encuentran resaltados los sitios de inicio y
terminación de la traducción y las posiciones de los sitios de restricción para las enzimas que
se disponen en el laboratorio.

5’gcaatcccagatctttatggcggggacgggggtgttcgcggacgtgctgga (1421 nt)

taaacctcccatctccgtcctacaccatgggctgagcggatcccgattcacagccgtaatc 3’

BamHI: G´GATCC (1459)

BglII: A´GATCT (9)
EcoRI: G´AATTC (no posee)
HindIII: A´AGCTT (no posee)
SalI: G´TCGAC (300)

Proponga una estrategia para expresar la GAPN de trigo en el vector pET28 (a, b o c) con una
cola de histidina amino terminal, realizando el clonado sólo con las enzimas de restricción
que están disponibles (sin usar PCR, ni linkers).
c- ¿Cómo proseguiría el análisis de las bacterias transformadas con el plásmido diseñado
para asegurarse de que las mismas expresen GAPN?

24) Las ARN helicasas, enzimas que despliegan moléculas de ARN doble-hebra y que se
encuentran implicadas en los mecanismos de splicing alternativo, han despertado gran
interés en los últimos tiempos ya que se ha reportado que juegan un importante rol durante
el desarrollo y la respuesta a estrés en varios organismos. Teniendo conocimiento de la
secuencia de nucleótidos del gen que codifica para esta enzima en Arabidopsis thaliana
(AtRH) se ha generado una sonda específica mediante PCR la cual fue posteriormente
marcada utilizando T4 polinucleótido quinasa. A continuación se muestra una sección del
genoma de A. thaliana que incluye al gen AtRH, en la que se han indicado los sitios de corte

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para las enzimas de restricción EcoRI, HindIII y XbaI, así como también las regiones en donde
hibridan los cebadores AtRH-F y AtRH-R, utilizados para amplificar la sonda. El gen AtRH
completo presenta 2465 pb y posee dos intrones de 583 y 448 pb respectivamente, los
cuales se indican en la figura.

a- Grafique en el siguiente esquema el patrón de bandas que esperaría obtener en un

ensayo de Southern blot, digiriendo el ADN genómico de A. thaliana con cada una de estas
enzimas y utilizando la sonda mencionada anteriormente.

b- Cuál de estas enzimas de restricción utilizaría si deseara determinar el número de copias

de este gen en otro organismo mediante Southern blot?

Con el objetivo de estudiar la participación de esta enzima en la respuesta a distintos tipos

de estrés abiótico se realizaron estudios de Northern blot utilizando la sonda mencionada,
en plantas de A. thaliana sometidas a condiciones de baja temperatura (A), sequía (B) y
estrés salino (C). En dichos ensayos se observó una única banda de ~1,4 kb, la cual presentó
los patrones que se muestran a continuación. Como control de siembra se muestra la banda
correspondiente al rARN 18S de cada muestra en un gel teñido con bromuro de etidio.
c- ¿El tamaño de la banda observada en el Northern blot es el esperado? ¿Por qué?
d- ¿Qué conclusiones puede sacar de estos resultados?

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25) El gen AtbZIP1 de A. thaliana codifica para un factor de transcripción perteneciente a la
familia de reguladores con motivo estructural de cierre de leucina (bZIP). Se ha observado
que el gen AtbZIP1 es inducido en Arabidopsis por distintos tipos de estrés abióticos, tales
como alta salinidad, frío o sequía.
Con el objetivo de estudiar la función de este gen y su posible participación en la respuesta
de la planta a estrés abiótico se generó una mutante knockout (KO) de Arabidopsis en el gen
AtbZIP1 mediante la inserción de un gen de resistencia al antibiótico kanamicina (1248 pb).
Para corroborar dicha mutación se realizó un estudio de Southern blot, en el cual se digirió el
ADN de Arabidopsis con la enzima EcoRI y se utilizó como sonda un fragmento de ADN
correspondiente al extremo 3’ del exón 1 del gen AtbZIP1 (El gen AtbZIP1 no posee sitio de
reconocimiento para la enzima EcoRI). En la figura a se muestra la estructura del gen
AtbZIP1, indicándose el sitio de hibridación de la sonda y el sitio de inserción del gen de
resistencia (KanR) en la planta mutante.

a- La figura b muestra el resultado del Southern blot en la planta salvaje de A. thaliana (WT).
Grafique en la figura lo que esperaría ver en este ensayo para la planta mutante en el gen
AtbZIP1 (KO). Justifique.
b- En la figura c se muestra el resultado obtenido en un ensayo de RT-PCR utilizando los
cebadores F y R que se indican en la figura a, tanto para la planta salvaje (WT) como para la
planta mutante en el gen AtbZIP1 (KO).
b1- ¿El tamaño del producto de PCR obtenido en este ensayo es el esperado? ¿Por qué?
b2- ¿Qué conclusión puede obtener a partir de este resultado?
c- Por último, para estudiar la función de AtbZIP1, se evaluó la expresión de diferentes genes
de respuesta a estrés abiótico (RD17, LEA14, RD29, COR15A y COR15B) en la planta salvaje
(WT) y en la mutante AtbZIP1 (KO), ambas sometidas a estrés por sequía. Para ello, se
extrajo ARN total de ambas plantas y se realizaron ensayos de Northern blot, utilizando
sondas específicas para los diferentes genes de respuesta a estrés.
Indique qué conclusiones puede sacar de estos resultados respecto a la función de AtbZIP1
como regulador transcripcional.

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26) Usted recibe una alícuota de 5 L de una biblioteca genómica de ratón construida en el
fago lambda Charon 40 (tamaño de inserto máximo 24 kb) de un amigo que la construyó.
Lamentablemente, su amigo no le ha enviado el título de la misma, por lo que decide
constatarlo usted mismo. Al utilizar 10 μL de una dilución 1:1000 de la biblioteca original,
observa 500 placas de lisis.
a- ¿Cuál es el título de la biblioteca?
b- ¿Qué volumen de la misma necesitará para hacer una búsqueda considerando que el
genoma del ratón posee 2,5 109 pb?
c- ¿Le convendría amplificar previamente la biblioteca o solicitar una nueva alícuota a su
amigo? Explique.

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