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Acreditación para Laboratorios de Microbiología Guía EURACHEM

Acreditación para Laboratorios


de Microbiología

Segunda Edición 2013

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Acreditación para Laboratorios de Microbiología Guía EURACHEM

Acreditación para Laboratorios de Microbiología


Segunda Edición

Este documento ha sido elaborado por Eurachem. Proporciona los laboratorios microbiológicos
con medios adecuados de información y orientación sobre cómo estar preparados para cumplir
con los requisitos de ISO/lEC 17025. Sustituye a EA- 4/10:2002.

Editores
Mary Eleftheriadou, European University Cyprus
Kyriacos C. Tsimillis, Cyprus Accreditation Body

Composición del grupo de Trabajo ad hoc


M. Eleftheriadou, European University Cyprus
K. C. Tsimillis, Cyprus Accreditation Body
G. T. Papageorgiou, State General Laboratory, Cyprus
N. Pissarides, State General Laboratory, Cyprus
A. Varnava-Tello, State General Laboratory, Cyprus

Citación recomendada
Esta guia debe ser citada como;
M. Eleftheriadou and K. C. Tsimillis (Eds), Eurachem guide: Accreditation
íor Microbiological Laboratories, Second edition (2013),
ISBN: 978-91-87017-92-6. Disponible en www.eurachem.org.

Acreditación para Laboratorios de Microbiología

Edición en Inglés

Segunda Edición 2013

ISBN: 978-91-87017-92-6.

Los derechos de este texto son reservados a Eurachem, Las investigaciones con respecto a la traducción, así como la producción y distribución
de las nuevas ediciones de este documento debe ser dirigida a la secretaría de Eurachem.

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CONTENIDO
1. Introducción y alcance del documento 1
2. Estándares para la acreditación de laboratorios de microbiología 3
3. Personal 3
4. Medio Ambiente 5
4.1 Locales 5
4.2 Monitoreo Ambiental 7

4.3 Higiene 7

5. Validación y verificación de los métodos de ensayo 8


5.1 Selección de métodos de ensayo 8
5.2 Validación 8
9
5.3 Verificación
6. Incertidumbre de Medición 10
7. Equipos – Mantenimiento, Calibración y Verificación de su funcionamiento 12
7.1 Mantenimiento 12
7.2 Calibración y verificación de desempeño 12

7.2.2 Equipos para medir temperatura 12

7.2.3 Incubadoras, baños termostáticos, estufas 13

7.2.4 Autoclaves, incluidos los preparadores de medios 13

7.2.5 Pesos y Balanzas 14

7.2.6 Material volumétrico 14

7.2.7 Ciclos termales 14

7.2.8 Otro equipo 14

8. Reactivos y medios de cultivo 15


8.1 Reactivos 15
8.2 Medios preparados internamente 15

8.3 Medios listos para su uso 15

8.4 Etiquetado 16

9. Materiales de Referencia y Cepas de referencia 17


9.1 Materiales de referencia 17
9.2 Cepas de referencia 17

10. Muestreo 18
11. Manipulación e identificación de muestras 19
12. Eliminación de Residuos Contaminados 20
13. Aseguramiento de la calidad de los resultados / Control de calidad 21
13.1 Control de calidad Interno 21
13.2 Control de Calidad Externo (ensayos de aptitud) 21

14. Informes de Ensayos 23


Apéndice A Glosario de términos 24
Apéndice B U s o g eneral de cultivos de referencia 26
Apéndice C Guía para la calibración y verificación de la calibración 27
Apéndice D Guía sobre la validación de equipos y la verificación de resultados. 28
Apéndice E Guía sobre mantenimiento de equipo 30
Referencias -

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1. INTRODUCCIÓN Y ALCANCE DEL DOCUMENTO

1.1 Los requisitos generales para la acreditación aparecen definidos en la Norma Internacional
Requisitos generales para la competencia de laboratorios de ensayo y calibración (ISO/IEC 17025
2da edición, 2005), en lo sucesivo denominada la norma ISO/IEC 17025 [1]. Todos esos requisitos
deben ser cumplidos por los laboratorios que buscan la acreditación.

1.2 Esta guía proporciona información adecuada sobre la forma de cumplir los requisitos de la
norma ISO/I CE 17025, a los laboratorios que realizan pruebas microbiológicas, brindando
directrices detalladas sobre esos requisitos para aquellos que realizan análisis de materiales,
productos y substancias.

Estas directrices son aplicables a todo tipo de mediciones objetivas, ya sean o no rutinarias, o
como parte de actividades de investigación y desarrollo. Aunque esta guía está dirigida
principalmente a los análisis microbiológicos de agua, alimentos y medio ambiente, los principios
generales pueden aplicarse también a otras áreas.

Por lo tanto, también puede ser utilizado en laboratorios médicos donde se aplique la norma ISO
15189 [2] se aplica, así como en laboratorios de investigación y desarrollo. La norma ISO/lEC 17025
sigue siendo el documento autorizado ando en caso de disputa, los organismos de acreditación
se pronunciará sobre casos sin resolver.

Sin embargo, se debe prestar atención a requerimientos adicionales relacionados con pruebas
microbiológicas en el campo de la medicina, requisitos de seguridad, tratamiento de muestras,
las calificaciones del personal.

Las directrices propuestas en este documento también puede ser útiles para aquellos que
trabajan en proceso de registro en el marco de otras normas de calidad, tales como GLP (Buenas
Prácticas de Laboratorio [3]), GMP (Buenas Prácticas de Fabricación [4], y las buenas prácticas
clínicas (Good Clinical Practice [5]).

1.3 El presente documento puede considerarse como un documento guía para análisis
microbiológicos según se establece en el Apéndice B de la norma ISO/IEC 17025, considerando
los requerimientos EA MLA (EA Acuerdo Multilateral). Este documento ha sido elaborado por
EURACHEM en colaboración con EA LC (EA Comité de Laboratorio) como forma de facilitar a los
laboratorios de microbiología a cumplir con los requerimientos de acreditación, a través de un
mejor entendimiento de ambos, estándares de acreditación y estándares específicos sectoriales
si es aplicable.

1.4 Se debe considerar que los análisis microbiológicos deben incluir pruebas de esterilidad,
detección, aislamiento, recuento e identificación de microorganismos (virus, bacterias, hongos y
protozoos) y sus metabolitos en diferentes materiales y productos, o cualquier tipo de ensayo en
el que se utilicen microorganismos como parte de un sistema de detección, así como la utilización
de microorganismos para ensayos ecológicos.

De ahí se deduce que algunas de las directrices contenidas en el presente documento, como las
referentes a las de laboratorios de medio ambiente, requieren ser interpretadas en consecuencia.
Este documento puede servir también de orientación para los laboratorios que utilizan técnicas
en áreas relacionadas con la microbiología, bioquímica, biología molecular y cultivos celulares,
aunque esos laboratorios pueden tener que cumplir otros requisitos adicionales.

1.5 Esta guía se refiere a la calidad de los resultados de las pruebas, sin abordar específicamente
aspectos relacionados con la salud y la seguridad. No obstante, las prácticas de los laboratorios
deben cumplir la legislación nacional vigente en materia de salud y seguridad.

Es importante recordar que, en algunos casos, las cuestiones relacionadas con la salud y la
seguridad pueden influir en la calidad de las pruebas y el laboratorio, aspectos que debe ser
tomado cuenta.

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Esta versión de la guía toma en cuenta las tendencias recientes de la microbiología, es decir,
técnicas en tiempo real RCP (Reacción en cadena de Polimerasa), para la detección de
microorganismos. Los métodos moleculares son, hoy en día, muy importantes en análisis
microbiológicos, ya sea como pasos para identificación/confirmación, o como métodos de
detección alternativos.

1.6 En el Apéndice A puede encontrarse un glosario con las definiciones de los términos utilizados
en este documento.

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2. Estándares para la acreditación de laboratorios de Microbiología

Las principales normas utilizadas para la acreditación de laboratorios

ISO/IEC 17025, Los requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y
calibración [1]

ISO 15189, Laboratorios médicos - Requisitos para la calidad y la competencia [2]

Terminología

ISO 9000 Sistemas de gestión de Calidad, - Fundamentos y vocabulario [6]

ISO/lEC Guía 99, Vocabulario internacional de metrología - Conceptos básicos y generales, y los
términos asociados (VIM 3) (disponible como JCGM 200 de www.bipm.org) [7]

Estándares Básicos

ISO 7218, Microbiología de alimentos y forrajes para animales - Requisitos generales para los
exámenes microbiológicos [8]

ISOITS 19036, Microbiología de alimentos y forrajes para animales - Directrices para el cálculo de
incertidumbre de medida las determinaciones cuantitativas (incluido, Amd 1: Incertidumbre de
medición de recuentos bajos) [9]

ISO 29201 Calidad de Agua, la variabilidad de los resultados de las pruebas y la incertidumbre de
la medida de métodos de enumeración microbiológicos [10]

ISO 8199, Calidad de agua - Orientación general sobre la enumeración de microorganismos por
cepa [11]

Una lista detallada de los documentos a considerarse aparece en las referencias.

3. PERSONAL

ISO 17025, acápite 5.2

3.1 Los análisis microbiológicos deben ser realizados o supervisados por personas con experiencia
que cuenten con grado superior en microbiología o equivalente. Calificaciones alternativas se
consideraran siempre que el personal tenga una amplia experiencia relacionada con el alcance
de acreditación del laboratorio. El personal debe tener la experiencia profesional práctica
necesaria para que se le permita realizar sin supervisión trabajos cubiertos por el alcance de la
acreditación o se considere que tiene experiencia suficiente como para supervisar el trabajo
acreditado. Algunas disposiciones específicas de la legislación nacional pueden sobrepasar las
directrices contenidas en este documento.

3.2 Si el laboratorio incluye opiniones e interpretaciones de los resultados de las pruebas en sus
informes, éstas deben ser realizadas por personal autorizado con experiencia suficiente y con
conocimientos relacionados con la aplicación específica, incluyendo, por ejemplo, requisitos
legislativos y tecnológicos y criterios de aceptabilidad.

3.3 La dirección del laboratorio debe asegurar que todo el personal haya recibido formación
adecuada para que sean competentes en la realización de las pruebas y en el manejo de los
equipos. Dicha formación incluirá entrenamiento en técnicas básicas, como preparación de
placas, recuento de colonias, técnicas asépticas, etc., y la aceptabilidad se determinará
aplicando criterios objetivos. El personal sólo podrá realizar análisis de muestras cuando se haya
reconocido su competencia para hacerlo, o cuando lo haga bajo la supervisión adecuada. Se
comprobará con criterios objetivos que el personal sigue siendo competente y se proporcionará
de nuevo formación siempre que sea necesario.

Cuando un método o técnica no se utilice de manera regular, puede que sea necesario verificar
la competencia del personal antes de realizar el ensayo. Se establecerá y documentará el

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intervalo crítico entre la realización de sucesivos ensayos. La interpretación de los resultados de


las pruebas para la identificación y verificación de microorganismos está relacionada en gran
medida con la experiencia del analista que ejecuta el ensayo y debe monitorearse
periódicamente para cada analista.

3.4 En algunos casos, puede que sea más apropiado relacionar la competencia con una técnica
o instrumento en particular, más que con métodos.

3.5. La competencia del personal para ejecutar las pruebas, debe ser documentada en lo que se
refiere a los resultados de la evaluación interna y externa de control de calidad. La efectividad
del programa de capacitación, así como la identificación de nuevas necesidades de
capacitación, también deben ser evaluadas en base a estos resultados.

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4. MEDIO AMBIENTE

ISO 17025, Acápite 5.3 / Ver además ISO 7218 [8], Acápite 3

4.1 Locales

4.1.1 Un laboratorio típico está compuesto por áreas de ensayo (dónde se realizan análisis
microbiológicos específicos y actividades relacionadas) y áreas auxiliares (recepción, pasillos,
oficinas de administración, áreas de vestuarios y aseo, almacenes, archivos, etc.). En general,
existen requisitos ambientales específicos para las áreas de ensayo.

Dependiendo del tipo de ensayos que se realicen, el acceso al laboratorio microbiológico debe
restringirse al personal autorizado. Cuando existan este tipo de restricciones, el personal debe
conocer:

(a) el uso restringido de una determinada área;

(b) las restricciones impuestas al trabajo que puede realizarse en dichas áreas;

(c) las razones para imponer esas restricciones;

(d) los niveles de contaminación apropiados.

4.1.2 El laboratorio debe tomar las medidas necesarias para reducir al mínimo el riesgo de
contaminación cruzada, siempre que dicho riesgo sea importante por el tipo de ensayos
realizados. Los modos para alcanzar estos objetivos son, por ejemplo:

a) Construir el laboratorio de acuerdo a un diseño 'sin camino de regreso’;


b) Llevar a cabo procedimientos de una forma secuencial utilizando medidas apropiadas
para asegurar la integridad de las pruebas y las muestras (por ejemplo, utilizando
recipientes herméticos);
c) Separar las actividades en el tiempo o en el espacio.

4.1.3 En general, es conveniente que existan áreas separadas o claramente designadas para las
siguientes actividades:

 recepción y almacenamiento de muestras;

 preparación de muestras (por ejemplo, se debe utilizar un área separada para la


preparación de productos en polvo que pueden estar muy contaminados);

 examen de muestras, incluyendo su incubación;

 mantenimiento de organismos de referencia;

 manipulación de a presuntos agentes patógenos

 almacenamiento de medios de cultivo y reactivos

 preparación de medios y equipos, incluyendo su esterilización;

 verificación de la esterilidad;

 descontaminación.

 limpieza de vidrio y de otros equipos

 almacenamiento de productos químicos peligrosos.

El área de lavado (después de la descontaminación) puede compartirse con otras partes del
laboratorio siempre que se adopten las debidas precauciones para evitar la transferencia de
trazas de substancias que podrían afectar negativamente al crecimiento microbiano. La
necesidad de la separación física debe juzgarse considerando las actividades específicas del
laboratorio (por ejemplo, número de ensayos realizados, tipo de ensayos, etc.)

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Los equipos del laboratorio no deben moverse habitualmente entre las distintas áreas, para evitar
una contaminación cruzada accidental.

En el laboratorio de biología molecular debe disponerse en cada área de trabajo, pipetas, puntas,
centrifugadoras, tubos, ropa de protección adecuada, bloques de calentamiento, etc. (áreas de
trabajo con una carga baja-media-alta de ADN). Donde se preparan los cebadores y sondas
PCR, debe llevarse a cabo una adecuada separación de estas tareas para garantizar la
reducción de contaminación cruzada de ADN. La amplificación de ADN debe ser conducida en
una sección específica del laboratorio.

4.1.4 El espacio debe ser suficiente para permitir que las áreas de trabajo puedan mantenerse
limpias y ordenadas. El espacio requerido dependerá del volumen de los análisis realizados y de
la organización interna del laboratorio. Dicho espacio tendrá que cumplir los requisitos de la
legislación nacional, cuando ésta exista.

4.1.5 Las áreas de trabajo deben estar debidamente ventiladas y mantenidas a una temperatura
adecuada. Esto puede conseguirse con ventilación natural o forzada, o mediante el uso de aire
acondicionado. Cuando se utilice aire acondicionado, se emplearán unos filtros adecuados, que
tendrán que inspeccionarse, mantenerse y reponerse según el tipo de trabajo realizado.
Ventilación natural no es recomendada en salas limpias o salas de patógenos

4.1.6 La reducción de la contaminación puede alcanzarse considerando:

 superficies lisas en paredes, techos, suelos y mesas de trabajo (se considera que una
superficie es lisa cuando puede limpiarse fácilmente). No se recomienda el empleo de
madera como material de revestimiento;

 uniones cóncavas entre suelos, paredes y techos;

 apertura mínima de ventanas y puertas mientras se estén realizando las pruebas;

 instalación de cortinas externas;

 fácil acceso para la limpieza de las cortinas internas cuando no sea posible instalarlas en
el exterior;

 las tuberías que transportan líquidos no deben pasar por encima de las superficies de
trabajo salvo que estén provistas de un revestimiento herméticamente sellado;

 filtros para el polvo en las entradas de aire del sistema de ventilación;

 instalaciones de lavamanos separadas, de preferencia de accionamiento no manual;

 armarios hasta el techo;

 evitar las maderas rugosas y sin revestir;

 superficies de madera de instalaciones y accesorios debidamente selladas;

 materiales y equipos colocados de forma que se facilite su limpieza;

 ausencia de mobiliario, documentos u objetos que no sean los estrictamente necesarios


para la realización de las pruebas.

Esta lista no es exhaustiva, y no todos los ejemplos podrán aplicarse en todas las situaciones.
Idealmente los techos deberían ser lisos y con iluminación empotrada. Cuando esto no sea posible
(como ocurre con techos suspendidos e iluminación colgante), el laboratorio debe disponer de
evidencias documentadas demostrando que controla cualquier riesgo para la higiene y que
dispone de medios eficaces para superar esos riesgos, por ejemplo el programa de limpieza e
inspección de la superficie.

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4.1.7 Cuando los laboratorios estén situados en locales manufactureros o fábricas, el personal
debe estar al tanto de la posibilidad de contaminación de las áreas de producción y debe
demostrar que se han tomado medidas apropiadas para evitar que esto ocurra.

4.1.8 Cuando se preparan los cebadores y sondas RCP, la separación adecuada de estas tareas
debe garantizarse la minimización de la contaminación cruzada de ADN. La Amplificación ADN
debe llevarse a cabo en una sección específica del laboratorio en una sala positivamente
presurizada.

4.1.9 Las salas con presión negativa son requeridas para la manipulación de microorganismos de
alto riesgo.

4.2 Monitoreo ambiental

4.2.1 El laboratorio debe establecer un programa adecuado de vigilancia de las condiciones


ambientales que incluya, por ejemplo, el uso de placas de sedimentación y frotis de superficies.
Se asignarán unos recuentos máximos de microorganismos que se consideran aceptables y existirá
un procedimiento documentado en el que se describirán las medidas a tomar para corregir las
situaciones en que se sobrepasen dichos límites. El análisis de los datos debe detectar tendencias
en los niveles de contaminación.

4.3 Higiene

4.3.1 El laboratorio debe establecer un programa documentado de limpieza para las


instalaciones, los equipos y las superficies, teniendo en cuenta los resultados de la vigilancia de las
condiciones ambientales y la posibilidad de contaminación cruzada. Asimismo, debe disponer de
un procedimiento para el tratamiento de derrames accidentales.

4.3.2 Se debe tomar medidas para evitar la acumulación de polvo, disponiendo de espacio
suficiente para el almacenamiento, reduciendo al mínimo el trabajo con papeles en el laboratorio
y no permitiendo la presencia de plantas y objetos personales innecesarios en el área de trabajo
del laboratorio.

4.3.3 En el laboratorio microbiológico se utilizará ropa de trabajo de protección apropiada para


el tipo de ensayos que se realicen (en caso necesario, con protectores del pelo, barba, manos,
pies, etc.), y se la dejara antes de abandonar el área. Esto es especialmente importante en el
laboratorio de biología molecular, donde, por ejemplo, el paso de un área con una elevada
carga de ADN a otra con una baja carga de ADN puede producir sin querer contaminación
cruzada. En muchos casos será suficiente con utilizar una bata de laboratorio.

4.3.4 Deben estar disponibles instalaciones adecuadas para lavarse las manos y debe
establecerse una política que vele el uso apropiado de guantes, para evitar la diseminación de
microorganismos en el laboratorio.

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5. VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE ENSAYO

ISO/IEC 17025, acápite 5.4.5

Vea además ISO 12969 [12], ISO 7218 [8], ISO 17994 [13], ISO 13843 [14], ISO 16140 [15]

5.1 Selección de métodos de ensayo

El laboratorio deberá utilizar métodos de ensayo apropiados para satisfacer las necesidades
específicas en cada caso. Con este fin, es preferible utilizar métodos estándar, es decir, aquellos
publicados en normas internacionales, regionales o nacionales, o en textos científicos o
elaborados por organizaciones mundialmente reconocidas y de alta reputación. Estos métodos
son validados normalmente.

Sin embargo, otros métodos pueden ser utilizados siempre que sean validados por el laboratorio
como se describe en el punto 5.2.1 y 5.2.2. Este es el caso de métodos y métodos estándar de
diseño/desarrollo de laboratorio, utilizados fuera de su ámbito de aplicación previsto o modificado
de modo se asuma la influencia sobre los resultados de la prueba.

Además de esto, el procedimiento detallado a seguir en cada caso varía con la naturaleza del
método, es decir si se trata de un método cualitativo, semi-cuantitativo y cuantitativo. El
método/técnica determinará los aspectos de la validación a ser considerado.

Las siguientes normas pueden ayudar a los laboratorios a obtener datos relativos a la validación
de los métodos: ISO ITR 13843, ISO 16140 e ISO 17994.

5.2 Validación

La validación de los métodos de ensayo debe reflejar las condiciones reales de ensayo. Esto
puede conseguirse utilizando productos contaminados naturalmente o productos inoculados con
un nivel conocido de microorganismos contaminantes.

El analista debe estar consciente de que la inoculación de una matriz con microorganismos
contaminantes imita tan sólo de una manera superficial la presencia de contaminantes naturales.
Sin embargo, a menudo es la mejor y la única solución disponible. La extensión de la validación
necesaria dependerá del método y su aplicación.

El laboratorio debe validar los métodos normalizados aplicados a matrices que no se especifiquen
en el procedimiento normalizado.

5.2.1 Los métodos de ensayo microbiológicos cualitativos, tales como los que el resultado se
expresa en términos de detectado/no detectado, y los procedimientos de confirmación e
identificación, deben ser validados estimando, cuando sea apropiado, su especificidad,
exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, límite de detección, efecto matricial,
repetibilidad y reproducibilidad (véase en el Apéndice A para definiciones).

5.2.2 En el caso de ensayos microbiológicos cuantitativos, debe considerarse la especificidad,


sensibilidad, exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, repetibilidad,
reproducibilidad y el límite de cuantificación dentro de una variabilidad establecida y, en caso
necesario, determinar cuantitativamente estos parámetros. Las diferencias debidas a las matrices
deben tenerse en cuenta al analizar diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse
utilizando métodos estadísticos apropiados.

5.2.3 Los laboratorios deben mantener los datos sobre validación de los sistemas de ensayo
comerciales (kits) que utilicen en el laboratorio. Estos datos de validación pueden obtenerse de
pruebas de colaboración o de datos sobre validación remitidos por los fabricantes y sujetos a la
evaluación de una tercera parte (por. ejemplo., ANFOR, NordVal, MicroVal, AOAC). Si los datos
de validación no están disponibles o si éstos no son plenamente aplicables, el laboratorio debe
asumir la responsabilidad de completar la validación del método.

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5.2.4 Si se requiere una versión modificada de un método, para cumplir las mismas
especificaciones que el método original, entonces el método modificado debe ser validado para
estos parámetros que podrían ser afectados por la revisión. El diseño experimental y el análisis de
los resultados tienen que ser estadísticamente válidos.

5.2.5 Incluso cuando se haya realizado la validación, el usuario tendrá que verificar
periódicamente, de manera apropiada (por ejemplo Cuando existe un cambio en los factores
críticos), que se cumpla la ejecución documentada. Esto puede lograrse utilizando muestras
inoculadas o materiales de referencia incorporados matrices representativas.

5.3 Verificación

En el mejor de los casos, de los métodos de norma y métodos validados que son utilizados, el
laboratorio está obligado a demostrar que puede aplicarlos de forma confiable.

Esta se llama la verificación - ver más adelante "Terminología de medición analítica - Eurachem".
Para la verificación de los métodos cuantitativos el laboratorio, en la mayoría de los casos, para
determinar repetibilidad, incertidumbre de medición (véase el punto 6) y el límite de
cuantificación, y métodos cualitativos para el límite de detección.

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6. INCERTIDUMBRE DE MEDICIÓN

ISO 17025, acápite 5.4.6

Vea además ISO 19036 [9]. EA-4/16 [16], ISO 29201 [10] y HPA (UK) QSOP4 [17]

6.1 La definición internacional de la incertidumbre de medida puede encontrarse en el


Vocabulario internacional de metrología ISO: (VIM 3) [7] y el concepto en general es considerado
en la guía Eurachem de incertidumbre [28J. ISO/lEC 17025 e ISO 15189) especificando la
necesidad de los laboratorios para estimar la incertidumbre de medición teniendo en cuenta
todos componentes que pueden afectar al resultado. La medición de incertidumbre sólo puede
ser determinada por los resultados de métodos cuantitativos.

La forma general de evaluar y expresar la incertidumbre en las pruebas microbiológicas de agua


y alimentos están basados ya sea en ISOITS 19063 (para alimentos) o ISO 29201 y HPA (UK) QSOP4
(para agua). La norma ISO 29201 es más versátil, cubriendo ambos resultados, recuento de
colonias y NMP (Número más probable) y presenta dos diferentes aproximaciones de estimación
de incertidumbre (aproximación de componente o aproximación global) que pueden ser
utilizados para diferentes matrices.

6.2 Los análisis microbiológicos se encuadran en la categoría de las pruebas que no permiten
realizar un cálculo riguroso, metrológica y estadísticamente válido de la incertidumbre de medida.
En general, puede ser apropiado basar la estimación de la incertidumbre en datos sobre la
repetibilidad y la reproducibilidad exclusivamente, aunque lo ideal es incluir los sesgos (p. ej., los
sesgos detectados como resultado de la participación en ensayos de aptitud). Los distintos
componentes individuales de la incertidumbre deben identificarse y demostrar que están bajo
control y evaluar su contribución a la variabilidad de los resultados. Algunos componentes (como
los efectos del pipeteado, el pesado y las diluciones) pueden medirse directamente y evaluarse
fácilmente para demostrar que realizan una contribución insignificante a la incertidumbre global.
Otros componentes (como la estabilidad y preparación de las muestras) no pueden medirse
directamente y su contribución tampoco puede evaluarse por métodos estadísticos, pero su
importancia en la variabilidad de los resultados debe ser también considerada.

6.3 Se espera que los laboratorios acreditados que realizan análisis microbiológicos conozcan la
distribución de microorganismos en las matrices que utilizan para sus ensayos y tener eso en
cuenta a la hora de obtener sub-muestras seguido de Buenas Practicas en Laboratorio y/o
requerimientos regulatorios cuando sea aplicable. Sin embargo, no siempre es práctico que el
compuesto de medida de incertidumbre sea incluido en las estimaciones, a menos que las
necesidades del usuario determinen lo contrario. Las principales razones para que esto
acontezca, son:

 La incertidumbre de la distribución de los organismos dentro de la matriz de productos,


no es una función del rendimiento de laboratorio y pueden ser exclusivos de muestras
individuales;

 métodos de prueba deben especificar el tamaño de la muestra a utilizarse considerando


una homogeneidad pobre.

6.4 El concepto de incertidumbre no puede aplicarse directamente a los resultados de los ensayos
cualitativos como los obtenidos en los análisis de detección o en los de determinación de atributos
para fines de identificación.

No obstante, deben identificarse las distintas fuentes de variabilidad, como la homogeneidad de


los reactivos y la interpretación de los analistas, y demostrar que estas fuentes están bajo control.
Además, en las pruebas donde el límite de detección es un importante indicador de la validez del
método, la incertidumbre asociada al inóculo empleado para determinar el límite debe ser
estimada y su importancia evaluada.

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Los laboratorios deben conocer también la incidencia de resultados falsos positivos y falsos
negativos asociada a las pruebas cualitativas que realizan.

6.5 En el caso de los laboratorios microbiológicos que realizan ensayos moleculares para la
detección y cuantificación de organismos genéticamente modificados (OGMs), la medición de
incertidumbre se calcula de acuerdo a la Guía JRCIIRMM EUR 22756 EN [19].

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7. EQUIPOS – MANTENIMIENTO, CALIBRACIÓN Y VERIFICACIÓN DE SU FUNCIONAMIENTO

ISO 17025, acápite 5.5 / Vea además ISO 7218 [8], acápite 5 e ILAC P10 [20]

7.1 Mantenimiento

(En la norma ISO 7218 se facilitan directrices sobre el mantenimiento de los equipos).

7.1.1 El mantenimiento de los equipos esenciales debe ejecutarse en intervalos especificados


dependiendo de factores tales como la frecuencia de uso. Se debe mantener un registro
detallado de las operaciones realizadas. Se pueden encontrarse ejemplos del mantenimiento de
los equipos y de la frecuencia del mismo en el apéndice E.

7.1.2 Se debe prestar atención y tomar medidas para evitar la contaminación cruzada generada
por los equipos, como por ejemplo:

 El material descartable debe estar limpio o estéril, cuando sea apropiado;

 el material de vidrio reutilizable debe limpiarse adecuadamente o esterilizarse, cuando


sea apropiado;

 Idealmente, los laboratorios deben contar con autoclaves separados para


descontaminación. No obstante, se podrá utilizar un solo autoclave siempre que se tomen
las debidas precauciones para separar las cargas de descontaminación y esterilización,
y siempre que se documente el programa de limpieza para controlar las condiciones
ambientales tanto internas como externas del autoclave.

7.1.3 En general, los siguientes equipos serán mantenidos a través de limpieza y servicio, inspección
de daños, por verificación general y, si procede, esterilización:

 equipos de servicio general – aparatos de filtración, recipientes de vidrio o plástico


(matraces, tubos de ensayo), placas Petri de cristal o plástico, instrumentos de muestreo,
asas de siembra (platino, níquel/cromo o material de plástico desechable);

 baños de agua, incubadoras, cabinas microbiológicas (Flojo laminar y cabinas de


seguridad), autoclaves, homogeneizadores, refrigeradores, congeladores;

 equipo volumétrico, como pipetas, dispensadores automáticos, sembradores en espiral;

 instrumentos de medida, como termómetros, cronómetros, balanzas, pH-metros,


contadores de colonias.

7.2 Calibración y verificación de desempeño

7.2.1 El laboratorio debe establecer un programa de calibración y verificación de desempeño de


equipos que puedan influir directamente en los resultados de las pruebas. La frecuencia de esas
calibraciones y verificaciones se establecerá en función de la experiencia documentada,
estando estimada en base al tipo de necesidades y al funcionamiento previo de los equipos. Los
intervalos entre sucesivas calibraciones y verificaciones serán más cortos que el período de tiempo
durante el cual se han observado desviaciones de los equipos fuera de los límites aceptables. Se
pueden encontrar ejemplos de los intervalos de calibración y las verificaciones típicas de las
características técnicas para diferentes instrumentos de laboratorio, en los Apéndices C y D.

7.2.2 Equipos para medir la temperatura

(a) Cuando la temperatura tenga un efecto directo en el resultado de un análisis o sea crítica
para el correcto funcionamiento de un equipo, los equipos utilizados para medir la temperatura,
como termómetros de columna líquida, termopares y termómetros de resistencia de platino (TRP)
utilizados en estufas y autoclaves, tendrán que ser de una calidad apropiada para conseguir la
precisión requerida.

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Es preferible que, por razones de salud y seguridad, termómetros de líquidos en vidrio de mercurio
y tolueno no se utilicen en el laboratorio.

(b) La calibración de estos equipos debe ser trazable a estándares nacionales o internacionales
de temperatura. Sin embargo, si los requerimientos de exactitud los permiten, podrán utilizarse
instrumentos que puedan demostrar el cumplimiento de especificaciones de fabricación
apropiadas y aceptadas en el ámbito nacional o internacional

Estos instrumentos pueden utilizarse, por ejemplo, para controlar la temperatura de frigoríficos y
congeladores, y también de estufas y baños termostáticos cuando lo permita la tolerancia
admitida en torno a la temperatura definida. Es necesario verificar el correcto funcionamiento de
estos instrumentos.

7.2.3 Incubadoras, baños termostáticos, estufas

El laboratorio debe establecer inicialmente y documentar la estabilidad de la temperatura, la


uniformidad de su distribución y el tiempo necesario para conseguir las condiciones de equilibrio
en incubadoras, baños termostáticos, estufas y salas con temperatura controlada, en particular
con respecto a los usos típicos (por ejemplo, posición, espacio entre y altura de las pilas de placas
Petri). La constancia de las características registradas en la validación inicial de los equipos debe
verificarse y registrarse después de cualquier reparación o modificación importante. Los
laboratorios deben controlar la temperatura de funcionamiento de este tipo de equipos y
conservar registros.

7.2.4 Autoclaves, incluidos los preparadores de medios

A continuación se resume el procedimiento más habitual para la calibración, verificación inicial y


control del funcionamiento de estos equipos. No obstante, se reconoce que los análisis
cuantitativos de materiales y especímenes procesados en el autoclave capaces de demostrar
una variación aceptable dentro de un lote y entre diferentes lotes pueden proporcionar una
garantía de calidad equivalente.

(a) Los autoclaves deben cumplir las tolerancias de tiempo y temperatura especificadas.
Autoclaves deben ser capaces de cumplir las tolerancias de temperatura y tiempo
especificadas, no se aceptarán ollas a presión equipadas sólo con un medidor de presión.
Los sensores usados para controlar o supervisar ciclos de funcionamiento requieren
calibración y debe verificarse el correcto funcionamiento de los cronómetros.

(b) La validación inicial debe incluir estudios de desempeño (estudios de la distribución


espacial de la temperatura) para los distintos ciclos y las distintas configuraciones de la
carga que se utilicen en la práctica. Este proceso tiene que repetirse después de cada
reparación o modificación importantes (como sustitución del termostato o programador,
disposición de la carga, ciclo de operación) o cuando así lo indiquen los resultados de los
controles de calidad realizados a los medios.

Debe colocarse un número suficiente de sensores de temperatura dentro de la carga


(por ejemplo, en recipientes llenos de líquido/medio) para poder demostrar diferencias
según la colocación. En el caso de preparadores de medios, cuando no se pueda
demostrar un calentamiento uniforme de otra manera, en general es necesario utilizar dos
sensores, uno colocado al lado del sensor de temperatura y el otro remoto, el cual
generalmente será considerado apropiado. Tanto en la validación inicial como en las re-
validaciones se debe considerar la adecuación de tiempos de subida y bajada de la
temperatura, así como el tiempo a una temperatura de esterilización.

(c) Se deben establecer instrucciones claras de funcionamiento, en base a los perfiles de


calentamiento determinados para los usos típicos durante la validación inicial y las
posteriores. Debe establecer criterios de aceptación/rechazo y mantener un registro de
las operaciones de autoclave, incluida la temperatura y el tiempo, para cada ciclo.

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(d) El monitoreo puede realizarse mediante una de las siguientes maneras:

(i) utilizando un termopar y un aparato registrador para obtener un gráfico o una


ilustración;

(ii) por observación directa y registro de la temperatura máxima alcanzada y el tiempo


que se mantiene esa temperatura.

Además de controlar directamente la temperatura de un autoclave, puede comprobarse la


eficacia de su funcionamiento durante cada ciclo mediante la utilización de indicadores
químicos o biológicos para fines de esterilización/descontaminación.

La cinta de autoclave o las tiras indicadoras deben utilizarse sólo para distinguir que una carga
ha sido procesada, pero no para demostrar que ha finalizado un ciclo aceptable.

7.2.5 Pesas y balanzas

Las pesas y balanzas deben calibrarse a intervalos regulares, demostrando su trazabilidad (de
acuerdo al uso previsto).

7.2.6 Material volumétrico

(a) Puede utilizarse equipo volumétrico, como son dispensadores automáticos,


dispensadores/diluidores, pipetas manuales o automáticas y pipetas desechables. Los
laboratorios deben realizar una verificación inicial del material volumétrico y, a partir de
ahí, controles periódicos para garantizar que los equipos cumplen en todo momento las
especificaciones requeridas. Esta verificación no será necesaria para el material de vidrio
que haya sido certificado para una tolerancia específica. En los equipos se verificará la
exactitud del volumen dispensado frente al volumen prefijado (para varios volúmenes
cuando se trate de instrumentos de volumen variable) y se medirá la precisión de los
volúmenes dispensados repetidas veces.

(b) Para el material volumétrico desechable “de un solo uso”, los laboratorios deberán
obtener suministros de empresas con un sistema de calidad reconocido y relevante.
Después de la validación inicial de la idoneidad del material, se recomienda realizar
controles aleatorios de su exactitud. Si la empresa proveedora no tiene un sistema de
calidad reconocido, el laboratorio debe verificar cada lote de material para determinar
si son adecuados.

7.2.7 Ciclos Termales

Los laboratorios deben verificar la temperatura, velocidad de rampa, los rebasamientos/picos,


tiempo de espera.

7.2.8 Otros equipos

Los conductivímetros, los medidores de oxígeno, los pH-metros y otros instrumentos similares deben
verificarse periódicamente o antes de cada uso. Los tampones utilizados en estas verificaciones
deben conservarse en condiciones apropiadas y marcarse con la fecha de caducidad.

Si la humedad influye en el resultado del ensayo, los higrómetros deberán calibrarse, siendo la
calibración trazable a patrones nacionales o internacionales.

Los cronómetros, incluido los de los autoclaves, deben verificarse utilizando un cronómetro
calibrado o la señal horaria nacional.

Cuando se utilizan centrifugadoras en los procedimientos de ensayo, debe evaluarse si la fuerza


centrífuga se puede considerar crítica. En el caso de que sea crítica, la centrifugadora tendrá que
ser calibrada.

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8. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

ISO 17025, acápites 4.6 y 5.5

Ver además ISO/TS 11133-1 [21] e ISO/TS 11133 - 2 [22]

8.1 Reactivos

El laboratorio debe asegurarse de que la calidad de los reactivos utilizados sea apropiada para
los ensayos realizados. Se debe verificar la aptitud de cada lote de reactivos críticos para el
ensayo, al inicio y durante su período de validez, utilizando microorganismos de control positivo y
negativo que sean trazables a colecciones de cultivos nacionales o internacionales reconocidas.

8.2 Medios preparados internamente

8.2.1 Cuando sea necesario, debe verificarse que los medios de cultivo, diluyentes y otras
suspensiones preparadas internamente tengan las características adecuadas en atención a:

 recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés,

 inhibición o supresión de los microorganismos no deseados,

 propiedades bioquímicas (diferenciales y diagnósticas),

 propiedades físicas (por ejemplo, pH, volumen y esterilidad).

Los procedimientos cuantitativos para la evaluación de recuperación o supervivencia deben


ejecutarse de acuerdo a la norma ISO 11133.

8.2.2 La materia prima (tanto fórmulas comerciales deshidratadas como componentes


individuales) deben conservarse en las condiciones apropiadas; por ejemplo, en un lugar fresco,
seco y oscuro. Todos los recipientes, especialmente los que contengan medios deshidratados,
deben estar sellados herméticamente. No deben utilizarse medios deshidratados que presenten
endurecimiento o agrietamiento, o un cambio de color. Para la preparación de medios debe
utilizarse agua destilada, des-ionizada o generada por ósmosis inversa, libre de sustancias
bactericidas, inhibidoras o interferentes, salvo que el método del ensayo especifique otra cosa.

8.2.3 Debe determinarse y verificarse el período de validez de los medios preparados en


condiciones de conservación especificadas.

8.3 Medios listos para su uso

8.3.1 Todos los medios, incluyendo diluyentes y otras suspensiones, fluidos adquiridos listos para su
uso o que son parcialmente completos, deben ser validados antes de su uso, como se indica en
el acápite8.2.1. La evaluación de su efecto en la recuperación o supervivencia de los
microorganismos de interés y la inhibición o supresión de los microorganismos no deseados tiene
que ser completamente cuantitativa; se deben evaluar los atributos (por ejemplo, propiedades
físicas y bioquímicas) utilizando criterios objetivos.

8.3.2 Cuando el fabricante de los medios adquiridos y listos para su uso o parcialmente completo,
disponga de un sistema de calidad reconocido (por ejemplo, certificación según la norma ISO
9000), y los medios tiene un control de calidad acorde a la norma ISO 11133, la información
pertinente (certificados) debe ser examinados para la aceptabilidad, no obstante no es necesario
repetir el control de la calidad. Los controles del usuario del laboratorio únicamente pueden incluir
controles iniciales para cada nuevo fabricante y controles indirectos mediante procedimientos
internos de control de calidad. En otras circunstancias, será necesario realizar controles
adecuados de cada lote recibido, según la norma ISO 11133.

8.3.3 Como parte de la validación, el usuario del laboratorio tiene que estar debidamente
informado de las especificaciones de calidad del fabricante, que como mínimo incluirán lo
siguiente:

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 Nombre de los medios y lista de componentes, incluido cualquier suplemento

 Período de validez y criterios de aceptabilidad aplicados

 Condiciones de conservación

 Plan y frecuencia de muestreo

 Control de esterilidad

 Control del crecimiento de los microorganismos objetivo y de los microorganismos no


deseados (con referencias a sus colecciones de cultivos) y criterios de aceptabilidad

 Controles físicos y criterios de aceptabilidad aplicados

 Fecha de emisión de las especificaciones

Todo lo anterior, incluyendo la labor de validación, debe tenerse en cuenta por el laboratorio
para establecer criterios de aceptabilidad para los lotes de material apropiado para sus
necesidades de prueba.

8.3.4 Los lotes de medios deben estar debidamente identificados. Cada lote recibido debe ir
acompañado de evidencias del cumplimiento de las especificaciones de calidad. El laboratorio
debe asegurarse de que el fabricante notifique cualquier cambio en las especificaciones de
calidad.

Nota:

Lote: Unidad homogénea y completamente trazable, de un medio de cultivo o reactivo referido


a una cantidad definida de un producto semi-elaborado o producto final, que es coherente en
Tipo y Calidad, los cuales han pasado los requerimientos de producción (control de proceso),
pruebas de rendimiento, y que hayan sido elaborados en un período de producción, para lo cual
se les asigna el mismo número.

8.4 Etiquetado

El laboratorio debe asegurarse de que todos los reactivos (incluyendo las soluciones de reserva),
medios, diluyentes y otras suspensiones estén debidamente etiquetadas, indicando, según sea
apropiado, identidad, concentración, condiciones de conservación, fecha de preparación,
fecha de caducidad validada y/o períodos recomendados de almacenamiento. Asimismo, los
registros deben permitir la identificación de la persona responsable de la preparación.

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9. MATERIALES DE REFERENCIA Y CEPAS DE REFERENCIA

ISO/lEC 17025, acápite 5.6.3

Ver además ISO/TS 11333 [21, 22]

9.1 Materiales de referencia

Los materiales de referencia y los materiales de referencia certificados (véase la definición en el


Apéndice A) proporcionan la trazabilidad esencial en las mediciones y son utilizados, por ejemplo:

 Para demostrar la exactitud de los resultados,

 Para calibrar equipos,

 Para controlar la calidad del laboratorio,

 Para validar métodos,

 Para permitir la comparación de métodos,

 Para demostrar calidad del medio de cultivo

 Para demostrar la ejecución consistente de los kits.

Siempre que sea posible, los materiales de referencia deben utilizarse con matrices apropiadas.

9.2 Cepas de referencia

9.2.1 Se requieren cepas de referencia trazables para demostrar que los medios (incluidos los kits
de análisis) presentan características aceptables, para validar métodos y para verificar /controlar
el desempeño en curso. Para demostrar trazabilidad, el laboratorio debe utilizar cepas de
referencia de microorganismos obtenidos directamente de una colección nacional o
internacional reconocida, cuando exista alguna. En caso de no que estas cepas no estén
disponibles, alternativamente se pueden utilizar cepas comerciales siempre que el laboratorio
pueda demostrar que todas las propiedades relevantes son equivalentes, en el momento de su
uso.

9.2.2 Las cepas de referencia podrán ser sub-cultivadas una vez para obtener cepas de reserva,
se debe realizar controles de pureza y ensayos bioquímicos, en paralelo, cuando sea necesario.
Se recomienda conservar las cepas de reserva en alícuotas profundamente congeladas o
liofilizadas. Las cepas de trabajo de uso rutinario deben ser sub-cultivos primarios obtenidos del
cepas de reserva (véase en el Apéndice B la preparación de cepas de trabajo). Si las cepas de
reserva se han descongelado, no deben volver a congelarse y reutilizarse.

9.2.3 Las cepas de trabajo no deben ser sub-cultivadas, a menos que así se requiera y se defina
en un método estandarizado o que el laboratorio pueda aportar evidencias documentadas de
que no se ha producido ningún cambio en ninguna propiedad importante. Las cepas de trabajo
no deben ser sub-cultivadas para sustituir las cepas de reserva. Los derivados comerciales de las
cepas de referencia pueden utilizarse sólo como cepas de trabajo.

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10. MUESTREO

ISO 17025, acápite 5.7

Vea además ISO 7218 [8], párrafo 8 e ISO 19458 [23]

10.1 En muchos casos, los laboratorios de ensayo no son responsables del muestreo primario, para
obtener los ítems de ensayo. En el caso de que sean responsables, es muy recomendable que el
muestreo esté cubierto por un sistema de certificación de calidad, e idealmente, por una
acreditación.

10.2 El transporte y conservación de las muestras deben hacerse en condiciones apropiadas para
mantener la integridad de las muestras (por ejemplo, refrigeradas o congeladas, según sea
necesario). Dichas condiciones deben ser monitoreadas, y se debe llevar un registro de las mismas.
Cuando sea apropiado, se documentará claramente los datos de la persona responsable del
transporte, la conservación de las muestras, entre el muestreo y su entrega al laboratorio de
ensayo. Una vez obtenidas, las muestras se analizarán lo antes posible, después de la toma de
muestras y deben ajustarse a las normas pertinentes ya sean nacionales o internacionales.

10.3 El muestreo debe ser realizado únicamente por personal debidamente calificado. Cuando
el laboratorio es responsable del muestreo, el personal involucrado deberá estar autorizado para
muestreo. Se efectuará en condiciones asépticas utilizando material estéril. Se debe monitorear y
registrar las condiciones ambientales, como la contaminación atmosférica y la temperatura, en
el lugar del muestreo. Se registrará la hora en que se realiza el muestreo.

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11. MANIPULACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE MUESTRAS

ISO/IEC 17025, acápites 5.7 y 5.8

Ver además ISO 7218 [8], párrafo 8, ISO 6887 [24] y norma ISO 19458 [23]

11.1 La flora microbiana puede ser sensible a factores tales como temperatura o duración de
almacenamiento y transporte, por lo que es importante verificar y registrar el estado de la muestra
cuando se recibe en el laboratorio.

11.2 El laboratorio debe tener procedimientos para la entrega e identificación de muestras. Si la


muestra es insuficiente o se encuentra en mal estado por deterioro físico, temperatura
inadecuada, empaque dañado o etiquetado defectuoso, el laboratorio debe consultar con el
cliente antes de decidir si analiza o rechaza la muestra. En cualquier caso, se debe mantener un
registro e indicar la condición de la muestra en el reporte de ensayo.

11.3 El laboratorio debe registrar toda la información relevante y, en particular, lo siguiente:

(a) fecha y, cuando se requiera, la hora de recepción de la muestra;

(b) estado de la muestra en el momento de su entrega y, cuando sea necesario, temperatura;

(c) características de la operación de muestreo (fecha de muestreo, condiciones de muestreo,


etc.).

11.4 Las muestras que se encuentren a la espera de ser analizadas deben almacenarse en
condiciones adecuadas para reducir al mínimo cualquier modificación en la población
microbiana presente. Las condiciones de conservación deben ser definidas y registradas.

11.5 El envase y etiquetado de las muestras puede estar altamente contaminado y las muestras
deben manipularse y almacenarse con precaución para evitar que se propague la
contaminación.

11.6 El sub-muestreo realizado por el laboratorio, inmediatamente antes del ensayo, es


considerado parte del método de ensayo y debe efectuarse conforme a normas nacionales o
internacionales, si es que existen, o a métodos internos validados. Los procedimientos de sub-
muestreo deben diseñarse teniendo en cuenta la distribución heterogénea de los
microorganismos (las directrices generales pueden encontrarse en las normas ISO 6887 e ISO
7218).

11.7 Se debe contar con un procedimiento escrito y documentado para la retención y eliminación
de muestras. Las muestras deben conservarse hasta que se hayan obtenido los resultados del
ensayo, o más tiempo según se requiera. Cuando se sepa que algunas porciones de muestras de
ensayo del laboratorio están altamente contaminadas, deben descontaminarse antes de su
eliminación (véase el punto 12).

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12. ELIMINACIÓN DE RESIDUOS CONTAMINADOS

ISO/IEC 17025, acápite 5.8

Ver además ISO 7218 [8]

La correcta eliminación de materiales contaminados puede no afectar directamente a la calidad


de los análisis de las muestras, aunque se deben diseñar procedimientos para reducir al mínimo la
posibilidad de contaminación del entorno o lugar donde se realiza el ensayo o los materiales
utilizados en el mismo. No obstante, es un aspecto de buena gestión de laboratorio y debe
respetar la legislación nacional e internacional sobre medio ambiente, salud y seguridad.

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13. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS/CONTROL DE CALIDAD

ISO 17025, acápite 5.9

Ver además EA-4/18 [25], Guía de ensayos de aptitud de Eurachem [26]

13.1 Control de calidad interno

13.1.1 El control de calidad interno consiste en todos los procedimientos realizados por un
laboratorio para la evaluación continua de su trabajo. El principal objetivo es asegurar la
coherencia de los resultados obtenidos diariamente y la conformidad con criterios establecidos.

13.1.2 Es necesario establecer un programa de controles periódicos, para demostrar que la


variabilidad (por ejemplo, entre analistas y entre equipos o materiales, etc.) está controlada. Estos
ensayos, deben estar incluidos en el alcance de acreditación del laboratorio. El programa puede
incluir:

 el uso de muestras inoculadas, con niveles de contaminación variables, incluyendo flora


objetivo y circundante.

 el uso de muestras contaminadas inoculadas/naturales de un rango de matrices.

 el uso de materiales de referencia (incluidos los materiales utilizados en ensayos de


aptitud)

 ensayos replicados

 evaluación replicada de los resultados de los ensayos, por ejemplo recuento de colonias
en cajas Petri realizados por dos analistas

El programa de control de calidad interno debe estar adaptado a la frecuencia real de las
pruebas realizadas por el laboratorio. Se recomienda que, siempre que sea posible, los ensayos
incluyan controles de monitoreo de rendimiento. También se recomienda que los datos de los
materiales de referencia y muestras inoculadas se programen para contribuir con la evaluación
de las tendencias de manera visual.

13.1.3 En circunstancias especiales, un laboratorio puede estar acreditado para realizar un ensayo
que rara vez se demanda. Se reconoce que, en tales casos, un programa continuo de control
interno de la calidad no siempre será apropiado, siendo preferible un sistema que se realice en
paralelo al ensayo y que demuestre que los resultados son satisfactorios.

Sin embargo, esto no elimina la necesidad de participar en programas de ensayos de aptitud en


una frecuencia aceptable. En cualquier caso, el laboratorio debe ser consciente de los riesgos
inherentes asociados con este tipo de planteamiento y tomar todas las medidas apropiadas.

13.2 Control de calidad externo (ensayos de aptitud)

13.2.1 Los laboratorios deben participar regularmente en ensayos de aptitud (EA), relacionados
con el alcance de su acreditación. Se debe dar preferencia a los programas de ensayos de
aptitud que utilicen matrices apropiadas.

En algunos casos concretos, esta participación puede ser obligatoria.

13.2.2 Participación en programas de ensayos de aptitud es obligatoria, siempre que los


programas adecuados estén disponibles. Si este no es el caso, el laboratorio debe participar en
comparaciones inter-laboratorio organizadas por un número suficiente de laboratorios, sobre la
base de un protocolo bien documentado.

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13.2.3 Los laboratorios deben utilizar el control externo de calidad no sólo para detectar
desviaciones en los resultados obtenidos, sino también para verificar la validez de todo el sistema
de calidad.

13.2.4 Aunque los organismos de acreditación pueden especificar un mínimo de participación en


programas de ensayos de aptitud, es responsabilidad del laboratorio demostrar que la frecuencia
y duración de su participación es adecuado para su alcance. El documento EA-4/18 puede dar
apoyo útil con el uso de sub-disciplinas, es decir, un área de competencia técnica definida por
un mínimo de técnicas de medición, propiedad y productos, que están relacionados.

Esto facilita la optimización de la amplitud de participación en ensayos de aptitud. Además, para


el uso y la interpretación de esquemas PT [26] esta guía Eurachem, puede ayudar en la
interpretación de los resultados de ensayos de aptitud.

13.2.5 Se alienta a los laboratorios para suscribirse a normas acreditadas ISO/lEC 17043 [27],
sistemas PT; otros proveedores deberán considerarse únicamente en caso de que el laboratorio
haya evaluado su competencia.

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14. INFORMES DE LOS ENSAYOS

ISO 17025, acápite 5.10

Ver además ISO 19036 [9], ISO 8199 [11], ISO 7218 [8]

14.1 En métodos cuantitativos, los resultados son expresados como un número de Unidades
Formadoras de Colonias (UFC) por volumen o gramos de muestra analizados. Con conteos por
debajo de 10 UFC por placa, la precisión decrece significativamente y se aconseja a los
laboratorios reflejar este hecho en reportes de ensayo. Si el resultado del recuento es negativo,
debe expresarse como “no detectado para una unidad definida” o “por debajo del límite de
detección para una unidad definida”. Si se prefiere, y con el fin de cumplir con las regulaciones
nacionales técnicas y de salud, los resultados pueden reportarse también como “Cero para para
una unidad definida”.

14.2 Los resultados de ensayos cualitativos debe ser reportado como " detectado o no detectado
en una cantidad o volumen definido". También pueden ser expresados como "inferior a un
determinado número de microorganismos para una unidad definida” donde el número específico
de organismos supera el límite de detección del método y esto ha sido acordado con el cliente.

14.3 Cuando en el informe de un ensayo se exprese una estimación de la incertidumbre, tendrá


que aclararse al cliente cualquier limitación existente (especialmente si la estimación no incluye
la contribución de la distribución de microorganismos dentro de la muestra).

14.4 Los laboratorios pueden verificar si las normas utilizadas tienen sus requerimientos específicos
en relación a la expresión de los resultados. Los ejemplos incluyen: ISO 11731-2:2004 Calidad del
agua --- Detección y enumeración de Legionella - Parte 2: Método de filtración por membrana
para agua con recuentos de bacterias bajos e ISO 6222:1999 Calidad del agua --- Enumeración
de microorganismos cultivables --- Recuento de colonias por inoculación en un medio de cultivo
agar nutriente.

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Apéndice A Glosario de términos

Calibración Conjunto de operaciones que permiten establecer, en condiciones específicas, la relación


existente entre los valores indicados por un instrumento de medida o un sistema de
medida, o los valores representados por una medida material o un material de referencia,
y los valores correspondientes obtenidos mediante un patrón de referencia.
NOTA 1 La calibración puede ser expresada por una afirmación, función de calibración,
diagrama de calibración, curva de calibración o tabla de calibración. En algunos casos,
puede consistir en una corrección aditiva o multiplicativa de la indicación con la
incertidumbre de medición asociada.
NOTA 2 La calibración no debe ser confundida con ajustes al sistema de medición,
comúnmente denominado “Auto-calibración”, ni con la verificación de la calibración.
NOTA 3 A menudo, el primer paso en la definición arriba descrita se percibe como
calibración.
[VIM 3]

Material de referencia Material de referencia, acompañado de documentos expedidos por un organismo con
certificado autoridad y que proporciona uno o más valores de propiedad, con incertidumbres
asociadas y trazabilidad, utilizando procedimientos válidos.
[VIM 3]

Límite de detección Aplicado a análisis microbiológicos cualitativos – Número mínimo de microorganismos que
pueden ser detectados, pero en cantidades que no pueden estimarse con precisión.

Límite de Aplicado a análisis microbiológicos cuantitativos – Número mínimo de microorganismos


cuantificación dentro de una variabilidad definida que puede determinarse en las condiciones
experimentales del método evaluado.

Precisión de medición Grado de concordancia entre indicaciones o valores medidos de cantidad obtenidos por
mediciones repetidas en el mismo u otro objeto similar, bajo condiciones similares.
[VIM 3]

Desviación negativa Ocurre cuando el método alternativo da un resultado negativo sin confirmación y el
método de referencia da un resultado positivo. Esta desviación se convierte en un
resultado negativo falso cuando puede demostrarse que el resultado verdadero es
positivo.

Desviación positiva Ocurre cuando el método alternativo da un resultado positivo sin confirmación y el
método de referencia da un resultado negativo. Esta desviación se convierte en un
resultado positivo falso cuando puede demostrarse que el resultado verdadero es
negativo.

Cultivos de referencia Término colectivo que se refiere a cepas de referencia, cepas de reserva y cultivos de
trabajo.

Material de referencia Material suficientemente homogéneo y establecido con referencia a propiedades


específicas que han sido establecidas para ajustarse a su uso en la medición o en la
examinación de las propiedades nominales.
[VIM3]

Método de referencia Método investigado a fondo, que describe con claridad y exactitud las condiciones y los
procedimientos necesarios para medir los valores de una o más propiedades y que ha
demostrado tener una exactitud y una precisión apropiadas para el uso que pretende
hacerse del mismo, de manera que puede utilizarse para evaluar la exactitud de otros
métodos empleados para realizar la misma medición y, en particular, para caracterizar un
material de referencia. En general se trata de un método normalizado nacional o
internacional.

Cepas de reserva Un set de cepas idéntica separados obtenidos de un único sub-cultivo proveniente de una
cepa de referencia. [ISO 11133]

Cepas de Referencia Microorganismos definidos por lo menos al nivel de género y especie, catalogados y
descritos en función a sus características y preferiblemente de origen conocido. [ISO
11133]. Normalmente se obtienen de una colección nacional o internacional reconocida.

Exactitud relativa Grado de concordancia entre los resultados del método evaluado y los obtenidos
utilizando un método de referencia reconocido.

Repetibilidad Precisión de medición bajo un conjunto de condiciones de repetibilidad de medición.

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[VIM 3]

Condición de i. Para métodos cuantitativos


Repetibilidad Condiciones de medida, de un conjunto de condiciones que incluye el mismo
procedimiento de medición, mismo operador, mismo sistema de medición, mismas
condiciones de funcionamiento y en el mismo lugar, y las mediciones repetidas en el
mismo u objetos similares en un corto período de tiempo. [VIM3]
ii. Para métodos cualitativos
Una interpretación análoga a lo indicado previamente se podría utilizar, como:
Condiciones de ensayo… (En vez de condiciones de medición…)

Reproducibilidad Precisión de medición bajo un conjunto de condiciones de reproducibilidad de medición.


[VIM 3]

Condición de i. Para métodos Cuantitativos


reproducibilidad Condición de medición, de un conjunto de condiciones que incluye diferentes
ubicaciones, operadores, sistemas de medición y mediciones repetidas en el mismo u
otros objetos similares. [VIM 3]
ii. Para métodos Cualitativos
Una interpretación análoga a lo indicado previamente se podría utilizar, como:
Condiciones de ensayo… (En vez de condiciones de medición…)

Sensibilidad Fracción del número total de cultivos o colonias positivos que son asignados
correctamente en una presunta inspección. [ISO/TR 13843]

Especificidad Fracción del número total de cultivos o colonias negativos que son asignados
correctamente en una presunta inspección. [ISO/TR 13843]

Validación La confirmación por examinación y la provisión de pruebas objetivas, de que se han


cumplido los requerimientos para un uso específico o una aplicación específica. [ISO/IEC
17025]
Nota: Validación primaria. Un proceso exploratorio con el objetivo de establecer los límites
operacionales y las características de rendimiento de un método nuevo, modificado o de
lo contrario mal caracterizado. Debería resultar una especificación numérica y
especificaciones descriptivas para el desempeño e incluir una descripción detallada y no
ambigua del objeto de interés (colonia positiva, tubo o placa). [ISO 13843]

Verificación Provisión de una evidencia objetiva, de que se han cumplido los requisitos establecidos.
[VIM 3]
Nota: Verificación (validación secundaria) se lleva a cabo cuando un laboratorio procede
a implementar un método desarrollado en otros lugares. La verificación se centra en reunir
evidencia de que el laboratorio es capaz de cumplir con las especificaciones establecidas
en la validación primaria. [Adoptado de la norma SO 13843]

Cultivo de trabajo Sub-cultivo primario obtenido de una cepa de reserva. [ISO 11133]

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Apéndice B. Uso General de Cultivos de Referencia

Cepa de referencia a partir del código fuente reconocido por organismo de


acreditación, p. ej. cultura nacional selección

Una vez reconstituido y Sub-Cultivado

Cepas de Reserva
Congelado, secado, almacenado en nitrógeno líquido, ultra congelados etc.
No permitido
Condiciones específicas y tiempos de almacenamiento recomendados

Mantener en condiciones especificadas

Una vez Sub-


cultivo
Descongelar y reconstituir

Cultivo de trabajo
En condiciones especificadas y tiempo de almacenamiento recomendado

Uso rutinario

* Controles paralelos de pureza y pruebas bioquímicas cuando corresponda.

Todas las partes del proceso deberán ser completamente documentadas y deben mantenerse
registros detallados de todos los pasos.

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Apéndice C Guía para calibración y verificación de calibración


Esta información es de orientación y la frecuencia está basada en la necesidad, tipo y
rendimiento previo del equipo.

Tipo de Equipamiento Requerimiento Frecuencia Requerida


Termómetros de Re-calibración totalmente trazable Cada 5 años
Referencia Punto único (por ejemplo, verificación
(Líquido en vidrio) del punto de hielo) Anualmente

Termopares de Re-calibración totalmente trazable Cada 3 años Anual


referencia
Verificación en relación al termómetro Anualmente
de referencia
Termómetros de trabajo Verificación en relación al termómetro a Anualmente
Termopares de trabajo punto de hielo y/o rango de
temperatura de trabajo
Balanzas Calibración totalmente trazable Anualmente en los primeros
3 años, seguido por menor
frecuencia, basado en el
desempeño satisfactorio
Pesas de calibración Calibración totalmente trazable Cada 5 años
Verificación de pesa(s) Comparación con un peso calibrado o Cada 2 años
verificación del balance,
inmediatamente después de una
calibración trazable.
Material volumétrico de Calibración gravimétrica de tolerancia Anualmente
Vidrio requerida.
Pipeteadores/Pipetas Calibración totalmente trazable Anualmente
Microscopios Calibración trazable de la etapa Al inicio
micrómetros (donde corresponda)
Higrómetros Calibración trazable Anualmente
Centrífugas Calibración trazable comparación Anualmente
respecto a un tacómetro independiente,
según corresponda.

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Apéndice D Guía sobre validación de equipos y la verificación de resultados

Esta información es proporcionada con fines de orientación, y la frecuencia estará basada en la


necesidad, tipo y rendimiento previo del equipo.

Tipo de Equipamiento Requerimiento Frecuencia Requerida


Equipos de temperatura (a) Establecer uniformidad y (a) Inicialmente, periódicamente, en
controlada (incubadoras, estabilidad de la una frecuencia documentada, y
baños, congeladoras, temperatura después de reparaciones o
refrigeradoras) modificaciones.
(b) Controlar la temperatura (b) Diariamente / cada uso

Hornos de esterilización (a) Establecer la estabilidad y (a) Inicialmente, periódicamente, en


uniformidad de la una frecuencia documentada, y
temperatura después de reparaciones o
(b) Controlar la temperatura modificaciones.
(b) Diariamente / cada uso

Autoclaves (a) Establecer las características (a) Inicialmente, periódicamente, en


de las cargas/ciclos una frecuencia documentada, y
(b) Controlar la después de reparaciones o
temperatura/tiempo modificaciones.
(b) Diariamente / cada uso

Cabinas de seguridad (a) Determinar su rendimiento (a) Inicialmente, cada año y después
de reparaciones o modificaciones
(b) Monitoreo microbiológico (b) Semanalmente
(c) Monitoreo de flujo de aire (c) Diariamente / cada uso

Cabinas de Flujo de aire (a) Determinar el rendimiento (a) Al inicio y después de


laminar (b) Verificar con placas estériles reparaciones o modificaciones
(b) Semanalmente

Temporizadores o Cronómetros Comparar respecto a tiempo Anualmente


oficial nacional

Microscopios Verificar la alineación Diariamente / cada uso

pH-metros Ajustar utilizando al menos dos Diariamente / cada uso


buffers de adecuada calidad

Balanzas Verificar el cero, y contrastar la Diariamente / cada uso


lectura con el peso verificado

Deionizadores y unidades de (a) Comprobar conductividad (a) Semanal


osmosis inversa (b) Comprobar contaminación (b) Mensual
microbiana

Diluidores Gravimétricos (a) Controlar peso del volumen (a) Diariamente / cada uso
dispensado
(b) Comprobar la tasa de (b) Diariamente / cada uso
dilución

Dispensadores de Medios Verificar volumen dispensado Cada ajuste o sustitución

Pipeteadores /pipetas Compruebe exactitud y precisión Regularmente (a definirse teniendo en


del volumen dispensado por cuenta la frecuencia y la naturaleza de
método gravimétrico uso)

Aplicadores Espiral (a) Establecer el rendimiento (a) Al inicio y anualmente


versus el método
convencional.
(b) Consultar la condición en
los puntos de inicio y fin (b) Diariamente / cada uso

(c) Verificar volumen


dispensado (c) Mensual

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Tipo de Equipamiento Requerimiento Frecuencia Requerida

Contadores de colonias. Comparar versus número Anualmente


contado manualmente.

Centrifugadoras. Comparar la velocidad con un Anualmente


tacómetro calibrado e
independiente.

Frascos Comprobar con indicador Diariamente / cada uso


anaerobios/incubadoras. anaeróbica

Entorno de laboratorio. Monitorear el aire y la superficie Semanal para recuento total y moldes:
de contaminación microbiana Semestralmente para patógenos o de
utilizando por ejemplo, la forma en que el laboratorio decida
muestreadores de aire, placas de en base a las actividades y las
sedimentación, placas de tendencias históricas y los resultados.
contacto o hisopos.

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Apéndice E Guía sobre mantenimiento de equipo

Esta información es proporcionada con fines de orientación, y la frecuencia estará basada en la


necesidad, tipo y rendimiento previo del equipo.

Tipo de Equipamiento Requerimiento Frecuencia Requerida


(a) Incubadoras Limpiar y desinfectar las superficies (a) Mensual
(b) Frigoríficos internas (b) Cuando se requiera (por
(c) Congeladores, hornos ejemplo, cada 3 meses)
(c) Cuando se requiera (por
ejemplo, anualmente)
Baños de agua. Vaciar, limpiar, desinfectar y volver a Mensualmente, o cada 6 meses si
llenar. utiliza biocida
Centrifugadoras. (a) Mantenimiento (a) Anualmente
(b) Limpiar y desinfectar (b) Cada uso
Autoclaves (a) Realizar controles visuales de la (a) Periódicamente, como
empaquetadura limpiar/drenar la recomendado por el
cámara fabricante.
(b) Mantenimiento completo (b) Anualmente o según lo
recomendado por el
(c) Control de seguridad del recipiente fabricante
a presión (c) Anualmente.

Armarios de seguridad. Mantenimiento completo control Anualmente, o según lo


Cabinas de flujo laminar mecánico. recomendado por el fabricante
Microscopios. Servicio de mantenimiento completo. Anualmente
pH-metros. Limpieza de electrodo Cada uso
Balanzas, diluidores (a) Limpieza (a) Cada Uso
gravimétricos. (b) Mantenimiento (b) Anualmente
Imágenes fijas Limpiar y de-escalar Según sea necesario (por
ejemplo, cada 3 meses).
De ionizadores, unidades de Reemplazar cartucho / membrana. Según lo recomendado por el
ósmosis inversa. fabricante
Frascos anaerobios. Limpiar/desinfectar. Después de cada uso.
Medios dispensadores, equipo Descontaminar, limpiar y esterilizar según Cada uso
volumétrico, pipetas, equipos y corresponda
servicios generales.
Aplicadores espiral (a) Mantenimiento (a) Anualmente
(b) Descontaminar, limpiar y esterilizar (b) Cada uso
Laboratorio. (a) Limpiar y desinfectar las superficies (a) Diariamente y durante el uso
de trabajo (b) Semanal o más a menudo si
(b) Limpiar los pisos, desinfectar los fuese necesario
sumideros y depósitos de lavado. (c) Cada 3 a 12 meses
(c) Limpiar y desinfectar las superficies dependiendo del tipo de
de otro tipo trabajo de laboratorio

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