Trabajo realizado por: Blanca Ruiz Alonso y Javier Gómez Piñero

Autor: Javier Gómez Piñero

Asignatura de Laboratorio integrado de biología molecular e ingeniería
genética del Grado de Biotecnología, Universidad de Cádiz.

CUESTIONES DE DISEÑO DE PRIMERS PARA INCLUIR EN EL INFORME

DISEÑO DE PRIMERS
1. Teniendo en cuenta los criterios explicados anteriormente:

a) Diseña un par de oligos que amplifiquen un fragmento en la región 5’ de la

secuencia problema de aproximadamente 300 pb. Indica la secuencia de los oligos en
la dirección 5’-3’.

Primer forward: CACGCAACATTTCGCTCTCT

Primer reverse: TATGAAGAAAAAGGTGTCCA

b) Indica las siguientes características de los oligos: posición en el 5’, tamaño del oligo,
Tm, dG, GC % y GC% en el extremo 3’.
2. Diseña 2 oligos reverse que amplifiquen un fragmento de la secuencia problema si el oligo
forward es el siguiente:

5’-CAAATAAGTTACATGGTCACG-3’

teniendo en cuenta las siguientes restricciones:

1. La distancia mínima entre los primer debe ser de 100 pb.

2. Tm debe estar entre 50-52 ºC.

3. El tamaño del oligo debe ser entre 20-22 nucleótidos.

Reverse 1: CTGAGGTTTCGTTTTTAGAG

Reverse 2: GGCATAGTTGTTTACCTGTA

Indica las secuencias en la dirección 5’-3’y las siguientes características de los oligos: posición
en el 5’, tamaño del oligo, Tm, dG, GC % y GC% en el extremo 3’.
3. Señala en la secuencia problema, la posición en el 5’ de los primers reverse que se
muestran a continuación:

-5’-TTGAAGGTCTCCATTTGTCA-3’

3’-ACTGTTTACCTCTGGAAGTT-5’

Complementaria: 3’-TGACAAATGGAGACCTTCAA-5’

-5’-ATTATCCACTTCCTGTTCACT-3’

3’-TCACTTGTCCTTCACCTATTA-5’

Complementaria: 3’-AGTGAACAGGAAGTGGATAAT-5’
-5’-GTGCTTCTTGTAAGTCTGAATG-3’

3’-GTAAGTCTGAATGTTCTTCGTG-5’

Complementaria: 3’-CATTCAGACTTCAAGAAGCAC-5’

-5’-AAATGTCAATCCACCCTCAGT-3’

3’-TGACTCCCACCTAACTGTAAA-5’

Complementario: 3’-ACTGAGGGTGGATTGACATTT-5’

-5’-GTGTGTAAAAACATGGAAAGTC-3’

3’-CTGAAAGGTACAAAAATGTGTG-5’

Complementaria: 3’GACTTTCCATGTTTTTACACACA-5’
TGTGCTCGCTTTAAAAAGGTAGGCAGTCCACGGCAACACAGCTGCATCCCTTCATCCACACGCAACATTTCGCTCTCT
TGAAGAGAAACCGGGAGCCGGCTAGGGGGGTTGACTTCATGGTGACAAATGGAGACCTTCAATCATAAACTGAACACT
TACTTAGAGTCATGGATGGGTCCCAGAGATCAGCGGGTGCGAGGATGGCTGCTGCTCGACAACTACCCACCAACCTTT
GCACTCACAGTCATGTACCTTCTGATCGTGTGGATGGGGCCCAAGTACATGAAACACAGGCAGCCGTACTCCTGCAGA
GGCCTCCTGGTGCTCTACAATCTGGGCCTCACACTCTTGTCCTTCTACATGTTCTATGAGCTTGTTAGCGCTGTGTGG
CACGGTGGCTACAACTTCTACTGCCAGGACACTCACAGTGAACAGGAAGTGGATAATAAGATCATAAATGTGCTGTGG
TGGTACTACTTCTCCAAGCTCATCGAGTTCATGGACACCTTTTTCTTCATACTACGCAAGAATAATCACCAGATCACA
TTTCTTCACATCTACCATCACGCTACCATGCTGAATATCTGGTGGTTTGTTATGAACTGGGTACCCTGCGGCCATTCG
TACTTCGGTGCCTCCCTGAACAGCTTCGTACACGTCGTTATGTATTCTTACTACGGCCTCTCGGCCATCCCAGCCATA
CGGCCGTACCTTTGGTGGAAGAAGTACATCACACAGTTACAGCTGATCCAGTTCTTTTTAACCATGTCCCAGACAATG
TGTGCAGTCATATGGCCATGTGGCTTCCCGATGGGATGGCTGTACTTCCAAATAAGTTACATGGTCACGCTCATTTTC
CTTTTCTCAAACTTCTACATTCAGACTTACAAGAAGCACAGTGCTTCTCTAAAGGAGCACCAGAACGGCTCTCCCGTA
TCAACAAATGGACATGCAAATGGGACGCCATCTGCAGAGCACACTGCGCACAAGAAACTGAGGGTGGATTGACATTTG
AGAAACCGCCACCCAATTCTCACTGTAGCGCGTTAGCTAATGCTGCTAGGAGGTATATGTATCTTCTTATCTAGAATA
GTCTTGCACTCACTTGAGATGAAATAAGCCATAGCCACATGTATCCAGAGACTTTCCATGTTTTTACACACATTCCTA
CTCATGGTATTGCATCACTCATTAATATAGTTAAAGGAGAAGAGCATTGTAGTATTGATGACACTGCACAATATTGCC
TCCCCCCCCTCCCCCCTCCCAACTCACTCTCTAGAGGGAATTCACTCCAAAGCAAAAATCTCTTTCTTGCTACCAGCA
AACAAAAACATTTTGACTTATTCATTGTTGCTTTACACGCAGAAGGTCCAAAAATGAGCTCCAGTGAGTGTGTTGGCA
GCTTAAGGTTTTATCACACTCGATGACATCTCGGTTTCAACAACCTAAGGGACAATTACACAGTGCTTACAGTCCTAA
TTGTGTAACTAGAGCATGCATCTTGTGTCTTGCTTTATCTCACTCCTGCCTGGGCTGTTGCATAATCCTACATTTTGC
CCTGTGGAATACTGTAATGCATTTTTATTGACAGGTTATGACAGCAAAAAGTAGAATTTTGCTGTATTTTTGCAGAGC
AGGGTCTCCAATTTGGAATATGTAGCCATCTAACCAAAGCCTAGTGTATTGTATATGCAAGGATTCATATTTAAACCA
GTTTAAGACACAATGTTAGAGGGCAGTTGTGTTAAAACACATTATAAACTCAATTCTCCTTAACATCCCCCATATTAC
AACCTGTGCTATATCTACTGTAGCTTTATGCAGTAAATGCAATTACCTGCAATTCATTTAAATTTAATTAAGTAAGGA
AATGCCCATTAGGTCTGCAGTGCAAGTGCTTACTGGTAATATGTAGGTATCAAATTTATCAAGTGAATGTAATCATAC
TGTATAACTCAGTGCTGAATACTCAAATACGTTTATATCCAGATAAACTTTACTATATAGTTAAGAATTAAAGCTCGT
TATCGACCTTGAAATCAGCTGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

¿Cuál es el valor de la Tm si usas la regla de Wallace?

Tm= 2(A+T)+4(G+C)

1- Tm=52
2- Tm=54
3- Tm=62
4- Tm=60
5- Tm=60

Aislamiento Plasmídico
1. En cuanto al plásmido aislado sin digerir. ¿Qué concentración y pureza tiene la muestra de
ADN plasmídico obtenida? Comparar estos resultados con los obtenidos mediante el método
de “lisis alcalina” utilizado en el Bloque de Genética y discutir si son adecuados para digerir
con enzimas de restricción o para secuenciación. En el caso de que estos resultados no
fueran óptimos, ¿cuál es la posible explicación?

Aislamiento ADN plasmídico con kit comercial Lisis alcalina

[ADNpl] 48 ng/μL [ADNpl] 1471,6 ng/μL
260/280 1,9 260/280 1,91
260/230 2,2 260/230 2,38

Para el ratio de 260/230 la pureza óptima se encuentra entre 1.8 y 2, de modo que nuestra
muestra está dentro del rango deseado. En el caso del ratio 260/230 el rango está entre 2 y 2.2
de forma que el valor obtenido se encuentra en el valor óptimo. La concentración obtenida no
es muy alta con respecto a la de nuestros compañeros. En conclusión, la muestra de ADN es
bastante pura y por tanto adecuada para su digestión con enzimas de restricción.

Por el método de lisis alcalina utilizado en el bloque de Genética, se puede obtener una gran
concentración de ADN plasmídico, aunque de menor pureza.
Por otra parte, por el método del kit comercial se puede obtener una gran pureza del ADN
plasmídico en un menor tiempo de extracción. Sin embargo, la concentración mediante este
método es bastante baja

2. Observando el gel de electroforesis y teniendo en cuenta los datos de concentración y

pureza del plásmido ¿crees que el plásmido se encuentra correctamente purificado? ¿Qué
topología presenta? ¿Son similares los resultados del aislamiento comparado con las otras
parejas? Explicar de forma razonada.

Viendo la electroforesis podemos comprobar que el ADN no está bien purificado ya que
presentan distintas conformaciones como la superenrollada y la banda debería estar próxima a
las tres mil pares de bases, cosa que no ocurre

3. Observando el carril donde se ha realizado la digestión con enzimas de restricción,

¿Cuántas veces estimas que la enzima utilizado corta tu plásmido? Compara el resultado de
la digestión con respecto al plásmido sin digerir.

Muestra 1: La enzima es Bgl II. Hay 2 bandas por lo que corta 2 veces el vector, pero no el
inserto. Como los lugares de corte se encuentran en los extremos del inserto, éste se extrae,
teniendo un tamaño de unas 800 pb
Muestra 2: La enzima es Sal I. No corta en el vector con lo cual se observan ambas bandas a la
misma altura

Muestra 3: La enzima es Hind III. Hay una banda por lo que la enzima corta una vez el vector,
además, esta se encuentra más baja que el plásmido sin digerir ya que posee una
conformación lineal

Muestra 4: La enzima es Ncol. Hay una banda por lo que la enzima corta una vez el vector,
además, esta se encuentra más baja que el plásmido sin digerir ya que posee una
conformación lineal

Muestra 5: La enzima es Xhol. Hay una banda por lo que la enzima corta una vez el vector,
además, esta se encuentra más baja que el plásmido sin digerir ya que posee una
conformación lineal

Muestra 6: La enzima es Pstl. Corta una vez el vector pero se pueden observar dos bandas así
que debe cortar también en el inserto

Muestra 7: La enzima es EcoRI. Se observa que no corta en el vector por lo que no se puede
ver ninguna banda pero deberían aparecer dos bandas en la misma posición. Esto puede ser
debido a la baja concentración ya que dificulta su apreciación en la electroforesis.

4.Analiza el resultado global (incluyendo el resultado de los enzimas de tus compañeros) y

junto con el mapa del vector del pJET dibuja un mapa de restricción de tu secuencia.

El resultado global ya se ha comentado anteriormente. El mapa de restricción sería el

siguiente:

SECUENCIACIÓN
1. Depura las secuencias que has obtenido a partir del electroferograma y escribe la
secuencia final resultante.
CCCAGACTNCCGGANGGCTCGAGTTTTTCAGCAAGATTGTTGTCACAGCCAATCTTCATGTGGGTGGGT
CCGGTGAAGGAGATGCAGAGGTCTGTGATGGGCAGCAGCTTTGACGTGTCGATGCCATTTCCTCCAAG
CAACTGCACAAAATCTCCTGATTCTGCACAAGCAGGCATGGACCTCTTGGGAAAGTTGTTGAAGTGTCC
CAGTGTGAACTCAGAGACGTCGATCTCCACTGGGTATATGATGGAGAAGCTGCAGTTCCTGTGCTGCT
GCTGGATCACCATTGTGTAACTGCCCTCTGGTGACTGGGAGATGACATTACAGGGGAAAGGATTGATG
TGTTTCCTGAATGTCAGGGTGAAGCTGCTGCCAGCGTTGTGAATGCGGAAGAAGACCATGGCCACGTT
CTGAGAGGAGCGCACGCTTCTCCTCACTGATCCTGAGTCGCAGTAATCCACATATCGCTCGTACAGAGG
CAGCAGGTGATCCTGGGAGCTGGGAAATTTCTCTCCTTTCATCACCCAGCCGTCAAACACCGTGATGAA
GTCCCCTGCCTTGCAGTCGATGTCAACATTGTCATATTCCACACTGATCACCTCGTTGGGCTCTGCCATG
AAGAAAGCAGCACAGCTGAGCTGAGGGCGCTCCGCTGTGAAGGTGAATTGACCCTCCAATCTTTCTAG
AAAGATCTCCTACAATATTCTCAGCTGCCATGGAAAAATCGATGTTCTTCTTTTATTCTCTCAAGATTTTC
AGGCTGTATATTAAAACTTATATTAAGAACTATGCTAACCACCTCATCAGGAACNGTTGTAGGTG

2. Realiza una búsqueda en los bancos de datos y averigua de que gen se trata, además
especifica de qué especie se trata.

Se trata del gen corticotropin releasing hormone binding protein (CRH-BP) de la especie
Dicentrarchus labrax (lubina europea), la homología ha sido del 100%

3. ¿En la secuencia final obtenida hay lugares de restricción para Eco RI, Bam HI o Sau 3aI,
cuantos y en qué posiciones? Localízalos en la secuencia.

No hay lugares de restricción para ninguna enzima mencionada anteriormente

1. ¿Qué concentración y pureza tiene la muestra de RNA obtenida?

Concentración: 419,6 ng/μl

Pureza= ratio 260/280= 2,15

En caso del ARN, el valor óptimo de pureza para el ratio de 260/280 es 2, por lo que nuestra
muestra esta muy cerca a esos valore óptimos. Por lo que podríamos concluir que la muestra
es bastante pura.

RT – qPCR
1. Hacer una representación de la recta de calibrado, representando el número de ciclo en la
línea umbral (Ct o Cq) de cada muestra frente al log de la cantidad inicial de ADN molde.

[ADN] Log[ADN] Cq
10 ng 1 6.67
1 ng 0 10.26
0,1 ng -1 13.06
0,01 ng -2 16.57

18.00
Recta Patrón
16.00
f(x) = − 3.25 x + 10.015
R² = 0.99784418420983
14.00

12.00

10.00
Cq

8.00

6.00

4.00

2.00

0.00
-2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5
log [ADN]i

2. Calcular la eficiencia de la amplificación y el porcentaje de eficiencia, comentando los

resultados obtenidos.
Eficiencia = 10^1/pendiente = 10^-1/-3.25 = 2.0309
La eficiencia mide la cantidad de ADN que se duplica en cada ciclo de forma que un valor de
eficiencia de 2 quiere decir que la cantidad de ADN se duplica por completo. Por lo que estos
valores obtenidos son los deseados
%Eficiencia = (Eficiencia – 1)*100 = (2.0309 – 1)*100 = 103.09%
Para que el porcentaje de eficiencia sea óptimo debe encontrarse entre el 90 y el 105%, de
modo que nuestro valor se encuentra entre los valores óptimos.
3. Comentar las curvas de Melting obtenidas, tanto para crh (plásmido y cDNA) como para
actb (cDNA). ¿Son consistentes los valores obtenidos de ciclo umbral (Ct o Cq) en las
muestras amplificadas por duplicado? Razona tu respuesta.
Las curvas de Melting se emplean para detectar la amplificación de más de un producto. Se
construyen monitorizando la fluorescencia una vez que la PCR ha terminado, incrementando la
temperatura.
Cada pico en la curva de Melting se corresponde con 1 producto amplificado.
Se representa la derivada de la fluorescencia (RFU) frente a temperatura.
En las curvas de melting observamos dos picos principales (crh y actb) distanciados por lo que
los primers utilizados son los adecuados.
Además, en ambos casos la temperatura a la que la RFU comienza a bajar, y por lo tanto, la
temperatura a la que hebras comienzan a separarse, se encuentra en torno a 80ºC. Esta
temperatura se corresponde con la Tm, que debe estar entre los 60 y los 95ºC, siendo más alta
conforme aumente el tamaño del producto.
Para que los valores sean consistentes la diferencia de Cq entre los duplicados debe ser menos
que 0.5.

CRH-BP Actina
Réplica 1 26.94 Réplica 1 22.58
Réplica 2 26.05 Réplica 2 21.39
Réplica 3 25.91 Réplica 3 22.64 Observando los datos obtenidos
Diferencia Diferencia
1.19
vemos que las muestras
0.89 entre réplicas
entre réplicas duplicadas de CRH-BP no son
consistentes y para el caso de la Actina tampoco lo son.

4. Con la recta de calibrado obtenida para crh, calcular la cantidad inicial de ADN molde en
las muestras de tejido amplificadas (cuantificación absoluta).

Sabemos que la Cq media de nuestra muestra del gen crh es de 26.30. Conociendo este dato, y
sabiendo que se representa Cq frente al logaritmo de la concentración inicial de ADN, usando
la pendiente podemos calcular dicho logaritmo.

𝐶q = −3.25 · log[𝐴𝐷𝑁] 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 + 10.015

log[𝐴𝐷𝑁]𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 = (26.30 - 10.015)/ (-3.25)= -5.1698
[𝐴𝐷𝑁]𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 = 10-5.1698 =6.76 x 10-6 𝑛𝑔/μ𝑙

5. Según los valores obtenidos de ciclo umbral (Ct o Cq) para los genes de la lubina crh-bp y
actb en el tejido utilizado, ¿qué gen tiene mayor expresión? ¿Por qué?

Comparando los valores de Cq para el crh-bp y actb en el caso del intestino, el gen con mayor
expresión es actina, ya que tiene los valores de Cq más bajos.

6. Teniendo en cuenta TODOS los datos obtenidos, ¿en qué tejido/s hay mayor expresión del
gen crh-bp?

Si observamos los valores obtenidos de Cq en todos los tejidos, la retina es el que tiene menor
diferencia de Cq para el crh-bp y por tanto, será el que tenga la mayor expresión de este gen
Expresión de CRH-BP por
tejidos relativa a ACTINA

0
5
10
15
20
25
30
35
Expresión de CRH-BP por tejidos