OPTIMIZACIÓN DE PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una nueva herramienta ingeniosa para la biología molecular que ha
tenido un efecto en la investigación similar al descubrimiento de enzimas de restricción y la transferencia Southern. La
PCR es tan sensible que se ha amplificado una sola molécula de ADN, y los genes de copia única se extraen de forma
rutinaria de mezclas complejas de secuencias genómicas y se visualizan como bandas distintas en geles de agarosa. La
PCR también se puede utilizar para la detección rápida y / o secuenciación de insertos directamente de alícuotas de
placas de fagos individuales o colonias bacterianas. Mejoras, como el uso de ADN polimerasas termoestables y la
automatización, del método inventado por Kary Mullis (KB Mullis, patente de los Estados Unidos 4.683.195, julio de
1987; patente de los Estados Unidos 4.683.202, julio de 1987) (Saiki et al. 1985; Mullis et al. 1986 ; Mullis y Faloona
1987) han fomentado el desarrollo de numerosas y diversas aplicaciones de PCR en toda la comunidad de investigación.
Sin lugar a dudas, ningún protocolo único será apropiado para todas las situaciones. En consecuencia, es probable que
cada nueva aplicación de PCR requiera optimización. Algunos problemas que se encuentran a menudo incluyen: ningún
producto detectable o un bajo rendimiento del producto deseado; la presencia de bandas de fondo inespecíficas debido
a mal ajuste o tensión mixta de los cebadores; la formación de "cebadores-dímeros" que compiten por la amplificación
con el producto deseado; y mutaciones o heterogeneidad debido a una mala incorporación. El objetivo de este capítulo
es acelerar el proceso de optimización discutiendo los parámetros que influyen en la especificidad, fidelidad y
rendimiento del producto deseado. Estas recomendaciones se derivan de nuestra experiencia práctica en el uso de
polimerasas de ADN Taq nativas o recombinantes obtenidas de instrumentos Perkin · Elmer Cetus.

Protocolo de amplificación de PCR estándar

Si bien las condiciones estándar amplificarán la mayoría de las secuencias objetivo, se presentan aquí principalmente
para proporcionar condiciones iniciales para diseñar nuevas aplicaciones de PCR. puede ser muy ventajoso optimizar la
PCR para una aplicación dada, especialmente procedimientos diagnósticos o analíticos repetitivos en los que optima! El
rendimiento es necesario.

1. Configure una reacción de 100 µI en un tubo de microfuga de 0.5 ml, mezcle y superponga con 75 µI de aceite
mineral:

ADN de plantilla (105 a 106 moléculas objetivo)

20 pmol cada imprimación (TM> 55ºC preferido)

Tris-HCI 20 mM (pH 8.3) (20ºC)

1.5 mM MgCI, 25 mM KCI 0.05% Tween 20

100 µg / ml de gelatina esterilizada en autoclave o albúmina de suero bovino libre de nucleasas

50 µM cada dNTP

2 unidades de ADN polimerasa Taq

• 1 µg de ADN genómico de copia única humana equivale a 3 x 10 5 objetivos; 10 ng de ADN de levadura equivalen a 3 x
105 objetivos; 1 ng de ADN de Escherichia coli equivale a 3 x 10 5 objetivos; 1% de una placa M13 equivale a 10 6 objetivos.

2. Realice de 25 a 35 ciclos de PCR utilizando el siguiente perfil de temperatura

Desnaturalización 96ºC, 15 segundos (generalmente es deseable un tiempo inicial más largo)

Primer recocido 55ºC, 30 segundos

Extensión de cebador 72 ° C, 1.5 minutos

3. El ciclo debe concluir con una extensión final a 72ºC durante 5 minutos. Las reacciones se detienen enfriando a 4ºC y
agregando EDTA a 10 mM.
Concentración de enzimas

Un rango de concentración recomendado para la ADN polimerasa Taq (Perkin-Elmer Cetus) es entre 1 y 2.5 unidades (SA
= 20 unidades / pmol) (Lawyer et al. 1989) por reacción de 100 µl cuando otros parámetros son óptimos. Sin embargo,
los requisitos de enzimas pueden variar con respecto a las plantillas o cebadores objetivo individuales. Al optimizar una
PCR, recomendamos probar concentraciones de enzimas que varían de 0.5 a 5 unidades / 100 µl y analizar los resultados
por electroforesis en gel. Si la concentración de enzima es demasiado alta, se pueden acumular productos de fondo
inespecíficos y, si es demasiado baja, se produce una cantidad insuficiente del producto deseado.

Nota: la ADN polimerasa Taq de diferentes proveedores puede comportarse de manera diferente debido a diferentes
formulaciones, condiciones de ensayo y / o definiciones de unidades.

Desoxinucleótidos Trifosfatos

Las soluciones dNTP de reserva deben neutralizarse a pH 7.O, y sus concentraciones deben determinarse
espectrofotométricamente. Las reservas primarias se diluyen a 10 mM, se dividen en alícuotas y se almacenan a -20 "C.
Se recomienda una reserva de trabajo que contenga 1 mM cada dNTP. La estabilidad de los dNTP durante ciclos
repetidos de PCR es tal que aproximadamente el 50% permanece como dNTP después de 50 ciclos (Carey Levenson,
comunicación personal).

Concentraciones de desoxinucleótidos. Entre 20 y 200 µM cada uno da como resultado el equilibrio óptimo entre
rendimiento, especificidad y fidelidad. Los cuatro dNTP deben usarse en concentraciones equivalentes para minimizar
los errores de incorporación incorrecta. Tanto la especificidad como la fidelidad de la PCR aumentan utilizando
concentraciones de dNTP más bajas que las recomendadas originalmente para la PCR mediada por Klenow (1,5 mM cada
una).

Las bajas concentraciones de dNTP minimizan el mal corte en sitios no objetivo y reducen la probabilidad de extender
nucleótidos mal incorporados (Innis et al. 1988). Uno debería decidir la concentración de dNTP más baja apropiada para
la longitud y composición de la secuencia objetivo; por ejemplo, 20 µM cada dNTP en una reacción de 100 µl es
teóricamente suficiente para sintetizar 2.6 µg de ADN o 10 pmol de una secuencia de 400 pb. Recientemente, el uso de
concentraciones bajas y uniformes de dNTP (2 µM cada una) permitió una amplificación altamente sensible (1/107),
específica de alelos de mutaciones de puntos ras (Ehlen y Dubeau 1989)

Concentración de magnesio

Es beneficioso para optimizar la concentración de iones de magnesio. La concentración de magnesio puede afectar todo
lo siguiente: recocido del cebador. temperaturas de disociación de hebras tanto del molde como del producto de PCR,
especificidad del producto, formación de artefactos cebador-dímero y actividad y fidelidad enzimática. La ADN
polimerasa Taq requiere magnesio libre además de la unión de ADN de plantilla, cebadores y dNTP. Por consiguiente, las
PCR deben contener magnesio de 0,5 a 2,5 mM sobre la concentración total de dNTP. Tenga en cuenta que la presencia
de EDTA u otros quelantes en las reservas de cebadores o en la plantilla de ADN puede alterar el óptimo de magnesio
aparente.

Otros componentes de reacción

Un tampón recomendado para la PCR es Tris-HCI de 10 a 50 mM (entre pH 8,3 y 8,8) cuando se mide a 20 ºC; sin
embargo, no se ha realizado una encuesta exhaustiva de otros tampones. Tris es un tampón iónico dipolar que tiene un
pKa de 8.3 a 20ºC y un 6 pKa de -0.021 / ºC. Por lo tanto, el pH verdadero de Tris 20 mM (pH 8.3) a 20ºC varía entre 7.8 y
6.8 durante las condiciones típicas de ciclo térmico.

Se puede incluir KCI hasta SO mM en la mezcla de reacción para facilitar el recocido del cebador. NaCI a 50 mM, o KCI
por encima de 50 mM, inhibe la actividad de la ADN polimerasa Taq (Innis et al. 1988).

Si bien el DMSO es útil en las PCR realizadas con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli, el 10% de DMSO
inhibe la actividad de la ADN polimerasa Taq en un 50% (ver Capítulo 16) y su uso no se recomienda para la mayoría de
las aplicaciones (una excepción es El protocolo de Chamberlain et al. (1988) que describe la amplificación de múltiples
secuencias en la misma reacción; ver también el Capítulo 33).

Se incluyen gelatina o albúmina de suero bovino (100 µg / ml) y detergentes no iónicos como Tween 20 o Laureth 12
(0,05 a 0,1%; Mazer Chemicals, Gurnee, Illinois) para ayudar a estabilizar la enzima, aunque muchos protocolos
funcionan bien sin Proteína añadida.

Primer recocido

La temperatura y el tiempo requerido para el recocido del cebador dependen de la composición base, el largo y la
concentración de los cebadores de amplificación. Una temperatura de recocido aplicable es 5ºC por debajo de la Tm
verdadero de los cebadores de amplificación. Debido a que la ADN polimerasa Taq está activa en un amplio rango de
temperaturas, la extensión del cebador se producirá a temperaturas bajas, incluida la etapa de recocido (Innis et al.
1988). El rango de actividad enzimática varía en dos órdenes de magnitud entre 20 y 85ºC. Las temperaturas de recocido
en el rango de 55 a 72ºC generalmente producen los mejores resultados. A las concentraciones típicas de cebador (0.2
µM), el recocido requerirá solo unos pocos segundos.

El aumento de la temperatura de recocido mejora la discriminación contra los cebadores recocidos incorrectamente y
reduce la tensión misex de nucleótidos incorrectos en el extremo 3 'de los cebadores. Por lo tanto, las estrictas
temperaturas de recocido, especialmente durante los primeros ciclos, ayudarán a aumentar la especificidad. Para
obtener la máxima especificidad en el ciclo inicial, se puede agregar Taq DNA polimerasa después del primer paso de
desnaturalización durante el recocido del cebador. La baja temperatura de extensión junto con altas concentraciones de
dNTP favorece la tensión misex de los cebadores y la extensión de los nucleótidos mal incorporados. Por estas razones,
algunos investigadores han argumentado que las PCR deberían funcionar mejor usando cebadores más largos y solo dos
temperaturas; por ejemplo, de 55 a 75ºC para recocido y extensión, y de 94 a 97ºC para desnaturalización y separación
de hebras (Kim y Smithies 1988; Will Bloch, comunicación personal).

Extensión de cebador

El tiempo de extensión depende de la longitud y concentración de la secuencia objetivo y de la temperatura. Las

extensiones de cebadores se realizan tradicionalmente a 72ºC porque esta temperatura era casi óptima para extender
los cebadores en una plantilla modelo basada en Ml3 (D. Gelfand, inédito). Las estimaciones para la tasa de
incorporación de nucleótidos a 72ºC varían de 35 a 100 nucleótidos segundo-1 dependiendo del tampón, el pH, la
concentración de sal y la naturaleza de la plantilla de ADN (Innis et al. 1988; Saiki y Gelfand 1989). Un tiempo de
extensión de un minuto a 72ºC se considera suficiente para productos de hasta 2 kb de longitud. Sin embargo, los
tiempos de extensión más largos pueden ser útiles en los primeros ciclos si la concentración del sustrato es muy baja y
en los últimos ciclos cuando la concentración del producto excede la concentración de la enzima (aproximadamente 1
nM) (Will Bloch, comunicación personal).

Tiempo de desnaturalización y temperatura

La causa más probable de falla de una PCR es la desnaturalización incompleta de la plantilla objetivo y / o el producto de
PCR. Las condiciones típicas de desnaturalización son 95ºC por 30 segundos, o 97ºC por 15 segundos; sin embargo,
temperaturas más altas pueden ser apropiadas, especialmente para objetivos ricos en G + C. Solo lleva unos segundos
desnaturalizar el ADN a su temperatura de separación de hebras (Tss); sin embargo, puede haber un tiempo de retraso
involucrado en alcanzar Tss dentro del tubo de reacción. Es una buena idea controlar la temperatura dentro de un tubo
de reacción con una sonda de termopar de baja masa (ver Capítulo 51). La desnaturalización incompleta permite que las
hebras de ADN se "replieguen" y, por lo tanto, reduce el rendimiento del producto. En contraste, los pasos de
desnaturalización que son demasiado altos y / o demasiado largos conducen a una pérdida innecesaria de la actividad
enzimática. La vida media de la actividad de la ADN polimerasa Taq es> 2 horas, 40 minutos y 5 minutos a 92.5, 95 y 97.5
° C, respectivamente (ver Capítulo 16)
Número de ciclo

El número óptimo de ciclos dependerá principalmente de la concentración inicial de ADN objetivo cuando se optimizan
otros parámetros. Un error común es ejecutar demasiados ciclos. Para citar a Kary Mullis, "si tiene que realizar más de
40 ciclos para amplificar un gen de copia única, su PCR tiene algo grave". Demasiados ciclos pueden aumentar la
cantidad y la complejidad de productos de fondo no específicos (ver Efecto de meseta). Por supuesto, muy pocos ciclos
dan un bajo rendimiento del producto. Se proporcionan algunas pautas para el número de ciclos versus la concentración
objetivo inicial:

 Número de moléculas objetivo Numero de ciclos

3 x 105 25 a 30

1.5 x 104 30 a 35

1 x 103 35 a 40

50 40 a 45