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Fundamentos de PCR

Dr. Jos A. Card-Serrano


Dr. Jess Lee-Borges
Dra. Liza Jimnez
Dr. Jos M. Planas
Biol 4207 Lab de Virologia y Biotecnologia
Universidad de Puerto Rico - Aguadilla

Objetivos

Estudiar los pasos que componen la


reaccin de PCR
Discutir factores importantes en la
optimizacin de esta tcnica
Conocer Aplicaciones
Preparar una reaccin de PCR e incubarla
en el termociclador.

Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR
PCR es bsicamente una tcnica de amplificacin del ADN.

ADN
(molcula sencilla)

PCR
amplificacin

Muchas
molculas

PCR
Dolan Learning Center
Biology Animation Library
CSHL

Historia

1985 se crea la
tcnica molecular
conocida como
PCR
Kary B. Mullis,
Coorporacion
CETUS

Premio Nobel en
Qumica 1993

Procedimiento del PCR

Desnaturalizacin
Hibridizacin
Extensin

Desnaturalizacin

Calor del ADN 94C.


Filamentos dobles
se derriten.
Hay una separacin
fsica de las dos
cadenas.

Hibridizacin

La temperatura se reduce a 54 C.
Movimiento Browniano.

El movimiento que lleva a cabo una


partcula muy pequea que esta inmersa
en un fluido

Enlaces de hidrgeno.
Filamento de ADN.
Bases construidas.

Extensin o Polimerizacin

Temperatura de polimerasas 72C.


Los primers tienen una fuerte
atraccin al molde o templado
Los primers sin exacto pareo se
pierden.
No dan extensiones de fragmento.
El procedimiento se repite y se forman
copias del ADN.

LINK

Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5

-T A C G
-A T G C A T G C A T G C * *

Cortos primers de ADN especficos hibridizan con la


cadena que tiene que ser copiada

Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5

-T A C G T
-A T G C A T G C A T G C *
*

Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5

-T A C G T A
-A T G C A T G C A T G C *
*

Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5

-T A C G T A C
-A T G C A T G C A T G C * *

Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5

-T A C G T A C G
-A T G C A T G C A T G C * *

Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5

-T A C G T A C G T

-A T G C A T G C A T G C * *

Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR

Sntesis por DNA polimerasa


5

-T A C G T A C G T A

-A T G C A T G C A T G C *
*

Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR

Primero, la fusin separa las dos cadenas de ADN a alta


temperatura (~100C)

Reaccin en cadena de la
polimerasa - PCR
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Fusin
95C

Hibridizacin
50-60C

Extensin de
La cadena
75C

2do Ciclo
95C
50 - 60C
75C

Primer Ciclo
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Mltiples ciclos darn un incremento exponencial
en el nmero de copias

PCR LINK

Hay 6 componentes esenciales


en el proceso de PCR

ADN polimerasa termoestable


Oligonucleotidos iniciadores (primers)
Desoxiribonucletidos trifosfatados
(dNTPs)
Cationes divalentes
Buffer (para mantener el pH)
ADN molde (Templado)

ADN polimerasas
termoestables
Llevan
a cabo la sntesis de ADN dependiente del

templado.
Estabilidad Taq: 9 min at 97C, Pwo >2 hr a 100C
Fidelidad Taq: baja, Pfu: alta
Algunas presentan actividad transferasa terminal en el
extremo 3, ej. Taq agrega una A al extremo 3,
especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli
generan extremos romos
Cantidad usada = 5 x 1012 molculas (1.5 unidades)
La mas comnmente usada = Taq ADN polimerasa
Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu
Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis

Oligonucletidos iniciadores
(primers)

Se conoce su secuencia
Es el factor mas importante para la
eficiencia y la especificidad del proceso
Deben estar presentes en exceso (1013 = 30
ciclos, 1 kb)
Requieren de un cuidadoso diseo
Reglas de diseo:
(a) longitud = 18-25 bases
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
(c) Evitar las secuencias repetidas

Evitar las secuencias


repetidas
5-NNNNNNNNNNNNNTATA-3
5-NNNNNNNNNNNNNTATA-3

5-NNNNNNNNTATA-3
3-ATATNNNNNNNN-5

3 repetido
5
3

5
3

PCR

3
5

Dmero de primer

Evitar las secuencias


repetidas
5-TATANNNNNNNNNNNNN-3
5-TATANNNNNNNNNNNNN-3

5-TATANNNNNNNN-3
3-NNNNNNNNATAT-5

5 repetido
5
3

PCR
5

no hay extensin

Evitar las secuencias


repetidas
5-NNNNNNNNNNNGCATGC-3
5-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3

5-NNNNNNNNNNNGCA
3-CGT

Formacin de horquillas

PCR

5
3
3

5
3

Productos de PCR no deseados

ADN molde (templado)

Puede ser ssADN o dsADN (simple o doble


cadena)
ADN circular y cerrado es levemente menos
efectivo que el ADN lineal
Usualmente se utilizan varios miles de copias,
ej: 1 g de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de
bacteriano o 1 pg de plasmdico
Se puede amplificar a partir de una sola
molcula de ADN molde, pero las condiciones
deben estar muy optimizadas

El ciclo de PCR

Desnaturalizacin - 94-95C por 45 segundos


si G+C < 55%
Temperatura de hibridizacin (Annealing)
debe ser calculada o determinada
empricamente para cada par de primers

demasiado alta = poco o nada de producto


demasiado baja = annealing no especfico =
productos incorrectos

Extensin - a la temperatura ptima de la


ADN polimerasa utilizada
ej.: 72C para Taq

Variantes de la PCR

Touchdown PCR
Colony PCR
Multiplex PCR
Hot start PCR
Nested PCR
Inverse PCR
Long PCR
Quantitative real time PCR

Multiplex PCR

Describe una PCR en la cual hay presentes


mltiples pares de primers (hasta 8) lo que
da una serie de productos. Los mismos
pueden verse como mltiples bandas en un
gel de agarosa
Multiplex PCR es frecuentemente usada en
diagnstico mdico
Ahorra templado, tiempo y gastos
Requiere una cuidadosa optimizacin

Nested PCR

A veces 1 ronda de PCR no da un producto nico a


partir de un templado complejo, apareciendo un
esparcido
Se puede resolver utilizando un segundo par de
primers que hibriden un poco mas internamente que
los primeros
Realizar una segunda ronda de PCR usando el
producto de la primera (esparcido)
Rinde un producto nico porque solo el fragmento
correcto de ADN posee los sitios correctos de
hibridizacin para el segundo par de primers

Nested PCR
1era PCR

Esparcido de ADN
2da PCR

ADN especfico

Clonado con PCR: clonado T-A


A-3

T-3'

3-A

3'-T

Producto de PCR
a partir de Taq

Vector con cola-T

ligamiento
T-3'

3'-T

Ligamiento con extremo adhesivo de 1 base = 50 veces mejor


que ligamiento con extremos romos

Mutagnesis por PCR

Introduce cambios de secuencia dentro de


fragmentos (clonados) de ADN
El mtodo de extensin solapada requiere 2
primers mutagnicos y otros 2
Amplifica un fragmento 5 y un fragmento 3
que se solapan. Ambos portan la mutacin
Usa los productos en otra reaccin para
producir el ADN mutado de longitud
completa

Mutagenesis con PCR- extension


solapada
Primer mutagnico directo (forward)

Primer SP6
Dos 1ras
PCRs
separadas

primer mutagnico inverso (reverse)


X

x
remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar

x
2da PCR
x

Primer T7

RT-PCR = PCR con transcriptasa


reversa

Para amplificar copias de cADN de ANR


Es especialmente til cuando solo se dispone de pequeas
cantidades de ANR
Frecuentemente usada para amplificar genes especficos
(como cANDs) si algo de su secuencia es conocida
Requiere primer antisense y un AND polimerasa
dependendinte de ANR
Puede ser usada para construir bibliotecas de cAND
Primero se hace un cAND a partir del templado de ARN
Luego se usa un segundo primer (sense) para hacer el
duplex de cAND por PCR

RT-PCR LINK
mANR
(sense)

AAAAAAAAAA-3 Primer Antisense:


TTTTTTTTTT-5 oligo(dT)o

Transcripcin reversa
GSP1 (sense)
AAAAAAAAAA-3
TTTTTTTTTT-5

1ra cadena cDNA

GSP (antisense)

PCR usando
GSP+GSP1
GSP1
GSP
Requiere el conocimiento de la secuencia para disear GSP and GSP1

Real Time - PCR


-Alta especificidad
-Usa primers marcados con moleculas fluorescentes
- Resultados son no solo cualitativos sino cuantitativos
-Sensitividad mucho mayor
-LINK

Parte Prctica
Amplificacin de DNA de
Fago

Lambda ADN

Bacterifago Lambda ()
Aislado de E. coli W3110 (c/857 sam7
strain)
Usado como sustrato para enzimas de
restriccin
Peso molecular 31.5106 daltons y
genoma de 48502 pares de bases

Secuencia de Lambda DNA

Sanger et al. 1982 J. Mol. Biol. 162:


729-773

Protocolo Seguir el protocolo delineado en el


PCR AMplificatiom Kit Cat. #R011
React

Vol (ul)

[ ] Fin

[ ] Ini

PCR Buff

1x

dNTP Mix

200uM

Primer 1

0.5

0.2uM

Primer 2/3

0.5

0.2uM

Taq Pol

0.25

1.25U/50ul

DNA Temp

0.5

0.5ng/50ul

dH20

50 (39.25)

Total

50

Sondas control

Sonda control 1

Sonda control 2

5-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3
5-CCACATCCATACCGGGTTTCAC-3

Sonda control 3

5-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3

Preguntas?

Preguntas

Muy poco magnesio no produce suficiente


producto de PCR y mucho produce bases
pareadas errneas, por qu?
Al escoger los primers es importante evitar
secuencias que sean complementarias entre
estos, por qu?
Como cambiaria el producto del PCR si en
vez de amplificar ADN viral se amplificara
ADN bacteriano (este ADN es metilado)?

Asignacin

Hacer un reporte con la secuencia de


y donde en ella se pegan los primers
usados.
Demostrar la complementaridad y la
secuencia comprendida en la
amplificacin.