UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

Departamento De Ciencias Biológicas

Complementaria de Biología Molecular

TALLER 8
Clonación

Nombre: Fabio Alejandro Torres Ramos Código: 202113194

Nombre: María Camila Torres Código: 202113187
Nombre: Santiago Martinez Código: 202112005
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Objetivo

Seleccionar enzimas de restricción específicas para garantizar un proceso de clonación exitoso.

Conocimientos previos para desarrollar la guía

Entender los conceptos de regulación genética en procariotas y clonación.

Descripción de la actividad

Para esta primera actividad deben leer atentamente la guía e ir resolviendo cada una de las
preguntas en sus respectivos grupos de trabajo. Es necesario contar con acceso al siguiente
sitio web: http://nc2.neb.com/NEBcutter2/

Entregable

Esta guía deben entregarla resuelta a la complementaria y les servirá para poder realizar la
segunda parte de la actividad, la cual desarrollarán durante la sesión teórica.

INSTRUCCIONES

Para iniciar el protocolo experimental, supongan que ustedes han logrado ya

tomar muestras para aislar el virus SARS-Cov (Covid-19).

En el laboratorio, su primera tarea consistiría en aislar el ARN

del SARS-CoV. Este proceso se realiza empleando un reactivo
conocido como Trizol.

Una vez obtienen el material genético aislado, se debe realizar un proceso

de transcripción reversa, el cual consiste en convertir el RNA que aislaron
del virus en ADNc (ADN complementario). Más adelante en el curso conocerán la técnica.

A partir del ADNc del SARS se obtienen muchas copias del gen N (que codifica una proteína de
interés), por medio de un proceso que se conoce como PCR (Reacción en
Cadena de la Polimerasa).

Después de algunos pasos adicionales se obtiene un fragmento de ADN de

1301 pb que tiene ciertos sitios de reconocimiento para enzimas de
restricción. Para garantizar que logró “aislarse” el gen de interés, se realiza después un proceso
de secuenciación.

Estos son los resultados que se obtuvieron tras la secuenciación:

CTGCAGGGATCCCATATGAAGCTTATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACC
CCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTG
GGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACC
GCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGGTTCCAATTAAC
ACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGATTTCGTGG
TGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGC
CAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGA
GCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTG
CTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCG
GCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAG
GCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCT
TTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACA
ACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAAC
GTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTCTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACC
CAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGC
AAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAG
TCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCA
AATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCA
ACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGA
CAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCTGATTTGGATGATTTCTCCAAACAA
TTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAACTGCAGCATATGGAATTC

A partir de la información anterior, responda:

1. (0.5 puntos) Las regiones que están resaltadas en azul indican:

R/ ATG y TAA corresponden a los codones AUG y UAA después que ocurre el proceso de
transcripción. El primer codón respectivamente indica el inicio de la secuencia, y el otro indica el
punto donde finaliza.
2. (0.5 puntos) Para expresar nuestra proteína de interés en E. coli se decide emplear el
siguiente vector de expresión:

Estos son los detalles del MCS (Multiple Cloning Site) y alrededores en este vector:

Expliquen por qué decidirían usar este vector para la investigación y no otro. (Pista: ¿Por qué
funciona en E. coli?)

R. Se decidiría usar E. coli como vector para la investigación debido a dos razones. La primera es
porque las enzimas restrictivas del E. coli pueden reconocer la secuencia EcoRI, y debido a esto
se puede cortar la inserción del ADN interesado y la del ácido nucleico. La segunda razón es
porque el ColE1 el cual es el origen de la replicación, por lo cual si se reconoce se es capaz que el
plásmido se puede replicar independientemente del ADN nuclear.
3. (0.5 puntos) Adicionalmente, se define que el promotor (T7) será el encargado de controlar
la expresión del gen de interés y que el terminador (T7) será el encargado de terminar la
transcripción de este, cuando esté todo ensamblado. Con base en lo anterior, y tras observar
con detalle la estructura del vector, indiquen dónde insertarían el gen. Señalen en la figura su
respuesta:

4. (1.5 puntos) Una vez determinan la posición donde se insertará el gen, deben decidir si el
inserto puede quedar en cualquier orientación o en una específica. Con base en ello,
respondan: ¿van a usar una o dos enzimas de restricción para cortar el inserto y el vector, por
qué?

R. En este caso se utilizarán dos enzimas de restricción para cortar el inserto y el vector, esto
debido a que el inserto debe quedar en una orientación específica, esto debido a que con esto
no se presentaran extremos cohesivos que hagan que el gen se introduzca al plásmido de
manera contraria, ya que cada enzima identifica y corta un sitio de restricción específico.
5. (2 puntos) Con base en lo anterior, también deben determinar en dónde quieren cortar el
inserto (en varios pedazos, uno solo, en el extremo, en la mitad). Para ello, deben analizar la
secuencia de su inserto (Gen N de la cápside del coronavirus) en el sitio web:
http://nc2.neb.com/NEBcutter2/ (esta es una herramienta para encontrar qué enzimas de
restricción cortan en su inserto y dónde). Para esto, copien y peguen la secuencia y hagan click
en submit, como se muestra en los espacios que están señalados por las flechas a continuación:

Hagan click en custom digest. Al hacerlo, aparecerán las enzimas de restricción que podrían
cortar dicho fragmento y en qué posiciones.

Luego, deben delimitar la región que abarca el gen (marcando con una x en cada extremo,
como se muestra en la figura) y seleccionan la opción Flanking Enzymes:
El programa mostrará las enzimas cuyos sitios de restricción están flanqueando el fragmento
de interés. Para tener un mayor margen de enzimas a elegir, seleccionamos un rango de 300 bp
y presionamos update:

A partir de los resultados y teniendo en cuenta los sitios de restricción del vector, propongan
la(s) enzimas de restricción con la(s) que cortarían tanto su plásmido (vector) como el inserto
(fragmento de ADN) para posteriormente hacer una ligación. (Justifiquen por qué esas y no
otras). Analice las secuencias (tanto del gen de interés como del plásmido) y diga qué
problemas se pueden presentar si usted decide usar el tag de histina para la purificación de
esta proteína, ¿qué solución podrían plantear para evitar esos posibles problemas?

Enzimas a utilizar y justificación:

Las enzimas a utilizar son las Pstl y la Sfcl esto debido a que como son enzimas que señalan que
cortan el fragmento en ambos sentidos, esto es porque como se encuentran dobles como al
inicio y al final de la secuencia y teniendo en consideración que se deben utilizar las mismas
enzimas tanto para corte del código como del plásmido, es por esto que estas dos son las más
apropiadas para realizar ambos cortes.
Problemas/soluciones al utilizar el tag de histidina para purificar la proteína de interés:

El problema en este caso es que el tag de histidina no alcanza a purificar completamente la

secuencia, puesto que le termina faltando un aproximado de 4 líneas de código (esto debido a
que la secuencia de aminoácidos termina antes de alcanzar al tag). Una solución para dicho
problema es que justo después del codón de parada TAA, se tenga que agregar un codón de
inicio para continuar con la secuencia no alcanzada en el gen inicial, a su vez también se debe
agregar una proteasa para eliminar el tag para re-insertarlo al final del código o dicho de otra
manera utilizar la proteasa para desplazar el tag, así de esta manera movemos el marco de
lectura no teniendo una señal de terminación.