UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA

INSTITUTO DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

PRÁCTICA:

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y ELECTROFORESIS

AUTOR:

PEDRO ESPINOZA ANGUIANO

ASIGNATURA:

BIOLOGÍA MOLECULAR APLICADA

NOMBRE DE LA PROFESORA:

ADRIANA MORALES TREJO

GRUPO: 4 C

MEXICALI, B.C. MÉXICO 29/ABRIL/2022

INTRODUCCIÓN:

La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que

amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos
repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente. Para ello, la reacción
aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de
sintetizar naturalmente el ADN en las células.

Un ciclo de PCR consiste de los siguientes pasos:

• Desnaturalización por calor (≥90 °C). Separa la doble hebra en dos sencillas
rompe enlaces de hidrógeno que unen las bases.
• Alineación (entre 40°C y 65°C). Unión de los primers u oligonucleótidos al DNA.
Permite la unión específica de los oligos a su hebra complementaria.
• Extensión (eleva la temperatura a 72°C). La enzima Taq DNA polimerasa se usa
para replicar las hebras de DNA.

El PCR tiene diferentes métodos o aplicaciones en función de lo que nos interese

investigar (como son los RAPDs, AFLPs, ISSRs, SSCP) y el primer paso es tener
claro el tipo de información que necesitamos para elegir o diseñar la estrategia más
apropiada para nuestro trabajo. Podemos dividir la técnica en dos categorías:

1) PCRs para la amplificación de un solo sitio conocido del genoma (locus). Estos
PCRs requieren conocer la secuencia que se trabaja, en cuyo caso se utilizan
oligonucleótidos diseñados a partir de la secuencia de ese gen y se obtiene un solo
fragmento de un tamaño ya conocido

2) PCRs en los que no es necesario conocer la región que se está amplificando (se
amplifican regiones no conocidas, como zonas hipervariables del genoma), por lo
cual no se sabe el tamaño del fragmento (o fragmentos) que se esperan. Éstos se
utilizan para determinar polimorfismo genómico y son los más comunes para
fingerprint, ya que es sencillo obtener los datos (un gel de agarosa después del PCR
es suficiente), se observan varios loci simultáneamente y la información de las
zonas variables permite inferir los datos necesarios para análisis de genética de
poblaciones.
 PRÁCTICA DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y
ELECTROFORESIS

Objetivo:

Reafirmar los conocimientos vistos en clase acerca de la Reacción en Cadena de

la Polimerasa y amplificar un fragmento de DNA mediante esta técnica, analizando
el producto mediante electroforesis en gel de agarosa.

Materiales Equipo utilizado

• Guantes • Micropipetas de 1-10 y 10 -100 µl
• Puntas para micropipetas • Microcentrífuga
• Microtubos de 0.25 ml • Termociclador
• Buffer de reacción a concentración de • Cámara de electroforesis
10x • Fuente de poder
• Desoxiribonucleótidos trifosfatados • Transiluminador
(DNTP´s) a concentración 10 mM • Fotodocumentador
• Mezcla de oligonucleótidos a
concentración 10mM
• DNA templado
• Enzima Taq Polimerasa
• Agua libre de nucleasas
• Agarosa
• Bromuro de etidio
• Buffer TBE para correr el gel de
agrosa

Muestra:

Contenido Intestinal (muestra 9). Lactobacillus

METODOLOGÍA

I. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

1. Verificar que esté disponible sobre la mesa todo el material para preparar la
reacción de PCR.
2. 2. Preparar la siguiente reacción en un microtubo de 0.25 ml:
• 38.5μl Agua
• 5μl Buffer 10x
• 1μl DNTP´s 10 mM
• 2μl Oligo Mix (10uM c/u)
• 3μl DNA templado
• 0.5 μl Taq Polimerasa
3. Centrifuga para mezclar la reacción a 8,000 rpm durante 15 segundos.
4. 4. Coloca tu muestra en el termociclador con el siguiente programa de
amplificación:
• 2 min 95 ºC
• 40 ciclos de:
- 15 seg/95 ºC
- 15 seg/56 ºC
- 45 seg/72 ºC
• 5 min a 72ºC
• Mantener a 12ºC
5. Al finalizar la amplificación la reacción se guarda en el congelador.

II. Electroforesis en gel de agarosa

6. Tomar 5 µl de la muestra del ADN amplificado por PCR

y colocarlo en un trozo de Parafilm.
7. Agregar 2 µl de Buffer de corrida y mezclar con la
micropipeta.
8. Inyectar los 7 µl de la mezcla en un pozo del gel de
agarosa en la cámara de electroforesis.
 9. Inyectar en otro pozo el marcador de peso
molecular.
10. Al final de inyectar todas las muestras en el gel,
colocar la tapa a la cámara de electroforesis y
conectarla a la fuente de poder.
11. Aplica 80 voltios por 35 minutos al gel.
12. Correr el gel a 90 v
durante 25 minutos.
13. Revisar el resultado en el transiluminador
comparando el tamaño del producto amplificado por
PCR con el marcador de peso molecular.

Resultados de la electroforesis:
DIAGRAMA DE PROCESO DE LA PRACTICA
CUESTIONARIO

a. ¿Explica un ejemplo de para qué podrías utilizar la técnica de PCR?

En investigación bioquímica y médica, la PCR permite preparar fragmentos de ADN

para su clonación en plásmidos bacterianos o virus para utilizarlos como vectores,
paso imprescindible en el desarrollo de terapias génicas.

b. Si comienzas tu reacción de PCR con 5 copias del DNA templado,

¿cuántas copias tendría después de 10 ciclos?
• Inicio: 5 cadenas dobles de ADN
➢ Ciclo 1: 10 cadenas
➢ Ciclo 2: 20 cadenas
➢ Ciclo 3: 40 cadenas
➢ Ciclo 4: 80 cadenas
➢ Ciclo 5: 160 cadenas
➢ Ciclo 6: 320 cadenas
➢ Ciclo 7: 640 cadenas
➢ Ciclo 8: 1280 cadenas
➢ Ciclo 9: 2,560 cadenas
➢ Ciclo 10: 5,120 cadenas

c. ¿Explica para qué sirven los DNTPs, oligonucleótidos y la Taq

Polimerasa en la reacción de PCR?

DNTPs: son nucleótidos que sirven para generar las nuevas cadenas de ADN.

Oligonucleótidos: son fragmentos complementarios que se van a unir a cada una de

las dos cadenas separadas del templado de ADN. Están constituidos por 20
nucleótidos o más y su función es dar inicio a la reacción de PCR.

Taq Polimerasa: la enzima Taq DNA polimerasa se usa para replicar las hebras de
DNA. La Taq polimerasa comienza el proceso de extensión en dirección 5’ a 3’
agregando los nucleótidos correspondientes, obteniéndose la hebra
complementaria de DNA.

d. Explica para qué sirve y cómo funciona la técnica de electroforesis en

gel de agarosa

La electroforesis en geles de agarosa es el método estándar para separar y purificar

fragmentos de ADN cuando no requerimos un alto poder de resolución. La
electroforesis en gel de agarosa es la más utilizada, y se aplica en clonación,
secuenciación, mutagénesis, fusión con otros fragmentos, utilización como sondas,
etc.

La agarosa es un polímero lineal de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. El gel se

obtiene disolviendo la agarosa en un buffer de TAE o TBE y se funde usando un
microondas, hasta obtener una solución homogénea y transparente. La disolución
se vacía en un molde y se coloca un peine (el peine forma unos pozos donde se
depositan las muestras).

e. Investiga y explica cómo se prepara el gel de agarosa al 1.2%

Preparación del gel de agarosa

1. Pesar la cantidad de agarosa necesaria para obtener la concentración deseada

(un gel de agarosa al 1.2% se debe pesar 1.2g de agarosa y este se disuelve en
100 mL de buffer TAE 1X o TBE 1X en un matraz) en función del volumen de
gel.
2. Calentar la mezcla en un horno de microondas hasta que se observe que toda
la agarosa se ha fundido.
3. Dejar enfriar la solución de agarosa hasta una temperatura de unos 50 °C (Nota:
si se opta por añadir el BrEt al gel debe realizarse en este momento, a una
concentración final de 0.5 µg/ml).
4. Mientras la solución de agarosa se enfría, preparar el molde en el que se va a
hacer el gel sellando los bordes con cinta masking, o colocándolo en el
dispositivo previsto para ello, y colocando el peine en la posición deseada.
5. Verter cuidadosamente la solución de agarosa sobre el molde nivelado y dejar
que solidifique durante al menos 30 min.
f. ¿Cómo sabes el tamaño o número de bases aproximado de tu producto
de PCR?

La idea ahora es poder analizar el o los fragmentos obtenidos en el PCR, y la

electroforesis, ya sea en geles de agarosa o de acrilamida, permite separar estos
fragmentos de acuerdo al tamaño de cada uno. Una vez que el gel está en la
cámara, cada una de las muestras de ADN que queremos analizar (por ejemplo,
cada reacción de PCR) se transfiere cuidadosamente a uno de los pozos. Un pozo
se reserva para el marcador de peso molecular, un estándar de referencia que
contiene fragmentos de ADN de longitudes conocidas. Una vez que los fragmentos
se han separado, podemos examinar el gel y saber el tamaño de las bandas que se
encuentran en él. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN y se
coloca bajo luz UV, los fragmentos de ADN brillarán, lo cual nos permite ver el ADN
presente en distintos lugares a lo largo del gel.

g. ¿En qué pasos de la práctica consideras que debe tenerse más cuidado,
y por qué?

En la hora de pipetear, cuando ingresamos los reactivos a la muestra, ser lo mas

precisos posible en cuanto a las cantidades. Tambien tener cuidado al manejar la
muestra para no contaminarla.

h. ¿Qué pasaría con tu muestra si aplicaras 20 voltios durante la

electroforesis en gel?

El ajuste del voltaje es muy variable dependiendo de la cámara y de los tamaños

que se pretenden separar, se recomienda voltajes no muy altos para tamaños muy
grandes del ADN. Cuanto más grandes son los tamaños a separar se requieren
voltajes más bajos, y como consecuencia tiempos más largos. Afectaría en la
velocidad de avance o la movilidad de las moléculas.
CONCLUSIÓN

En la práctica se desarrolló la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa

(PCR) y el corrimiento de la muestra de contenido intestinal en una electroforesis
en gel de agarosa. Esta técnica es muy importante ya que tiene muchas
aplicaciones, un ejemplo donde se utiliza es en el diagnostico de enfermedades
genéticas e infecciosas. Básicamente la PCR amplifica millones de veces una
secuencia especifica de ADN por varios ciclos. Es muy importante tener cuidados
especiales en PCR para evitar la contaminación entre muestras, asi como realizar
un buen pipeteo para que los reactivos que ingresemos a las muestras sean lo mas
exactos posibles.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

• Fierro, F. F. (2014). Electroforesis de ADN. Herramientas moleculares

aplicadas en ecología: aspectos teóricos y prácticos, 27.
• Asuar, L. E. (2007). Guía práctica sobre la técnica de PCR. Ecologia
Molecular. LE Eguiarte, V. Souza, X. Aguirre (Eds). INECC. México,
517-552.
• Rodríguez, A. S. S., & López, M. D. A. (2011). Electroforesis. Biología
molecular. Cap. 13, pág. 117-125.
• Alberto Checa Rojas. (2017). Método: Gel de electroforesis Agarosa.
2022, Abril 28, Conogasi.org Sitio web:
https://conogasi.org/articulos/metodo-gel-de-electroforesis-agarosa/
• Alberto Checa Rojas. (2016). Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). 2022, abril 28, Conogasi.org Sitio web:
https://conogasi.org/articulos/reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa-
pcr-2/