BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

UNIDAD 6: Técnicas de PCR

Prof. Elvira Bailón
 Técnicas de PCR
Ventajas
 Gran sensibilidad.
 Ventaja como técnica de amplificación de ácidos nucleicos (respecto a la
clonación con vectores recombinantes:
o Rápida.
o Automatizada.
 Ventaja como técnica de detección (respecto a las técnicas de
hibridación):
o Requiere una cantidad de muestra menor.
o Permite la cuantificación (PCR a tiempo real)

Inconvenientes
 Su gran sensibilidad, hace que se pueda amplificar cualquier
contaminación en la muestra (aerosoles, microorganismos, células de
descamación de la piel).

 Medidas de prevención: flujo de muestras, uso de EPIs, desinfección de

superficies, campana de flujo, puntas de filtro, centrifugar las muestras,
etc…
 Técnicas de PCR

Aplicaciones
 Diagnóstico de enfermedades.
 Detección de agentes infecciosos: Hepatitis, Papiloma virus, VIH,
COVID…
 Evolución y respuesta a tratamientos.
 Estudios de expresión génica.
 Detectar mutaciones y polimorfismos.
 Estudios filogenéticos.
 Genotipado.
 Medicina forense.
 Pruebas de paternidad.
 Saber Pedigrí de animales.
 Análisis de fósiles.
 Marcado de sondas.
 Técnicas de PCR

Bases teóricas
Procedimiento enzimático: catalizado por la enzima ADN polimerasa.
Se obtienen múltiples copias de ADN (a partir de una hebra molde) por
repetición secuencial de ciclos, con distinta temperatura y distinto tiempo.

Las nuevas hebras que se generan actúan como nuevas moldes: aumento
exponencial de copias en cada ciclo.

Hay que conseguir:

 Se amplifique sólo el fragmento que nos interesa: se consigue con el

diseño de unos primers específicos.

 No se inactive la ADN polimerasa con el aumento de la

temperatura: se consigue utilizando ADN polimerasas
termoestables.

https://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5gKU
 Técnicas de PCR

Primers
Son oligonucleótidos monocatenarios complementarios a las
regiones que flanquean el gen o fragmento de gen que se quiere
amplificar.

Se diseñan siempre 2 primers:

1. Cebador F o forward, sense: se une a la hebra molde que
tiene sentido 3’-5’
2. Cebador R o reverse, antisense: se une a la hebra molde
que tiene sentido 5’-3’

Los primers delimitan el inicio de la amplificación. Su secuencia

debe ser única en el ADN que se estudia para que sólo se unan a
una región del ADN.
 Técnicas de PCR

Diseño de Primers

Cosas a tener en cuenta:

1.- LONGITUD: 18-30 bases.

 < 15 bases: hay mucha probabilidad de unirse a regiones
distintas a la de interés. Poca especificidad.
 > 30 bases: más especificidad, pero se unen peor al ADN
molde.

2.- COMPOSICIÓN DE LAS BASES: Contenido C+G: 40-60%.

La región más importante del cebador es el extremo 3’, en cuanto
se une la ADN polimerasa inicia la replicación (aunque aún no esté
unido el extremo 5’).

Es importante que en el extremo 3’: no haya 3 o más G o C

seguidas, ya que son regiones que pueden aparecer con facilidad
a lo largo del genoma.
 Técnicas de PCR

Diseño de Primers
3.- SECUENCIA:
o Los primers no deben tener secuencias complementaras entre sí
(secuencias intermoleculares), que dan lugar a un problema:
Dimerización de primers.

o Tampoco deben tener secuencias complementarias

intramoleculares, que dan lugar a: Formación de horquillas y
autodimerización de primers.

4.- TEMPERATURA DE FUSIÓN (Tm): Rango 52-65ºC.

La diferencia entre la Tm de los 2 primers debe ser menor a 5ºC, para
que la eficiencia de unión al ADN molde sea similar.
Evitar secuencias repetidas
Evitar secuencias repetidas
Evitar secuencias repetidas
 Técnicas de PCR

ADN polimerasas termoestables

Para que la ADN polimerasa pueda actuar, el ADN tiene que ser
monocatenario, es decir, tenemos que desnaturalizar: calentar a 95ºC.

A esta temperatura las ADN polimerasas normales se inactivan (son

termolábiles). Antes, se solucionaba el problema añadiendo en cada ciclo
más enzima. Pero resulta caro, aumenta la probabilidad de contaminación
de la muestra.

Actualidad, el problema se ha solucionado con el descubrimiento de las

ADN polimerasas termoestables: Proceden de Arqueobacterias
extremófilas (termófilas). La ADN polimerasa de estas bacterias posee
actividad polimerasa a temperaturas elevadas.

Características de las ADN polimerasas termoestables:

 Incorporan nucleótidos en dirección 5’-3’ (leen en 3’-5’).
 Necesitan Mg2+
 Poseen actividad polimerasa: 70-75ºC. Por eso, la fase de
elongación se hace a unos 72ºC.
 Mantienen la actividad polimerasa tras tiempo prolongados de
incubación a 95ºC (más de 40 minutos): no se inactivan por calor.
 Técnicas de PCR

TIPOS: ADN polimerasas termoestables

TIPO 1.- Poseen:

 Actividad polimerasa.
 Actividad exonucleasa en 5’-3’, pero no en sentido 3’-5’, por lo que
no tienen capacidad de corregir errores.

Ejemplo: Taq polimerasa. Produce una tasa de error de 1:100.000

nucleótidos incorporados.

TIPO 2.- Tienen:

 Actividad polimerasa.
 Actividad exonucleasa 5’-3’, 3’-5’. Son enzimas con capacidad
correctora. Incorporan nucleótidos, detectan el error, lo quitan, e
incorporan el nucleótido correcto.
Ejemplo: Pfu polimerasa
Producen una tasa de error de 1: 1.000.000 nucleótidos incorporados.

TIPO 3.- Poseen:

 Actividad retrotranscriptasa inversa. Utilizan el ARN como molde
para crear ADN complementario (ADNc). Necesitan iones Mn2+.
Ejemplo: M-MULV
 Técnicas de PCR

Nomenclatura: ADN polimerasas termoestables

Se nombran según el organismo en el que se han aislado.

 1º: Mayúscula, el género.

 2º: minúscula, la especie.

Ejemplos:

o Thermus aquaticus: Taq

o Pyrococcus furiosus: Pfu

 Técnicas de PCR

CICLO BÁSICO DE UNA PCR

En cada ciclo se crea una nueva molécula de ADN por cada ADN
molde presente en la mezcla.

Consta de:
1) Desnaturalización del ADN molde.
2) Hibridación o anneling de los primers al ADN molde.
3) Extensión o elongación.

1.- Desnaturalización del ADN molde:

 Temperatura: 95ºC.
 Tiempo: 15’’-30’’.

Tiempo no muy corto: para que la desnaturalización sea completa.

Tiempo no muy largo: para que inactivar la ADN polimerasa (al
realizar todos los ciclos. Taq pol se inactiva a 40’).
 Técnicas de PCR

CICLO BÁSICO DE UNA PCR

2.- Hibridación de los primers con el ADN molde (anneling):
depende de la Tm de los primers.

_ Temperatura: 50-62ºC (entre los 2 primers, FW y RV, no hay

una diferencia de más de 5ºC).

 Tm mayor: lleva a una mayor especificidad, pero menor

rendimiento (ya que los primers hibridan peor).
 Tm menor: lleva a una menor especificidad con aparición
de productos no deseados, pero tiene un mayor
rendimiento (los primers hibridan mejor).

_ Tiempo: 30’’-60’’. Normalmente se realizan pruebas a distintas

temperaturas al principio para probar la más eficiente.
 Técnicas de PCR

CICLO BÁSICO DE UNA PCR

3.- Extensión o elongación:

_ Temperatura: la óptima de actuación de la polimerasa.

Ej:/ Taq pol 72ºC.

_ Tiempo: depende de la velocidad de polimerización de la

enzima y de la longitud del fragmento a amplificar.

Ej:/
Taq polimerasa:
Velocidad 60 nucleótidos/segundo:
o 30’’-45’’ para fragmentos menores de 1 kb.
o 1’ para fragmentos 1-1,5 kb.
o 2’ para fragmentos 1,5-3 kb.

Enzimas con actividad correctora (Pfu): se necesita más tiempo. 2’

para fragmentos 1 kb.
https://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5gKU
 Tipos de PCR

PCR CONVENCIONAL

1.- PCR Convencional:

a) PCR convencional.
b) PCR con inicio en caliente.
c) PCR de grandes fragmentos.
d) PCR de alta fidelidad.

2.- PCR anidada o nested PCR.

3.- PCR múltiple o multiplex.

4.- RT-PCR. (retrotranscripción)

5.- PCR a tiempo real.

a) Con SYBR green I.
b) Con sondas Taqman.
c) Con balizas moleculares.
d) Con sondas FRET.
 Tipos de PCR

PCR CONVENCIONAL

 Amplifica un único fragmento

de ADN.
 Utiliza un único par de
cebadores.
 En un único proceso de
amplificación a tiempo final.

 Se utiliza con fines

diagnósticos, para amplificar
secuencias menores de 3,5
kb.

Antes de poner el termociclador para hacer una PCR, tendremos:

1. Preparar la MEZCLA DE REACCIÓN.
2. Preparar LAS MUESTRAS.
3. PROGRAMAR EL TERMOCICLADOR.

Cuando termine la PCR tendremos:

4. Realizar el ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
 Tipos de PCR

PCR CONVENCIONAL: Mezcla de reacción

A la mezcla de reacción se le denomina MASTERMIX: contiene todos los
reactivos para la replicación del ADN, excepto la muestra de ADN.
COMPONENTES:
1. Tampón: Tris + KCl pH 8-9. KCl es importante para la actividad
enzimática
2. MgCl2: las ADN polimerasas necesitan el Mg2+ para funcionar.
Ej:/ Taq polimerasa necesita una concentración de MgCl2 de 1,5 mM.

3. dNTPs: los 4 dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) deben estar presentes
en la misma concentración. Se suelen suministrar a una concentración
de 10 mM (2,5 mM para cada dNTP, Stock), para poner a una
concentración final en la mastermix de 200 uM. La cantidad depende de
la longitud del fragmento a amplificar, de los iones Mg2+, y de los
primers.
4. Primers: la concentración final de los primers en la mastermix debe
estar entre 200-400 uM (ambos primers a la misma concentración).
5. ADN polimerasa: estará en la mastermix a una concentración de 1-2,5
U, para volúmenes de reacción de 50 uL. Un aumento de la cantidad de
enzima no mejora la reacción, y sí el coste de la PCR.
Preparación de una PCR.
https://www.youtube.com/watch?v=kD5NHne9WfU&t=229s
 Tipos de PCR

PCR CONVENCIONAL: Mezcla de reacción

A la mezcla de reacción le añadiremos después el ADN MOLDE, que estará
purificado con calidad y cantidad suficiente.

a) CALIDAD: Alta integridad: no degradado.

 Cociente 260/280: 1,7-2. No hay contaminación de proteínas.
 Libre de contaminantes que puedan inhibir la reacción por inactivación
de la ADN polimerasa o por secuestro del Mg2+:
 SDS, fenol/cloroformo, alcoholes.
 Para sangre (libre de hemoglobina, EDTA, heparina).
 Para tejidos (libre de colágeno, polisacáridos).
 Para tejidos incluidos en parafina (libre de xilol).
 Para plásmidos (libre de acetato sódico).

b) CANTIDAD:
 Si hay poca cantidad obtendremos un bajo rendimiento.
 Si hay mucha cantidad pueden aparecer productos no deseados.

o Plásmidos: 0,1-1 ng.

o ADN genómico bacteriano: 1-10 ng
o ADN genómico humano: 100-300 ng (no más de 500 ng, para
volúmenes de 50 uL de la mezcla de reacción).
 Tipos de PCR

PCR CONVENCIONAL: Mezcla de reacción

A la mezcla de reacción también le podemos añadir OTROS ADITIVOS Y
POTENCIADORES, cuando el rendimiento es bajo o aparecen productos
no deseados.
Estos problemas son debidos a:
 Presencia de contaminantes.
 La naturaleza del ADN molde.
 La naturaleza de los primers.

Se pueden adicionar:
 Betaína, formamida, DMSO: para disminuir la Tm del ADN molde.
 Glicerol, gelatina, polietilenglicol (PEG): para estabilizar a la Taq
polimerasa.
 BSA (bovine serum albumine): se une y bloquea los inhibidores de
la PCR.
 Sulfato amónico: facilita la desnaturalización.
 Tween 20, NP40, Triton X100 (son detergentes no iónicos):
previenen de la agregación de la ADN polimerasa.
 Tipos de PCR

PCR CONVENCIONAL: Preparación de las muestras

La preparación de las muestras requiere:
a) Ajustar el volumen de la reacción: Normalmente es 25 o 50 uL.
b) Elaborar la mastermix. Para ello, hay que calcular el volumen de cada
reactivo que se añadirá a la mastermix, teniendo en cuenta que vienen
a una concentración (Stock) y tienes que estar a una concentración
final en la mezcla.
Para que la mezcla de reacción sea homogénea en todas las muestras y
no prepararla una por una por separado, se hace una ÚNICA MEZCLA
(por eso se llama MASTERMIX).

La cantidad de cada componente de la mezcla = cantidad para 1

muestra x número de muestras.

c) En el número de muestras incluiremos: nuestras muestras + 1 muestra

(para que sobre mezcla de reacción y no falte) + 1 (control positivo) + 1
(control negativo).
 Control positivo: un ADN control con el fragmento que se quiere
amplificar.
 Control negativo: un tubo donde no añadiremos ADN. La cantidad
que se debería añadir de ADN se añade de agua.
 Tipos de PCR

PCR CONVENCIONAL: Programación del termociclador

El termociclador llevará a cabo de forma automatizada la repetición de
ciclos combinando diferentes temperaturas y tiempos.
Para amplificar un fragmento de ADN hay que incluir 3 etapas:
1. Desnaturalización.
2. Ciclos que se van a repetir “X” veces.
3. Extensión final.

1.- DESNATURALIZACIÓN INICIAL: Se repite sólo una vez. Para asegurar

una desnaturalización inicial completa.
 Temperatura: 94-95ºC
 Tiempo: 3’-5’.

2.- Ciclos de replicación: se programan X ciclos, entre 25-35 ciclos (máximo

40). Si el fragmento a amplificar es más abundante, se programan menos
ciclos. No se puede aumentar más de 40 ciclos porque se producen
productos no deseados y la ADN polimerasa pierde actividad.
Cada ciclo constará:
a) DESNATURALIZACIÓN: 95ºC 30’’
b) ANNELING: 50-65ºC 30’’
c) EXTENSIÓN: 72ºC (para Taq pol) 45’’
 Tipos de PCR

PCR CONVENCIONAL: Programación del termociclador

3.- EXTENSIÓN FINAL: se repite sólo una vez. Se programa la temperatura
óptima de la enzima, 72ºC (taq pol), durante 5’-10’, para asegurar que
todos los fragmentos están completos y en forma de doble hélice.

4.- MANTENIMIENTO: 4ºC sin límite. A esa temperatura se anula la

actividad de la polimerasa y las muestras se mantienen sin degradarse.
 PCR convencional

Análisis de los productos amplificados

Una vez ha terminado la PCR, se sacan los tubos del termociclador y se
procede a analizar los resultados (detección de los genes amplificados).
Para ello, se lleva a cabo con una ELECTROFORESIS EN GELES DE
AGAROSA.
Agarosa: concentración 0,5%-2%, dependiendo del tamaño de los
fragmentos. (disuelto en tampón TAE o TBE).
RESULTADOS:
 La presencia de 1 sola banda indica que la PCR ha funcionado
correctamente, es decir, que la secuencia se ha amplificado y se ha
detectado. Resultado positivo
 No aparece banda: resultado es negativo, no está la secuencia diana.
 El pocillo con el control negativo (no muestra): sin banda.
 El pocillo con el control positivo (con ADN conocido): con banda.

Resultados raros:
 Varias bandas: indican productos no deseados. Se repite la PCR
variando condiciones (componentes de la mastermix, condiciones de la
PCR…)
 Control negativo con banda: ha habido contaminación con ADN
(micropipetas, algún reactivo…).
Línea 1: fragmento de PCR de aproximadamente 1850 pares de bases de longitud.
Línea 2 y 4: los fragmentos son de aproximadamente 800 bases de longitud.
Línea 3: no hay producto formado, la PCR falló o el ADN de la muestra no contiene la
secuencia.
Línea 5: múltiples bandas son formadas a causa de que los primers se unieron a diferentes
regiones del molde de DNA (productos no deseados).
 PCR convencional

Soluciones para disminuir los productos no deseados

 Subir la Tm 2-5ºC.
 Reducir el tiempo de anneling. NO LIBRO
 Disminuir número de ciclos.
 Diseñar otros primers.
 Ajustar la concentración de Mg2+: Estabiliza el DNA de doble cadena y
eleva la Tm. Una concentración insuficiente de Mg2+ en la mezcla de
PCR puede provocar el fracaso de la reacción.
 Mg2+ bajo: bajo rendimiento de producto de PCR.
 Mg2+ alto: aumenta el rendimiento pero favorece la inespecificidad,
promoviendo la incorporación errónea de nucleótidos, causando la
generación de productos no deseados. En un gel aparecen bandas
como una escalera.

 Los iones Mg2+ se unen a los dNTPs, por lo que si cambiamos la

concentración de dNTPs en el buffer hay que ajustar la concentración
de Mg2+. Más dNTPs (cuando quiero amplificar secuencias largas)
añadimos más Mg, menos dNTP (para evitar productos inespecíficos)
quitamos Mg.

 EDTA que arrastremos del ADN molde puede afectar a la concentración

de Mg2+ libre, ya que es un quelante.
 Tipos de PCR
Modalidades de PCR convencional
PCR con inicio caliente
Se basa en evitar la actividad de la polimerasa a bajas temperaturas, para
eliminar el problema de productos de amplificación no deseados.

Hay varias alternativas:

1.- Preparando la mezcla de reacción sin ADN polimerasa. Una vez que
los tubos están en el termociclador y la temperatura sea mayor de 65ºC se
añade la ADN polimerasa.
Problema: muy engorroso, también aumenta el riesgo de contaminación.

2.- Aislando la ADN polimerasa del resto de componentes de la mezcla:

incluyendo la enzima dentro de esferas de cera, que sólo se funden
cuando se alcanzan temperaturas elevadas en el termociclador y la
polimerasa entonces se libera.

3.- Suministrando la ADN polimerasa inactiva: se bloquea con un

anticuerpo o con un grupo químico bloqueante (unión termolábil).
Cuando se alcanzan Tª elevadas en el termociclador, el anticuerpo se
desnaturaliza o se rompe la unión entre el grupo químico y la enzima.
 Tipos de PCR
Modalidades de PCR convencional
PCR de grandes fragmentos
Sirve para amplificar fragmentos entre 5 y 35 kb. Tienes las siguientes
características:
1.- Mezcla de la reacción:
a) Mezcla de ADN polimerasas: para evitar errores de incorporación de
nucleótidos al ser un fragmento más grande. Se combinan:
 Una ADN polimerasa sin actividad correctora (a mayor
concentración).
 Una ADN polimerasa con potente actividad correctora (a baja
concentración).

b) Uso de aditivos: se incluyen glicerol (para estabilizar las ADN

polimerasas), el DMSO (que favorece la desnaturalización).

c) Concentraciones bajas de potasio en el tampón de reacción: se

favorece la eficiencia de amplificación en fragmentos grandes.

2.- Programación en el termociclador:

 Se aumenta el tiempo de extensión (hasta 25 minutos).
 Los tiempos de desnaturalización se acortan (2’’-10’’) para
minimizar la inactivación de las polimerasas.
 Tipos de PCR
Modalidades de PCR convencional
PCR de alta fidelidad

Son PCR realizadas en condiciones especiales para evitar

introducir mutaciones por incorporación de nucleótidos erróneos.

1.- Utilización de ADN polimerasas termoestables con actividad

correctora.

2.- Ajustar el pH de la mezcla de reacción, según la enzima

utilizada.

3.- Ajustar la concentración de Mg2+. Un exceso suele disminuir

la fidelidad de las polimerasas.
 Otros tipos de PCR
PCR anidada o nested-PCR
Son 2 reacciones de PCR acopladas, de manera que la segunda PCR
utiliza como ADN molde los productos de amplificación de la
primera.

Se usa cuando:
 Rendimiento de la PCR estándar es bajo (poca cantidad de
producto amplificado).
 Para aumentar la especificidad en los casos donde no se
puede evitar la formación de productos no deseados.

Los primers utilizados son:

a) En la primera PCR: CEBADORES EXTERNOS. Se diseñan para
amplificar un fragmento de mayor longitud que incluye la
región de interés.

b) En la segunda PCR: CEBADORES INTERNOS. Se diseñan para

amplificar la región de interés e hibridan en el interior del
fragmento amplificado en la primera PCR.
PCR anidada o nested-PCR
 Otros tipos de PCR
PCR múltiple o Multiplex PCR

Consiste en la amplificación de varias secuencias diana

simultáneamente, en el mismo tubo, en un sola PCR, mediante la
adicción de varios cebadores a la vez, cada uno específico para
amplificar una región diferente.

Requisitos de los primers:

 La Tm de todos los cebadores debe ser similar, porque se
va a usar un único programa en el termociclador, y todos
deben unirse al ADN molde con la misma eficiencia.
 Los amplicones generados por cada pareja de primers
tienen que tener un tamaño bastante diferente para poder
ver las bandas separadas en el gel de agarosa.
 Deben diseñarse para que no hibriden unos con otros.

Se debe incluir un CONTROL POSITIVO INTERNO: es decir, añadir

una pareja de primers que amplifiquen una secuencia control
que siempre debe estar presente en el ADN problema.
 Otros tipos de PCR
PCR múltiple o Multiplex PCR
RESULTADOS:
1. Resultado positivo,
expresión: se observan
mínimo 2 bandas, la
específica del gen que
queremos ver y la del control
positivo. Tantas bandas como
genes a amplificar con sus
primers correspondientes.

2. Resultado no expresión,
negativo: se visualiza sólo la
banda del control positivo.

3. PCR no válida: no se observa

ninguna banda, lo que indica
la presencia de inhibidores
de la PCR.
Sarcocystis
 Otros tipos de PCR
RT-PCR, PCR por transcripción inversa
Se utiliza cuando hay que amplificar partiendo de una muestra con
ARNm.

A.- Paso previo: pasar el ARNm a ADNc (complementario) mediante la

retrotranscriptasa (RT) o transcriptasa inversa. Para ello se pueden seguir
3 estrategias:
1) Utilizar un Random primer: se utiliza una mezcla de hexámeros
como primers que hibridan al azar en múltiples posiciones del ARN
de la muestra. Así se transcribe todo el ARN de la muestra a ADNc.
2) Utilizar un cebador Oligo-dT: hibrida con la cola poli-A de los
ARNm. Se transcribe así todo el ARN de la muestra a ADNc.
3) Usar un cebador específico de una secuencia determinada (SSPs,
Sample Specific Primers): Sólo se transcribe a ADNc un fragmento
de ARN que contiene la secuencia que se quiere amplificar.

B.- En el siguiente paso se lleva a cabo una PCR, donde la ADN polimerasa
utiliza el ADNc como molde para la amplificación.

Los 2 pasos se pueden realizar en 2 tubos diferentes o en el mismo tubo.

 cDNA

Amplificación por PCR

 Otros tipos de PCR
PCR a tiempo real
La amplificación se monitoriza con el empleo de productos
fluorescentes, que pueden detectar la cantidad de amplicones en
cualquier momento de la PCR.

Se visualiza en la pantalla del termociclador, unos gráficos de

intensidad de fluorescencia respecto al número de ciclos. Son las
CURVAS DE AMPLIFICACIÓN.

Ventajas:
 Mayor rapidez, los resultados son inmediatos al finalizar la
PCR.
 Resultados más fiables, que cuantificar las bandas de un gel
de agarosa.
 Minimiza los problemas de contaminación.
 Permite la cuantificación: la intensidad de fluorescencia va
a ser proporcional a la cantidad de ADN amplificado.
 PCR a tiempo real
Curvas de amplificación
Son de tipo sigmoide y representan la emisión de fluorescencia en
cada ciclo de la PCR respecto al ciclo en el que se produce.
Son producidas en la pantalla del termociclador en cada reacción.

Posee 3 zonas diferenciadas:

1) Zona o fase de ruido: se detecta una señal de fluorescencia
de fondo. Corresponde a los primeros ciclos de la PCR. No
hay amplicones suficientes para que el aparato los detecte.
Cuanto menor es la cantidad de muestra, más ciclos se
necesitan para obtener un número de amplicones por
encima del nivel de detección.

2) Fase de crecimiento exponencial: gran pendiente, es la

producción de amplicones.

3) Fase de meseta: pendiente muy reducida debido al

agotamiento de nucleótidos, pérdida progresiva de
actividad de la polimerasa, saturación de la enzima, etc…
FASE DE RUIDO FASE DE
CRECIMIENTO
FASE DE MESETA
EXPONENCIAL
 PCR a tiempo real
Sistemas fluorescentes de detección

1.- Sistemas de detección independientes de secuencia.

 SYBR Green I.

2.- Sistemas de detección específicos de secuencia.

a) Sondas de hidrólisis o sondas Taqman

b) Balizas moleculares.
c) Sondas FRET.

https://www.youtube.com/watch?v=vLya5A_TlPs
https://www.youtube.com/watch?v=C_luFY8mG2g OK
 PCR a tiempo real
Sistemas fluorescentes de detección
1.- Sistemas de detección independientes de secuencia

Se emplean agentes fluorescentes

intercalantes (SYBR green I), que
aumentan su fluorescencia cuando se
intercalan en el ADN de doble hélice.

Por tanto:
Un aumento de fluorescencia en esa PCR
significará incremento de amplicones.
La medida de fluorescencia se realiza a
final de cada ciclo (después de la
extensión) ya que ahí se encuentran como SYBR Green I entre las cadenas
de la doble hélice
doble hélice.

Inconveniente:
 Baja especificidad: el agente intercalante se une a cualquier
molécula de ADN en doble hélice, incluyendo los productos no
deseados y los dímeros de cebadores.
(A) Cuando el ADN está
desnaturalizado, SYBR Green
I se encuentra libre y emite
poca fluorescencia.

(B) SYBR Green I se une al ADN

de doble hélice y emite una
mayor fluorescencia.
 PCR a tiempo real
Sistemas fluorescentes de detección
2.- Sistemas de detección específicos de secuencia

Se emplean sondas marcadas con fluorocromos que hibridan de

forma específica en la región central del amplicón.

Ventaja:
 Especificidad: Sólo hibridan con los secuencias deseadas.

Inconveniente:
 Si usáramos una sonda marcada con fluorocromo normal, se
emitiría fluorescencia siempre, esté o no unida a la secuencia
diana. Para solucionar este problema se utilizan distintas
estrategias:
a) Sondas de hidrólisis o sondas Taqman
b) Balizas moleculares.
c) Sondas FRET

Y hay que comprender el principio de transferencia de energía

por resonancia (FRET).
 PCR a tiempo real
Sistemas fluorescentes de detección
2.- Sistemas de detección específicos de secuencia
Principio de transferencia de energía por resonancia (FRET,
Fluorescence resonance energy transfer).
Consiste en la transferencia de energía lumínica de un fluorocromo a
otro. Para que esto ocurra, ambos fluorocromos:
 Deben estar próximos físicamente.
 El espectro de emisión del primer fluorocromo tiene que solaparse
con el espectro de excitación del segundo fluorocromo.
 El fluorocromo que transfiere energía se denomina donante,
notificador (reporter) y el que la recibe se denomina aceptor
(quencer).
 El quencer puede ser o no fluorescente.
El fluorocromo donante absorbe energía cuando se excita con una
longitud de onda adecuada, y en lugar de emitir fluorescencia
transfiere esa energía al fluorocromo aceptor, el cual, si es un quencer
fluorescente, a su vez se excita y emite su fluorescencia
característica.
Si el quencer no es fluorescente, actúa de bloqueador.
 PCR a tiempo real
Sistemas fluorescentes de detección
2.- Sistemas de detección específicos de secuencia

Para que se produzca, es necesario que el espectro de emisión del

fluorocromo donante se solape en parte con el espectro de excitación
del fluorocromo aceptor (zona gris).
 PCR a tiempo real
Sondas de hidrólisis o sondas Taqman
Tienen un fluorocromo donante (notificador,
reporter) en el extremo 5’ y un quencer en el
extremo 3’, que actúa como neutralizante o
apantallador y evita que el reporter emita
fluorescencia.

La sonda hibrida en la región central de la

secuencia a amplificar y, para evitar que la ADN
polimerasa pueda extenderlo, tiene el extremo 3’
fosforilado.
La fluorescencia se mide al final de la fase de
extensión de cada ciclo.

Cuando la sonda está entera, libre en solución o

unida al ADN molde, la excitación del reporter
provoca una transferencia de energía fluorescente
hacia el quencher, pero no hay emisión de
fluorescencia (1 y 2).
Durante la fase de extensión, la ADN polimerasa
rompe la sonda, nucleótido a nucleótido, con su
actividad exonucleasa 5’-3’, el reporter y el
quencher se liberan al medio y se separan (3 y 4).
Al final de la extensión, el reporter libre ya es
capaz de emitir fluorescencia (5).
 PCR a tiempo real
Balizas moleculares o molecular beacons
Tienen un fluorocromo donante (notificador,
reporter) en el extremo 5’ y un quencer en el
extremo 3’, el quencer está bloqueando al
notificador.
o Los extremos son secuencias cortas
repetidas e invertidas. Por lo que hibridan
entre sí.
o La parte central: es la secuencia
complementaria a la secuencia diana.

 En condiciones normales: Las sondas adquieren

una estructura en forma de horquilla, ya que sus
extremos son complementarios. Entonces, el
reporter está bloqueado por el quencer. La zona
central forma un bucle.

 En PCR: después de la desnaturalización, la

sonda se abre, la secuencia central se une a la
secuencia diana del ADN y los fluorocromos se
separan. En estas condiciones es cuando se
detecta fluorescencia (que se mide al final de la
fase de hibridación).
 PCR a tiempo real
Sondas FRET

Son parejas de sondas que hibridan en la

zona central del amplicón.

 Una de las sondas porta el reporter en

extremo 3’.
 La otra sonda porta el quencer
fluorescente en extremo 5’.

En la fase de hibridación, las sondas quedan

muy próximas, entonces, la excitación del
reporter provoca transferencia de energía al
quencer, que se excita y emite fluorescencia.

La fluorescencia se mide al final de la fase de

hibridación: excitando a la longitud de onda
del reporter y detectando en al longitud de
emisión del quencer.
 PCR a tiempo real
Aplicaciones

1.- qPCR. Cuantificación de la cantidad inicial (y expresión) de

una secuencia en una muestra.

El termociclador detecta el ciclo de PCR en el que la fluorescencia

de la muestra alcanza un valor por encima del límite de
detección: PUNTO DE CORTE, Cp (crossing point) o CICLO
UMBRAL, Ct (threshold cycle).

o El Ct es el ciclo en el que se pasa de la zona de ruido a la de

crecimiento exponencial.
o Es inversamente proporcional a la cantidad inicial de
secuencia diana.
o Cuanto mayor sea el número de secuencias diana en la
muestra, menos ciclos de PCR serán necesarios para
alcanzar el Ct.

La qPCR se realiza en estudios de expresión génica,

cuantificación de cargas virales, respuesta a fármacos…
qPCR con diluciones de la misma muestra
 PCR a tiempo real
Aplicaciones

La cuantificación se puede expresar de 2 formas:

1) Cuantificación absoluta: cantidad de secuencia diana en la
muestra en unidades de concentración (ug/uL) o en número
de copias/volumen.
 Requiere utilizar patrones conocidos de ADN.
 El software del termociclador elabora una curva de
calibración con estos patrones e interpola el Ct de cada
muestra para calcular el resultado.

https://www.youtube.com/watch?v=C_luFY8mG2g

2) Cuantificación relativa: expresar la concentración de la

secuencia diana en relación con la concentración de un gen
de referencia que está presente en todas las muestras con un
número constante de copias. No es necesario una curva
patrón.
https://www.youtube.com/watch?v=n3SZlsoKOoo
https://www.youtube.com/watch?v=Kkle8T7aXjk Cálculo de ΔCt de excel
Genes de referencia
para normalizar
resultados:
 TBP: proteína de
unión a TATA.
 GADPH:
Gliceraldehído-3-
fosfato
deshidrogenasa

Se analizan los
resultados frente a una
situación basal:
 Tiempo= 0 (antes de
estimular.
 Paciente sano.
 Células sin modificar.
 PCR a tiempo real
Aplicaciones
2.- Detección de mutaciones puntuales y productos no deseados
Se lleva a cabo con la CURVA de FUSIÓN, gráfica que se obtiene
representando la fluorescencia frente a temperatura.

Las realiza el mismo termociclador y para obtenerlas, una vez

finalizada la PCR, se disminuye la temperatura para que todo el ADN
se encuentre en forma de doble hélice y luego se vuelve a
desnaturalizar. Así se detectan productos no deseados y posibles
mutaciones, ya que ambos aparecen en forma de picos, diferentes al
pico grande del amplicón.

3 tipos de curvas:
a) Curvas con un único pico de fusión (correspondiente con la
Tm de la sonda): indica que el ADN molde no presenta
mutaciones.
b) Curvas con un único pico de fusión a una temperatura menor
que la Tm de la sonda: presencia de mutación en homocigosis.
c) Curvas con 2 picos de fusión, uno a la Tm de la sonda y otro a
una temperatura menor que la Tm de la sonda: presencia de
mutación en heterocigosis.
No se observan
productos
inespecíficos

Se observan
productos
inespecíficos en una
de las muestras
Vídeos aclarativos:

Preparar una PCR:

https://www.youtube.com/watch?v=DZ7uNG9dy0E

Preparación del gel de agarosa, preparar muestras para la

electroforesis:
https://www.youtube.com/watch?v=U1g2qt3juZw

Preparar y realizar una electroforesis, observación de las

bandas en el transiluminador:
https://www.youtube.com/watch?v=NL1usCc0n38