TEMA 6.

PCR
1. ¿Qué es la PCR y qué permiten las diferentes variantes que se han desarrollado?

La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias
iguales de un fragmento concreto de ADN, a partir de una cantidad mínima de ADN molde

Las diferentes variantes permiten:

- Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción
- Amplificar fragmentos de ARN
- Cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico presente en una muestra.
2. ¿Qué son los cebadores que tipos hay y dónde se unen?

Los cebadores, también llamados primers son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria a las regiones
que flanquean el fragmento de ADN que se quiere amplificar. Se diseñan por parejas y cada uno es complementario de una
secuencia adyacente a la región de interés, pero en extremos y cadenas opuestas

- Cebador F: se unen en dirección 3´5´ a la hebra molde

- Cebador R: se unen en dirección 5´3´ a la hebra molde

3. ¿Qué función o funciones tiene el juego de cebadores?

Un juego de cebadores define y delimita la región diana que se va a amplificar para conseguir este objetivo su secuencia debe ser
única en el ADN que se estudia

Hace posible la amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN de entre una mezcla compleja de moléculas

4. Requisitos que deben cumplir los cebadores

- Longitud: entre 18-30 nucleótidos, por debajo de 15 no son específicos
- Secuencia: no deben contener secuencias complementarias inter ni intramoleculares para evitar la formación de
estructuras secundarias de tipo horquilla y la formación de dímeros de cebadores
- Composición de las bases: los mejores resultados se contienen con un contenido en guanina-citosina comprendido
entre 40-60%
- Temperatura de fusión: debería estar en el rango de 52 a 65ºC además la diferencia de Tm de los cebadores debería ser
menor a 5ºC
5. ¿Qué son las ADN polimerasas termoestables y cuáles son sus características diferenciales?

Son enzimas aisladas de un grupo especial de arqueobacterias extremófilas (termófilas) con actividad polimerasa a temperaturas
elevadas

Características diferenciales:

- La temperatura óptima para realizar su actividad polimerasa es entre 70-75ºC

- Mantienen su actividad polimerasa tras tiempos largos de incubación a 95ºC lo que garantiza que la polimerasa no se va
a inactivar durante las fases de desnaturalización de ADN
6. Tipos de ADN polimerasas termoestables y función
- Con actividad exonucleasa 5´3´ pero sin actividad exonucleasa 3´5´: no son capaces de eliminar nucleótidos mal
incorporados. EJEMPLO: Taq ADN polimerasa
- Con actividad exonucleasa 5´3´ y actividad exonucleasa 3´5´: tienen actividad correctora, nucleótido incorrecto lo
elimina y es capaz de coger el oligonucleótido siguiendo la cadena
- Con actividad transcriptasa inversa: Utilizan ARN como molde en presencia de cationes de magnesio pueden utilizarse
para amplificar y sintetizar ADN copia a partir de ARN
7. ¿De qué fases consta un ciclo básico de la PCR? Explícalas

FASE I. Desnaturalización del ADN molde: Se separan las dos cadenas de la molécula de ADN y normalmente se realiza a 94-95ºC
entre 15-30 segundos

FASE II. Hibridación: Cada cebador o primer se une a su secuencia diana, el cebador F a una hebra molde que está en dirección 3
´5´ y el cebador R a la otra hebra molde que está en dirección 5´3´. Se realiza habitualmente entre 50-60ºC

FASE III. Extensión: Se sintetizan dos nuevas cadenas de ADN de longitud muy superior al fragmento que queremos amplificar
porque la ADN polimerasa continúa replicando la hebra molde hasta que se inicia la desnaturalización del segundo ciclo. Se realiza
a la temperatura de óptima de polimerización de la enzima empleada, en el caso de la Taq es 72ºC a una velocidad de 60n/s
 8. ¿Qué contiene la mezcla de reacción de PCR? Explicar cada reactivo

Consiste en un tampón adecuado que contendrá disueltos todos los reactivos necesarios para la replicación del ADN, éste aporta el
pH y concentración salina adecuados para la óptima actividad de la ADN polimerasa (pH 8´3-9 y TRIS KCl)

1- Cloruro de magnesio (MgCl2): Las ADN polimerasas requieren iones Mg 2+ como cofactor para desarrollar su
actividad, si se aportan en una concentración muy baja o hay ausencia inactiva a la ADN polimerasa y si hay una
concentración excesivamente alta determina una menor fidelidad en la replicación. EJEMPLO: Taq ADN
pol1,5mM
2- Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs): Debe contener los cuatro desoxinucleótidos que componen el ADN para que
la ADN polimerasa pueda usarlos como sustrato, siempre en los cuatro en la misma concentración
3- Cebadores: La concentración final de cebadores en la muestra debe ser la misma y depende de la pareja que
estemos utilizando, tienen secuencias complementarias a la hebra molde
4- ADN polimerasa: Se suministran concentradas en soluciones con un 50% de glicerol. Replica la hebra molde
gracias a los cebadores que se unen a ella
5- Muestra o ADN molde: Contiene el fragmento de interés que queremos amplificar
6- Otros aditivos y potenciadores
9. Para que una PCR se desarrolle de manera óptima ¿qué debemos tener en cuenta fijándonos en la muestra o ADN
molde?

La calidad y la cantidad del ADN molde:

- Calidad del ADN molde

Alto grado de integridad, es decir, ADN de alto peso molecular, no degradado ni fragmentado y sin mellas
Pureza, cociente A260/A280 entre 1,7-2. Esto garantiza que no esta contaminado por proteínas
Libre de contaminantes que puedan inhibir la reacción de PCR bien la inactivación de la polimerasa o por que secuestre
cationes de Mg libres
- Cantidad de ADN molde
ADN plasmídico0,1-1ng
ADN genómico bacteriano1-10ng
ADN genómico humano100-300ng
No es aconsejable sobrepasar los 10ng de ADN/microlitro de ADN de reacción
10. Aditivos utilizados en PCR y mecanismo de acción

DMSO Disminuyen la
Formamida Tm del ADN
Betaína molde
Gelatina Estabilizan la Taq
Glicerol ADN polimerasa
Polietilenglicol
Albúmina bovina Une y bloquea
(BSA) inhibidores de
PCR
Sulfato amónico Facilita la
desnaturalización
Detergentes no Previenen la
iónicos agregación de la
Tween-20 ADN polimerasa
Np-40
Triton X-100

11. Pasos para la preparación de las muestras y explicación

1- Ajustar el volumen de reacción
Hay que decidir el volumen fin en el que se llevará a cabo la reacción normalmente 25-50microlitros, como los
reactivos se suministran concentrados una vez fijado el volumen hay que calcular el volumen de cada reactivo que
hay que añadir a la mezcla dependiendo de su concentración final
La diferencia entre los volúmenes de cada componente y el volumen final se completa con agua estéril grado PCR
o agua miliQ
2- La mezcla máster o master mix
Se prepara una única mezcla de reacción que incluya todos los componentes excepto el ADN molde
La cantidad de cada componente se calcula multiplicando la cantidad necesaria de la reacción por el número de
muestras teniendo en cuenta el control positivo y negativo de la muestra y el extra por si hay algún error de
medición
Una vez preparada se añade a los respectivos tubos con el ADN molde
3- Control positivo y negativo
Control positivo, se añade mezcla máster a un tubo con el ADN molde control que contiene el fragmento que se
quiere amplificar
 Control negativo o blanco, se añade mezcla máster a un tubo que contenga agua estéril de manera que no habrá
ADN presente
12. Nombra y explica las diferentes modalidades de la PCR estándar
- PCR con inicio en caliente: se basa en eliminar la actividad de la enzima polimerasa a bajas temperaturas para evitar la
aparición de productos de amplificación no deseados relacionado con la naturaleza de los cebadores
- PCR de grandes fragmentos: permite aumentar el rendimiento cuando se amplifican fragmentos de entre 5-35kb
- PCR de alta fidelidad: son PCR realizadas en condiciones especiales para evitar introducir en los amplicones mutaciones
puntuales por incorporación de nucleótidos erróneos. Utilizar ADN polimerasas termoestables con actividad correctora
y ajustando el pH de la mezcla de reacción y la concentración de Mg 2+, dependiendo de las enzimas se necesitará un pH
más alto o más bajo, un exceso de cationes de Mg puede disminuir la fidelidad de las polimerasas
13. Estrategias para lograr una PCR con inicio en caliente

Se basa en eliminar la actividad de la enzima polimerasa a bajas temperaturas para evitar la aparición de productos de
amplificación no deseados relacionado con la naturaleza de los cebadores:

- Preparando la mezcla de reacción sin la ADN polimerasa: Puesto en marcha el termociclador se añade la enzima tubo a
tubo cuando la temperatura llegue a 65ºC. Esta metodología aumenta el riesgo de contaminación
- Aislando la ADN polimerasa del resto de componentes de la mezcla, la enzima se incluye en esferas de cera, de manera
que al alcanzar una temperatura elevada la cera se funde y las libera
- Suministrando la ADN polimerasa inactiva bloqueándola con un anticuerpo específico o uniéndola por unión termolábil
a un grupo bloqueante. Al alcanzar la temperatura de desnaturalización inicial, se desnaturaliza el anticuerpo
bloqueante o se rompe la unión termolábil al grupo químico que estaba unida, así recobra su actividad
14. ¿Qué cambios deben hacerse en la mezcla de reacción y en termociclador para conseguir hacer una PCR de grandes
fragmentos?
Mezcla de reacción
o Mezcla de ADN polimerasas: se emplean dos ADN polimerasas termoestables
 Una mayoritaria (elevada concentración): sin actividad correctora
 Una minoritaria (baja concentración): con potente actividad correctora (exonucleasa 3´5´)
o Uso de aditivos
 Glicerol que estabiliza las ADN polimerasas
 DMSO, favorece la desnaturalización
o Concentraciones bajas de potasio en el tampón de reacción que favorecen la eficiencia amplificación de
fragmentos largos

Termociclador: Hay que aumentar el tiempo de extensión en cada ciclo, de hasta 25 minutos aunque los tiempos de
desnaturalización se acortan a 2-10 segundos para minimizar la inactivación de las polimerasas

15. Define y explica la PCR anidada

Consiste en la realización de dos reacciones PCR acopladas, de manera que la segunda PCR utiliza como ADN molde los productos
de amplificación de la primera.
Se usan:
- Cuando el rendimiento de la PCR es bajo
- Para aumentar la especificidad
- Evitar el acúmulo de productos no deseados con una PCR estándar
Los cebadores usados en ambas PCR son distintos:

- Cebadores externos: En la primera PCR se diseñan para amplificar un fragmento de mayor longitud que incluye la región
de interés
- Cebadores internos: En la segunda PCR se diseñan para amplificar la región de interés e hibridan en el interior del
fragmento amplificado en la primera PCR

La muestra que se tiene que amplificar en la 2ªPCR es el producto de reacción de la 1ª PCR de manera que los amplicones
producidos en la 1ª se utilizarán como ADN molde en la 2ªPCR para reamplificar la región de interés que está contenida su
secuencia

16. Define la PCR múltiple o Multiplex PCR y qué requisitos debe tener

Consiste en la amplificación de varias secuencias diana a la vez en el mismo tubo en una sola reacción de PCR

Requisitos:

- La temperatura óptima de hibridación de todos los cebadores para hibridar con su diana debe ser similar ya que solo se
usa un único programa en el termociclador y todos los cebadores deben unirse con la misma eficacia
- Los amplicones generados por cada pareja de cebadores deben tener un tamaño suficientemente diferente para
separase en la electroforesis y visualizarse como bandas individuales
- Los cebadores deben diseñarse de manera que no hibriden formando dímeros u oligómeros
 17. En qué consiste la incorporación de un control positivo interno

Es la aplicación más sencilla de la PCR múltiple y consiste en añadir a la mezcla de reacción una pareja de cebadores diseñados
para amplificar una secuencia control que tiene que estar presente en el ADN molde problema

De esta manera, los resultados negativos se confirmar directamente en una única PCR sin necesidad de realizar una PCR adicional
de control positivo. Los resultados pueden ser:

- Positivo: Se observan dos bandas, la de control positivo y la específica de la secuencia que se está estudiando
- Negativo: Se visualiza solo una banda del control positivo
- PCR no válida: no hay banda
18. PCR con transcripción inversa o RT-PCR y pasos previos

Permite amplificar y analizar moléculas de ARN

1. Un paso previo de síntesis de ADNc mediante una retrotranscriptasa
2. Un segundo paso que un ADN polimerasa termoestable utiliza el ADNc como molde y lo amplifica
Estos dos pasos se pueden realizar en dos tubos independientes o en un mismo tubo
19. Estrategias para la trascripción del ARN molde

A partir de un ARN purificado se pueden seguir tres estrategias:

- Random priming para marcar sondas, los cebadores empleados son una mezcla de hezanucleótidos, que hibridan al
azar en múltiples posiciones de todas las moléculas de ARN presentes en la muestra. Con esta estrategia se transcribe
todos el ARN de la muestra a ADNc
- Usar como cebador un oligo-dT que hibridará con las colas de poli-A de los ARNm presentes en la muestra. Con esta
estrategia se transcribe ADNc todas las moléculas de ARNm
- Usar un cebador específico de una secuencia determinada, más concretamente, uno de los cebadores que se va a
utilizar en la PCR anterior. Con esta estrategia se transcribe un fragmento de ARN que contiene la secuencia que
queremos amplificar
20. PCR a tiempo real y ventajas

Se monitoriza el proceso de amplificación mediante productos fluorescentes, asi la detección de los amplicones se realiza ciclo a
ciclo. Para ello el termociclador incorpora un lector de fluorescencia de manera que permite medir la intensidad en cada tubo de
reacción en cualquier momento de la PCR

Ventajas:

- Mayor rapidez en la detección cuantitativa de secuencias diana, ya que el resultado se puede obtener incluso antes de
que termine la PCR
- Resultados más fidedignos. La detección instrumental de fluorescencia es más objetiva y sensible que la tinción con
bromuro de etidio de un gel de electroforesis
- Minimiza los problemas de contaminación ya que la amplificación y la detección se realizan en el mismo tubo cerrado
- Permite la cuantificación, tanto de los amplicones producidos como del ADN diana inicial presente en la muestra
21. Explica la curva de amplificación

La curva de amplificación es una curva de tipo sigmoidea que se obtiene al representar la emisión de fluorescencia en cada ciclo de
PCR respecto el número de ciclos en que se produce

Va a tener tres zonas:

1. Zona de ruido: los primeros ciclos en los que el número de amplicones sintetizados está por debajo del nivel de
detección del aparato
2. Zona de crecimiento exponencial: es lineal y de gran pendiente abarca un número reducido de ciclos 4-6
3. Zona de meseta: lineal, de pendiente reducida debido a la disminución del rendimiento en los últimos ciclos de
PCR, probablemente por agotamiento de sustratos, pérdida progresiva de la actividad polimerasa, saturación de la
enzima, etc.
 22. Nombra y explica los sistemas fluorescentes de detección de amplicones

Sistemas de detección independientes de secuencias:

Se basan en el empleo de agentes fluorescentes intercalantes. Los agentes intercalantes son sustancias fluorescentes que
aumentan su emisión cuando se intercalan en el ADN de doble hélice

El principal inconveniente es que este sistema es de baja especificidad, y que se une a cualquier molécula de ADN en doble hélice,
incluyendo los productos inespecíficos no deseados y dímeros cebadores

Sistemas de detección específicos de secuencia

Se basan en la utilización de sondas oligonucleótidos marcadas con fluorocromos que hibridan de manera específica en la región
central del amplicon. La fluorescencia se asocia solo con los productos deseados

- Sondas de hidrólisis o TaqMan son oligonucleótidos sintéticos que tienen un fluorocromo donante denominado
notificador o reporter en el extremo 5´ y un quencher en el extremo 3´. Para evitar que la ADN polimerasa pueda
extender el fragmento tienen el extremo 3´fosforilado. La fluorescencia se mide al final de la fase de extensión de cada
ciclo
- Las balizas moleculares, son un tipo especial de sonda oligonucleotídicas específicas para PCR a tiempo real. Cuando la
sonda se une al ADN molde, los dos extremos, que no se pueden aparear con el ADN molde, se separan y excitan el
notificador, que emite fluorescencia.
La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación
- Sondas FRET son parejas de sondas que hibridan en la zona del amplicon, en regiones adyacentes. Se produce
transferencia de energía al quencher, que se excita y emite fluorescencia
La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación, excitando el notificador y detectando el quencher
23. Aplicaciones de la PCR a tiempo real

PCR cuantitativa a tiempo real o qPCR, permite cuantificar la cantidad inicial de una molécula de ADN en una muestra.

- Cuantificación absoluta: expresan el resultado en unidades de concentración o en número de copias por unidad de
volumen, requieren realizar una curva de calibración con patrones con una concentración o número de copias conocida.
Son muy útiles para cuantificar cargas virales, respuestas a tratamientos, estudios de cuantificación de expresión génica,
etc.
- Cuantificación relativa: Consiste en expresar la concentración de la secuencia diana en relación con la concentración de
un gen de referencia que está presente en todas las muestras con nº constante de copias.
Son útiles para evitar posibles causas de error o de imprecisión

Curva de fusión y detección de mutaciones

La curva de fusión es la gráfica que se obtiene representando la fluorescencia frente a la temperatura

Tres tipos de curva de picos de fusión son posibles:

- Curva con un único punto de fusión a la temperatura correspondiente al punto de fusión de la sonda. Indica que el ADN
molde no presenta mutaciones
- Curva con un único pico de fusión a una temperatura menor al punto de fusión de la sonda. Indica la presencia de una
mutación en homocigosis
- Curva con dos picos de fusión, uno a la temperatura del punto de fusión de la sonda y el otro a una temperatura menor.
Indica una mutación en heterocigosis