LABORATORIO BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR : ANÁLISIS MOLECULAR POR PCR

APRENDIZAJES A LOGRAR

 Identificar las etapas del procedimiento experimental de una PCR.

 Realizar una amplificación por PCR.

INTRODUCCIÓN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite amplificar secuencias específicas de ácidos
nucleicos mediante su síntesis in vitro, a partir de un segmento de ADN templado (ADN cromosomal, plasmidial o cADN).
Esta es una reacción enzimática, llevada a cabo por la Taq ADN polimerasa, lo cual permite obtener de miles a millones de
copias a partir de al menos una copia de la secuencia blanco.

La Taq ADN polimerasa es una enzima termoestable, es decir, enzimáticamente activa a temperaturas relativamente altas
(al menos 75°C y estable con frecuencia hasta 95°C). Esta característica permite su actuación en sucesivos cambios de
temperatura sin inactivarse, además su capacidad de replicación a temperaturas elevadas impide la formación de híbridos
parcialmente desapareados y contribuye a la especificidad y rendimiento del proceso. La enzima más empleada se llama
Taq ADN polimerasa por proceder de la bacteria Thermus aquaticus, que vive en manantiales de agua caliente.

La técnica de PCR fue diseñada por K. Mullis en base a varios conceptos fundamentales, tales como:

- Todos los seres vivos contienen ADN.

- El ADN de todas las células de un mismo individuo es idéntico.
- Todos los miembros de una misma especie contienen secuencias idénticas de ADN.
- Una cadena de ADN puede reconocer a una que sea complementaria (hibridación).
- El ADN se puede sintetizar y replicar in vitro.
- El ADN es una de las moléculas más estables en el tiempo.

La integración de cada uno de ellos, arrojó una técnica que consta de 3 pasos que se repiten muchas veces, llamados ciclos,
con el fin de obtener múltiples copias de ADN idénticas a la original.

Cada ciclo de amplificación consta de las siguientes etapas en forma sucesiva:

1. Desnaturalización: donde se separan las dos hebras de ADN

templado o molde complementarias por efecto del calor (más de 90°C).

2. Hibridación: donde los partidores (oligonucleótidos de secuencias

complementaria a la del ADN templado) se unen a las hebras
complementarias, uno al extremo 5’ y el otro al 3’. Delimitando la
secuencia de ADN que va a ser amplificada. La especificidad de la PCR es
dependiente de la temperatura de hibridación (40°C – 68°C) y de la
secuencia de los partidores, lo que determina el valor de Tm (temperatura
media de fusión). Por ello, el diseño de los partidores es clave para el éxito
de la PCR.

3. Extensión: donde la Taq ADN polimerasa cataliza (72°C) la

síntesis de nuevas hebras de ADN a partir de los partidores y del ADN templado. Como el ADN sintetizado en cada
ciclo sirve de molde para el siguiente, la síntesis de ADN se duplica en cada ciclo, produciendo la amplificación de
este. Los productos de cada ciclo se van doblando, generando un “aumento exponencial” en el número total de
copias sintetizadas.
 La PCR se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador, el que está compuesto de bloques calentadores
programables que permiten varias la temperatura en forma rápida (1 – 2 °C/seg), precisa y altamente reproducible.

La detección de los productos de amplificación resultantes se puede realizar por electroforesis en geles de agarosa o
poliacrilamida teñidos con BrEt (bromuro de etidio), RedGel o SyberGeen; o hibridación de sondas específicas en
pocillos de microplaca y lectura espectrofotométrica, lo cual puede llegar a 100 a 1000 veces más sensibles que la
detección en gel.

Su extraordinaria sensibilidad y sencillez, la han convertido en una técnica muy poderosa y de múltiples aplicaciones.
En investigación es una técnica básica de biología molecular, que es utilizada para obtener grandes cantidades de ADN
y cADN (RT – PCR) para su clonamiento, la generación de sondas para hibridación en experimentos Southern blot o
Northern blot, secuenciación del ADN o mutagénesis dirigida. En la clínica, para análisis genético, análisis forense o
diagnóstico in vitro de organismos no cultivables, entre otros.

PREGUNTA 1
La etapa de desnaturación de la reacción de PCR, permite:

A. Asociar los partidores al ADN molde.

B. Lograr la activación de la Taq ADN polimerasa.
C. Asegurar una correcta hibridación de los partidores con el ADN templado.
D. Evitar la formación de estructuras secundarias cuando la doble hebra se separa.
E. Separar el ADN de las histonas que lo empaquetan.

COMPONENTES DE UNA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Para alcanzar un funcionamiento óptimo del PCR, deben considerarse varios elementos, primero en el diseño general de la
reacción enzimática y luego en la de los parámetros de reacción.

a) Partidores: deben tener al menos 16 nucleótidos, preferiblemente entre 20 y 24. El contenido G + C debe ser entre
40 – 60%. Evitar las secuencias que formen estructura secundaria y extremos 3’ complementarios entre sí, ojalá
terminados en G o en C, e idealmente ambos con Tm (temperatura media de fusión) similar. Independientemente
del diseño, su concentración debe ser optimizada, ya que un exceso puede producir productos inespecíficos,
mientras que su defecto disminuye la eficiencia y rendimiento del PCR. Existen muchos programas
computacionales que, basados en estas y otras consideraciones, facilitan enormemente su diseño.

b) ADN molde o templado: la amplificación del ADN depende de la cantidad y calidad del ADN molde (presencia
de inhibidores o contaminantes). La cantidad necesaria del ADN templado depende del tamaño y complejidad de
este. Por ejemplo, normalmente se requiere de aproximadamente un millón de veces más de ADN genómico con
respecto plasmidial, para tener el mismo número de copias de la secuencia objetivo.

c) Buffer de reacción: este es un buffer clásico 10 X, que contiene Tris – HC1 10 mM pH 7,8 y KCl 500 mM, Tritón
X – 100, que sirve para la mayoría de las aplicaciones.

d) Concentración de magnesio: la concentración de Mg+2 es un elemento esencial en el PCR. Su defecto impide la

actividad enzimática de la Taq ADN polimerasa, mientras que su exceso disminuye la fidelidad y aumenta la
amplificación inespecífica. Por ello, previamente se debe optimizar el resultado del PCR con una serie de reacciones
a distintas concentraciones de Mg+2.
 e) Concentración de la enzima: se recomienda usar 1,25 U de Taq pol en 50 ml de volumen de reacción. El exceso
de enzima puede producir productos incompletos a causa de la actividad exonucleasa 5’ – 3’ de esta, que se observa
como un chorreo en la electroforesis en gel de agarosa.

f) Parámetros de los ciclos: lo más complicado de determinar es la temperatura óptima de hibridación de los
partidores. A mayor temperatura, mayor especificidad de producto, pero se puede afectar al rendimiento. Mientras
que a menor temperatura mejora el rendimiento, pero puede afectarse la especificidad con aparición de productos
de amplificación inespecíficos producidos por la asociación parcial de los partidores en otras regiones del ADN
molde. El punto de partida es la determinación de la Tm en los partidores, que puede hacerse de manera sencilla a
partir de la secuencia nucleotídica, como sigue:

Para partidores hasta 18 nt: 𝑻𝒎 = 𝟒 × (𝑮 + 𝑪) + 𝟐 × (𝑨 + 𝑻).

Una vez estimada la Tm, un buen punto de partida es hibridar a una temperatura de 5°C por debajo de la Tm. La
extensión debe ser de 1 minuto por cada 1000 pb. Por último, debe considerarse el número de ciclos. Generalmente
son suficientes 25 – 35. En cualquier programa de ciclos es conveniente empezar con un paso de desnaturalización
prolongada, para garantizar la apertura del ADN molde y terminar después del último ciclo, con una extensión larga,
para completar todos aquellos productos que hayan quedado incompletos.

PREGUNTA 2
¿Cuál es la función de la Tm en la reacción de PCR?

A. Define la especificidad del producto de PCR obtenido en la reacción.

B. Asegura la temperatura de alineamiento de acuerdo a la longitud de la zona del ADN molde que se amplificará.
C. Determina el tiempo requerido para la etapa de extensión en la PCR.
D. Determina la capacidad de elongación o síntesis mediada por la ADN polimerasa.
E. Establecerá el tipo de ADN polimerasa a utilizar en la PCR.

SECUENCIA EXPERIMENTAL EN PCR

La capacidad de detección de la técnica de PCR es muy alta, tanto que puede permitir la detección de una única molecula
de ADN en casi cualquier tipo de muestra clínica, forense o arqueológica. Sin embargo, esta característica supone también
un elevado riesgo de contaminación moléculas de origen ajeno a la muestra.

Precauciones:

 Si es posible, preparar las reacciones en un lugar aislado físicamente del resto del laboratorio. Mantener en este
lugar los guantes, micropipetas, puntas, tubos, centrífuga y todo lo necesario. Este material debe usarse sólo para
este propósito.
 Usar micropipetas con filtro anti – aerosol.
 Todo el material plástico debe ser nuevo, estéril y libre de nucleasas (ADNasa y ARNasa).
 Manipular todo el material con guantes nuevos.
 Fraccionar los reactivos en pequeñas alícuotas. Guardar a – 20°C.
 Añadir todos los componentes de la reacción y siempre al final el ADN.

VIDEO: TÉCNICA DE PCR

PASO N°1: PREPARACIÓN DE LA MEZCLA DE PCR

Preparación del mix de PCR:

Aquí tenemos los reactivos que componen una mezcla de PCR:

- Buffer de reacción proporcionado al 10 X (MgCl2).

- Desoxinucleótidos trifosfato.
- Magnesio (50 mM MgCl2).
- Taq polimerasa.
- Agua libre de nucleasas.
- Pareja de partidores.

Todos estos reactivos se pipetean limpiamente, utilizando guantes y puntas con filtro anti – aerosol, que se desechan en cada
pipeteo con la finalidad de evitar contaminaciones cruzadas de las soluciones de origen y prevenir la adición de agentes
exógenos a la forma de aerosoles que puedan afectar la amplificación. Todas estas precauciones son necesarias pues el
riesgo de contaminación se ve incrementado debido a la alta sensibilidad de la técnica de PCR.

Distribución en tubos de PCR:

Una vez preparado el mix con todos los reactivos, este se distribuye o alícuota en tubos de PCR. Estos tubos son de paredes
muy delgadas, ya que permiten el traspaso rápido del calor en el termociclador. Los tubos de PCR preparados con el mix
de PCR son debidamente rotulados y se diferencian en el tipo de ADN templado que se les adicionará.

Adición de ADN templado:

En cada reacción de PCR se consideran ADN controles estandarizados para un producto positivo de la amplificación a
estudiar. Una reacción control sin ADN templado, reemplazando su volumen por agua, y las muestras en estudio desde las
cuales, en procedimientos previos de extracción, se ha separado el ADN de otros componentes celulares.

Cada uno de estos ADN templados diferentes debe ser agregado a un tubo independiente.

Spin down:

Una breve centrifugación o spin down permitirá reunir las pequeñas gotas en el fondo del tubo.

Los volúmenes de reacción de un PCR tradicional varían. Generalmente oscilan entre 20 – 50 microlitros.

Reacción en el termociclador:

A continuación, los tubos son depositados en el termociclador. Cada tubo es cuidadosamente agitado para asegurar una
mezcla homogénea y ajustado firmemente en su delgada tapa. Si el tubo queda mal cerrado, el aumento de la temperatura
interna evaporará todo el contenido, impidiendo la correcta amplificación.

El termociclador permite realizar los ciclos de temperaturas ajustando el tiempo de duración de cada calentamiento. Posee
un sistema para la transferencia rápida de calor a la grilla y tapa del termociclador, asegurando que todo el tubo mantenga
una temperatura constante en cada etapa de la reacción.

En un ciclo de PCR observaremos el inicio a una temperatura por sobre los 90°C, etapa denominada desnaturación, que
permite separar las dobles hélices y formar monohebras de ADN. Luego, la temperatura desciende para permitir el
alineamiento o hibridación de los partidores con el ADN templado. Finalmente, se utiliza una temperatura de 72°C para
asegurar un correcto funcionamiento enzimático de la Taq polimerasa en el proceso de extensión. Estas 3 etapas se repiten
varias veces, permitiendo un aumento exponencial de los fragmentos de ADN amplificados a partir de la zona de hibridación
de los partidores.
PASO N°2: Electroforesis de los productos de PCR

Retirar los tubos del termociclador:

Una vez finalizado el proceso de amplificación en el termociclador, los tubos son retirados para el análisis final por
electroforesis en gel.

Desarrollo de la electroforesis:

A continuación, se agrega buffer de carga a cada tubo de PCR. Luego, en una cámara de electroforesis, ya preparada, se
adicionan en pocillos separados el marcador molecular como referente de migración, y las muestras de PCR en análisis,
considerando incluir los controles positivos y negativos de la reacción.

Observación en el transiluminador:

Una vez concluida la electroforesis, el gel resultante, previamente preparado con RedGel, es trasladado al transiluminador
para la observación de los fragmentos de ADN por emisión de fluorescencia.

PREGUNTA 3
¿Cuál de los siguientes componentes no es parte del mix de PCR?

A. Partidores.
B. Taq ADN polimerasa.
C. Buffer TAE.
D. dNTPs.
E. MgCl2.