Enzimas de restricción

Sistemas de restricción: Permite a las bacterias monitorear el ADN entrante y destruirlo.

ADN bacteriano: Se protege de las endonucleasas propias metilando ciertas bases en un numero
muy limitado de sitios (los virus no). Pude ser dañado por virus, agentes químicos y factores
ambientales. Puede ser intercambiado entre bacterias.

Endonucleasas: Monitorean el ADN entrante mediante el reconocimiento de secuencias

especificas y cortando el AND en fragmentos.

Tipo 1: una enzima con subunidades que reconocen, se anclan y metilan, reconocen una secuencia
simple, y hasta 1000 bases después se anclan.

Tipo II: Dos diferentes enzimas va a reconocer una secuencia simétrica, se anclan, cortan o pueden
modificar. (las más fáciles de usar, uso en la manipulación genética, V cortan en sitio especifico no
requiere cofactores)

Tipo III: Una enzima con dos subunidades, una para reconocimiento y otra para romper. Reconoce,
metila y corta, hasta 24-26 bases después.

Tipo IV: Dos diferentes enzimas van a reconocer una secuencia asimétrica, se anclan cortan o
modifican después de 20 bases.

Nomenclatura

Nombre del organismo huésped :SmaI Serratia marcescens, primera enzima (CCCGGG)

Primera letra: Nombre del género y las dos letras del epiteto especifico. Cuando una cepa del
huésped en particular tiene varios sistemas R-M se identifica con romanos.

Sitios de reconocimiento

Palindromos: Secuencias particulares de 4-18 nucléotidos que tienen un doble eje de simetria
rotacional.

Algunas enzimas de restriccion pueden cortar

en ambas cadenas en los extremos romos y
otras en zigzag.

Calidad de las enzimas de restricción

Las enzimas con alta puresa estan libres de otras endonucleasas, exonucleasas y fosfatasas.
Digestion: Se agrega una enzima de restriccion paa que corte.
Ligación de las moléculasde ADN

 Utilizar la capacidaddel ADN ligasa para unir cobvalentemente los extremos, se pegan por
los puentes de hidrogeno y se unen por complementariedad.
 Utilizar fago T4 para catalizar l formación del enlace fosfodiester en los extremos romos.
 Utilizar la enx¡zima terminal desoxinucleotidiltransferasa para sintetisi de colas
monocatenarias.

Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Da como resultado la amplificación selectiva de una region elegida de una molécula de ADN.
Puede elegirse cualquier region de ADN siempre y cuando se conozcan las secuencias de los
bordes de la region.

Primer o cebador

Al abrir la cadena, dos dos oligonucleotidos se tienen que hibridar, en cada hebra de la cadena,
van aa ctuar como cebadores para la reacciones de sintesis de ADN, ademas de que limitan la
region que se amplificara.

Taq polimersa

Ampliacion por la enzima ADN polimerasa I de Thermus aquaticus.

Ciclo de una PCR

Protocolos de Pcr:

Inician con un tiempo de desnaturalización de 5 min a 94 C.

Programan 30 ciclos, al final, se programa elongacion de 5min y se deha la

reacion a 4 C

30s de desnaturalizacion (94 C)

30s de alineación(55 C)

90s de elongacion(72 C)

Programación de la PCR

Temperatura de alineamiento
Tiempo de elongación

Tprome 0.5-1min se utiliza la Taq polimerasa factor de multiplicación 1.6 o 1.7

Buffer estandar utilizado por biologos moleculas Tris HCL (pH de Taq polimerasa superior a 8)

Sales

El rendimiento de PCR aumenta con el uso de KCL 10 y 50mM, y cae a concentraciones de más de
50Mm, el NaCl inhibe la apmlificacion.

Mg influye en:

 Alineacion del cebador.

 Separación de las cadenas durante la desnaturalización.
 Especificidad del producto.
 Fomación de diamero en el cebador.

Concentraciones

0.5 2.5mM de Mg

200microM de nucleotidos

10 pmol de cebadores

50microL de Taq polimerasa

Plasmidos y Vectores

Plasmidos: Son replicones que se heredan de forma estable en un estado extracromosomico.

Existen como moleculas de ADN circular de doble cadena. Tamao (1x10 6 Da a más de 200x10 6 )

ADN de CCC: si ambas cadenas de ADN estan en circulos intactos.

Plásmidos cripticos: Son aquellos a los que no se les ha atribuido resgos fenotipicos.

Fenotipos de los plasmidos

Plasmidos F: Solo tienen genes tra, capacidad de promover la transferencia conyugal de los
plasmidos.

Plasmidos R (de resistencia): Llevan genes que confieren la bacteria huesped, la resistencia a uno
o más agentes antibacterianos como cloranfenicol, amicilia y mercurio.

Col plasmidos: Codifican para colicinas(proteinas que matan a otras bacterias)

Plasmidos degradantes: Permiten que la baacteria huesped dergada compuestos inusualescomo

tolueno.

Plasmidos de virulencia: Confieren patogenecidad a la bacteria huesped. (Plasmidos Ti de

Agrobacterium tumefaciens, que induce la enferemdadde la vesicula biliar)
Clasificacion de los plásmidos

Dependiendo si llevan o no un conjunto de genes tra que promueven la conjugación bacteriana

 Conjugativos
 No conjugativos

Clasificarse sobre la base

 Plásmidos relajados: maantiene como copias multiples por célula.

 Plásmidos estrictos: numero limitado de copias por célula.

Rango de hospederos

Esta determinado por su region ori, cuya regio ori derive del plasmido Col E1, tienen un rango de
hospedadores restringido: olo se replkican en bacterias entéricas Ecoli Salmonella.

Plasmidos promiscuos: tienen un amplio rango de hospederos; incluyen RP4 Y RSF1010.

• NHR (rango estrecho de hospederos).

• BHR (Amplio rango de hospederos): cuando es capaz de replicarse en más de 2 especies de

la misma sublinea.

• VBHR (Muy amplio rango de hospederos): cuando también es capaz de replicarse en

bacterias clasificadas en un phylum diferente.

Numero de copias de un plasmido

Se determina regulando el inicio de la replicación del plasmido, dos mecanim¡smos de control de

la inicioación:

 Regulación de ARN antisentido

 Regulación por union de proteinas esenciales a iterones

Estabilidad de los plásmidos

PAR: funcion de particion que mantiene estables a los plasmidos, en cada division celular.
Inestabilidad debida a la formación de multiméricas, el mecánismo que controla el nímero de
copias de un plasmido asegura un número fijo de origenes de plásmidos por bacteria.

Ciclo de vida de un bacteriofago

1. Incerision de virus a la celula

2. Degradacion del genoma huesped
3. Replicacion del genoma viral y sintesis de proteinas virales
4. Montaje y liberacion
5. Muerte de l celula hospedera y nuevos virus

Transformacion bacteriana
Vectores de clonación

Molecula de ADN que transporta ADN extraño en una celula huesped se replica dentro de una
célula bacteriana (o levadura) y produce muchas copias de sí mismo y del ADN extraño.

• Una alta eficiencia de transformación.

• Marcadores seleccionables convenientes para transformantes y recombinantes

• Capacidad de clonar fragmentos de ADN razonablemente grandes (hasta

aproximadamente 8 kb).

Caracteristicas de un vector

 pequeños como para que se puedan separar fácilmente del DNA cromosómico
 Deben de tener un ori.
 Sitio de clonacion multiple MCS: fragmento de DNA con secuencias de reconocimiento
para muchas enzimas de restricción.
 Genes marcadores que se puedan seleccionar: permiten la selección e identificación de
bacterias transformadas mediante un plásmido recombinante en comparación con las
células no transformadas.
 Secuencias de promotor de RNA polimerasa(transcripcion de RNA POL)
 Secuencias de cebadores para la secuenciacion de DNA
No. Vector Usos importantes Tamaño máximo del Ejemplos
inserto en kb

1. Plásmido Manipulación general del ADN. 10-20 PBR322, PUC18

2. λ (Inserción) Construcción de librerías de cADN. ~10 λ gt11

3. λ (Remplazo) Construcción de librerías genómicas. ~23 λZAP, EMBL4

4. Cósmido Construcción de librerías genómicas. ~44 PJB8

5. Fagemido Manipulación general del ADN, 10-20 PBluescript

mutagénesis In vitro.

6. M13 Secuenciación de ADN, mutagénesis In 8-9 M13, mp18

vitro.

7. BAC Construcción de librerías genómicas. 130-150 PBAC108L

8. YAC Construcción de librerías genómicas. 1000-2000 PYAC4

9. PAC Construcción de librerías genómicas. 75-90 PAd10SacBII

Cósmidos

Moléculas de ADN circular extra-cromosómico que combinan características de plásmidos y fagos.

Son híbridos entre plásmidos y el fago λ. Poseen la habilidad del plásmido para replicarse
autónomamente en las células y los genes de resistencia a los antibióticos de su plásmido
parental. Contienen los sitios cos del fago λ para empaquetamiento in vitro

BAC`s

Contienen el origen de replicación de un plásmido natural factor F, un sitio de clonación múltiple,

un marcador seleccionable. Pueden ser manipulados como plásmidos bacterianos normales.

Plásmido Ti

• plásmido de alto peso molecular.

• tamaño medio de algo más de 200 Kb.

• contiene la información de 196 genes, de los cuales 195 son traducidos a proteínas, tan
solo el 19% de su contenido no codifica proteínas.