PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE

FACULTAD DE AGRONOMÍA E INGENIERÍA FORESTAL

Curso Conservación y Biodiversidad (AGR339)

GUÍA LABORATORIO 1

PCR Y ELECTROFORESIS EN GEL

1. INTRODUCCIÓN

La reacción en cadena de la polimesara (PCR, por su sigla en inglés) es una técnica de gran utilidad en
biología molecular. En forma simple, la técnica consiste en obtener múltiples copias de una zona del
genoma, a través de síntesis secuenciales de nuevas hebras de DNA de dicha región, por la acción de una
polimerasa termoestable. Esto se logra a través de ciclos sucesivos de amplificación, cada uno de ellos
consistentes en tres pasos:

 Paso 1 – Denaturación. Separación de la hebra doble de DNA por efecto de la temperatura (90-
94°C), de tal manera de exponer la zona del genoma a amplificar, a los partidores
(oligonucleótidos de hebra simple (DNA), complementarios a los extremos de la región a
amplificar), que van a dar origen a las nuevas hebras de DNA.
 Paso 2 – Alineación. Unión de los partidores a los extremos de la región del DNA que se va a
amplificar. Eso se logra bajando la temperatura de incubación de la reacción (37-60°C).
 Paso 3 – Elongación o extensión. Síntesis de las nuevas hebras de DNA de la región a
amplificar, a partir de los partidores (68-72°C), por efecto de la DNA polimerasa termoestable,
que va a ser capaz de soportar las altas temperaturas de los ciclos de amplificación.

Cada ciclo de amplificación lleva a duplicar la cantidad de DNA inicial. Por lo tanto, luego de 20 ciclos
de amplificación se pueden llegar a tener 1,0 x 10 6 copias del DNA inicial. Esto hace que esta técnica
tenga una gran sensibilidad analítica (capacidad de detectar la menor cantidad de DNA), dada por el
número de ciclos de amplificación utilizados y una gran especificidad (dada por la especificidad de los
partidores utilizados). Esta técnica utiliza como templado solo DNA, por lo tanto para amplificar RNA es
necesario llevarlo previamente a DNA por medio de la enzima transcriptasa reversa o transcriptasa
inversa.

La reacción de PCR se compone de una secuencia de DNA templado, un par de partidores, 4

desoxinucleótidos trifosfatos (A, T, C y G), una DNA polimerasa termoestable, MgCl 2 y el buffer
correspondiente que mantiene la integridad de los componentes de la reacción.

El DNA templado es el que contiene la secuencia blanco, la cual puede ser de decenas o hasta miles de
pares de bases de longitud. La DNA polimerasa, cataliza la reacción en la cual existen un par de
secuencias cortas de entre 15 y 25 pares de bases nucleotídicas que actúan como partidores y que se
encuentran en abundante cantidad en el tubo de reacción y cuatro desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs)
que se utilizan para hacer millones de copias de la secuencia blanco. El buffer utilizado contiene KCl y
Tris. El MgCl2 es un componente muy influyente, ya que funciona como cofactor para que la Taq
Polimerasa actúe. Este enzima necesita de los iones Mg 2+ libres en la reacción para su actividad,
rendimiento y especificidad.

Para realizar una PCR de cualquier organismo es necesario primero extraer el DNA contenido en las
células.

Para la detección de una reacción de amplificación positiva, el método más utilizado es el uso de la
electroforesis en gel. La electroforesis es una técnica muy utilizada para separar las moléculas o
fragmentos de ácidos nucleicos, siendo los materiales más comunes la poliacrilamida o agarosa. El más
frecuentemente usado es el gel de agarosa. Así, una vez terminada la PCR, la muestra se someterá a una
electroforesis, de tal manera de separar el DNA presente por tamaño. Una reacción de amplificación
positiva se visualizará por la detección de un fragmento de DNA de tamaño específico, determinado por
la distancia que hay entre los dos partidores utilizados. Esto se visualizará por tinción directa del gel,
generalmente con Bromuro de Etidio, sin embargo este posee efectos mutagénicos. Recientemente se han
descubierto otros compuestos capaces de sustituir el Bromuro de Etidio, como el Sybr safe o Red gel, los
cuales no presentan estos efectos.

Para realizar el gel de agarosa se coloca en un matraz una cantidad determinada de agarosa, la cual se
disuelve con el mismo buffer con el que se va a realizar la corrida. Esto se calienta hasta la ebullición.
Luego se debe verter en un soporte electroforético, al cual se le pone un peine del mismo material, para
formar los pocillos donde se cargarán las muestras.

Una vez solidificado el gel, este se introduce en la cámara electroforética, donde se añade una solución
amortiguadora. Para cargar las muestras se necesita un buffer de carga, que aumenta la densidad de estas
haciendo que caigan en forma uniforme en el pocillo y no se salgan del mismo. También sirve para darle
color y poder observar el éxito de la carga, así como la migración correcta (esto último se debe
principalmente al tamaño del gel, ya que la migración se debe realizar hacia el lado más largo del mismo,
de forma de no perder las muestras).

Para poder conocer el largo de los fragmentos de DNA que migran durante la electroforesis, se carga en el
gel junto con las muestras e interés, un estándar de tamaño molecular (también llamado ladder), el cual
contiene distintos fragmentos de DNA de tamaño previamente conocido, y según la distancia a la que
migran podemos estimar la longitud del fragmento de las muestras.

2. ACTIVIDADES PRÁCTICAS

Se obtuvieron muestras de sangre de pingüinos barbijo (Pygoscelis antarcticus), y se extrajo su DNA.

Esta especie no presenta dimorfismo sexual, por lo que la única manera de determinar su sexo es
mediante técnicas moleculares.

 Realización de PCR

a. Se utilizarán las siguientes condiciones, para realizar el premix de PCR:

 390,78 l ddH2O
 52,0 l Buffer 1X
 15,6 l MgCl2 (1.4 mM)
 20,8 l dNTPs (200 M)
 26,0 l partidor (0.5 M) → 20,25 l de cada partidor (forward y reverse).
 1,82 l Taq Polimerasa (0.4 U).

OJO: Se debe mezclar bien

b. Luego pondrá en cada tubo de 0.2 ml:

 2 l de DNA (en cada tubo debe poner una muestra diferente).

 38 l de premix.

c. Se deben poner los tubos en el termociclador y correr el programa “Touchdown 1”.

d. Una vez terminada la PCR, se realizará una electroforesis en gel de agarosa para determinar cuáles
pingüinos son machos y cuáles son hembras. El gel de electroforesis se preparará de la siguiente manera:

 Montar el sistema para preparar geles de agarosa, incluyendo la peineta que permite la formación
de los pocillos.
 Agregar 4 g de agarosa a un matraz (gel al 2%).
 Aforar con buffer SB 1X (hidróxido de sodio, ácido bórico) en el matraz hasta 200 ml.
 Calentar el matraz con la agarosa y el buffer en horno microondas, hasta la disolución de la
agarosa (3 min aprox.). Ir agitando UTILIZANDO GUANTES para la correcta disolución.
  Enfriar el matraz por fuera, con agua de la llave.
 Verter en el sistema de preparación de geles, y esperar a que gelifique.
 Llevar el gel a la cámara de electroforesis y cubrir con buffer SB 1X. El gel debe quedar cubierto
con dicho buffer.

e. Finalmente, cargar las muestras en el gel:

 Primero cargar el primer pocillo con 10 l de ladder 100 bp.

 En cada uno de los siguientes pocillos, cargar 2 l de buffer de carga 6X + 5 l de la reacción de
PCR de cada muestra (1 muestra por pocillo).
 Correr el gel a 200V por 30 minutos. Finalizados los 30 minutos, desmontar el sistema de
electroforesis, retirar cuidadosamente el gel y llevarlo al transiluminador para su observación.