Análisis de

secuencias por
electroforesis
capilar

DATE \@ "d MMMM" \* MERGEFORMAT 11

abril

Creado por:
Francisco Jesús Rodríguez-Córdoba Lucena

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Caracterización de genes de un
organismo modelo

Nuestra misión:

Clonar digitalmente el gen UmamiT2 de Pinus pinaster en un vector de clonación. Para

ello, iremos paso a paso navegando en diferentes bases de datos para cumplir nuestro
cometido.

Nota: Los genes UMAMIT codifican transportadores de aminoácidos bidireccionales y

se encuentran localizados en la membrana de diferentes compartimentos,
especialmente en la vacuola. El tamaño de la zona codificante de los miembros de la
familia UMAMIT está comprendido entre 1000-1200 pares de bases (pb).

1. Para identificar la zona codificante de tu gen, necesitarás buscar en BLAST una

secuencia idéntica (100% de identidad) que comprenda toda la región codificante
del gen (entre 1000 y 1200 pb). La única información de partida que tenemos de
nuestro gen es que es una secuencia incompleta que está a continuación:
>migenfavorito GGAACTGTGGTGGTTAGGGATCTAAGTCATTCGACTAGCATTAGTGACTTATTAATACACCCATTATTTTTTAATGATAATTT
TTTTTTAAATACTCTAATTTTTATGATTGGAAATTTTAGAAGGCTTTCTAAATCTGAATTCAATTATTGAAATTAAATTAAAT
TCAACTATTAAACAAAGTTAGTGTAAATCAGATTTTTTAAATGTTCCAAAATACAATCAGAGCTATAATAATTTCTAATTTTT
TAACCATTGCTGAAATTGAAAGGGTGATTAACAGTTGTCACAAATAGCATGATTTAATGTGCTAATTAGTTGCACTGATCCAC
TTAATACAGTGTGCTGGGAGGAGTTATGATCGCAGTCGGGCTATACGCTGTTCTGTGGGGAAAATTGAAGG

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Una vez obtengas los resultados, analiza cuál de las secuencias resultantes es la más
conveniente para clonar “tu gen favorito”.

Responde aquí: el número de identificación de tu clon (escoge uno de ellos) y

argumenta brevemente porque lo has escogido:

GJFX01159203.1

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2. Para analizar la zona codificante de tu gen, deberás traducir la secuencia del
transcrito a proteína y ver que está completa. Para eso deberás traducir la
secuencia nucleotídica y convertirla en una secuencia de aminoácidos, en una
aplicación destinada para eso, como:

Para identificar la región codificante, copia y pega la secuencia de nucleótidos que

codifiquen la secuencia, y en tu archivo de texto donde has guardado previamente
el clon elegido, busca la secuencia.

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 Responde aquí:
• ¿Cuál es el tamaño de tu gen?
1802

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 • Guarda la secuencia codificante (CDS: coding sequence for protein), nómbralo:
En formato fasta: >PpUmamiT2-CDS ATG…TAG
>PpUmamiT2-CDS
ATGGGGACGTTAATTCAGAAATCAACCCCCTATGTAGCGATGATATCCCTGCAGTTTGGATACGCAGG
CATGAATATTATCAGTAAAGTGTCTCTTAACAGAGGGATGAGTCACTTTGTGCTTGTTGTGTACAGGCAG
GCCGTTGCTACAGTTGTGCTCGCTCCTTTTGCCTTCTTCCTTGAAAGGAAGATGCGACCCAAACTCACAT
TTTCCATCTTCTGTCAAATTTTTGTACTGGGCTTGTTGGGGCCTGTAATAGACCAGAATTTTTCTTACCT
GGGTTTGAAATTAACTTCTCCAACATATGCGTGTGCACTGAGTAATGTACTCCCCTGTATTACTTTCGTG
ATTGCTCTCCTCTTGAGGATGGAGAGAGTGAATATAAAGAAACTACGCAGTGGAGCAAAGTTGGTGGGAA
CGATCGTGTGCGTAGGGGGAGCAATGTTGATGACGTTATACAAAGGTCCTATTGTTCGCATGTTTTGGTC
TCCCCATCATCAATCCTCCAAGCAAAACCAGACATCTGCAGGAACTGCCGCTGGTAGTAAAGACTGGATG
ATTGGCTCCGTTTTGATGGTTGGCGCAACTTTTGCCTGGTCGATCTTGTTTATCTTACAGTCTGCAGTAC
TCAAAAAATATCCTGCTCAACTTTCACTTGCTACCTTAATATGTTTGCTAGGGACGTTACAGGCAACGAC
TCTAAGCATAGCTCTCGTACGTGATCCTTCCAAGTGGGCATTAGGGTGGGACATCAATCTTTTGACTGCA
GTCTACTCTGGAGTGGTAGCCTCAGCCGTCGCATATTATGTGCAAGGTCTGTGCATGCGCGTAAAAGGTC
CTGTGTTTGCCACAGCATTCAGTCCGTTGGTGATGATAATCGTGGCAGTCATGGGATCTGTTATTCTCTC
TGAAAATATTTATTTGGGCAGTGTGCTGGGAGGAGTTATGATCGCAGTCGGGCTATACGCTGTTCTGTGG
GGAAAATTGAGGGACAGCAAGACCTCGACAGATGAAAATCATTCGGAAGCGCTTCCCAGTTCTGAAGAAA
TACTCCCACAAAATGAGAAAAGGGCAGATGACATTGAAGCTGCGTCGAACGAGGCCATGGATAAGGGGCA
TGAGCCTTCTGAATCAGATGGAATGAAACAACTTTCGGTGAAGTAG

• Guarda la secuencia de aminoácidos.

>PpUmamiT2-proteina
MGTLIQKSTPYVAMISLQFGYAGMNIISKVSLNRGMSHFVLVVYRQAVATVVLAPFAFF
LERKMRPKLTFSIFCQIFVLGLLGPVIDQNFSYLGLKLTSPTYACALSNVLPCITF
VIALLLRMERVNIKKLRSGAKLVGTIVCVGGAMLMTLYKGPIVRMFWSPHHQSSKQ
NQTSAGTAAGSKDWMIGSVLMVGATFAWSILFILQSAVLKKYPAQLSLATLICLL
GTLQATTLSIALVRDPSKWALGWDINLLTAVYSGVVASAVAYYVQGLCMRVKGPVF
ATAFSPLVMIIVAVMGSVILSENIYLGSVLGGVMIAVGLYAVLWGKLRDSKTSTDENHS
EALPSSEEILPQNEKRADDIEAASNEAMDKGHEPSESDGMKQLSVK-

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3. Para clonar la zona codificante de tu gen, necesitaras conocer donde se expresa el
transcrito con mayor abundancia y diseñar los oligonucleótidos respectivos
mediante la técnica de PCR.

¿Cuál es el órgano/tejido que utilizarías para llevar a cabo la PCR? Razona brevemente
tu respuesta
La corteza de la raiz

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4. Para clonar la zona codificante de tu gen, solo falta diseñar los oligonucleótidos.
Selecciona 18-25 nucleótidos que flanqueen la zona codificante.

>PpUmamiT-F
ATGGGGACGTTAATTCA
>PpUmamiT-R
CTACTTCACCGAAAGTTG

5. Para confirmar que la zona codificante de tu gen se ha clonado en el vector de

clonación, añade en tu área de trabajo de “Benchling” el vector vacío que tienes
en la carpeta de la práctica llamada “secuencias”. En el icono “+” pincha en “DNA
sequence”-> “Import sequence” y en -> “Drag and drop files to upload” arrastra y
suelta el archivo: pJET1.2.dna y selecciona “Open sequence”.

6. Para generar un mapa del vector de clonación con tu gen, se tendrá que llevar a
cabo un mapa de referencia. Para eso, y con la secuencia del vector vacío, se
deberá hacer una clonación “digital” simulando lo que ha ocurrido en el
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 laboratorio. Deberás introducir la secuencia de la zona codificante o CDS en el
área de digestión EcoRV ubicada en el MCS (multiple cloning site) del vector

8. Recuerda que los transportadores UmamiTs, son proteínas de transmembrana que

están compartimentalizados, especialmente en la vacuola. Podrías confirmar si el gen
“PpUmamiT2” contiene una secuencia nucleotidica que traduzca la proteína con una
señal peptídica de tránsito a la vacuola. Para esto, visita la página:

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9. Antes de confirmar por alineamiento que las “colonias” son positivas, existe otra
forma de confirmar que los clones son positivos, esta forma es, analizando por
digestión que el vector tenga la secuencia de interés. Así que mira dentro de tu gen
“PpUmamiT2” que enzimas cortan. La estrategia seria, que la enzima candidata corte
un sitio en el gen y un sitio en el vector. Así, si el vector esta vacío, cortaría solo una
vez, pero si tiene tu gen, cortaría en 2 sitios.

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 Responde aquí: ¿Que enzima es la candidata perfecta para hacer este análisis?
AdeI

10. Para confirmar que la zona codificante de tu gen se ha clonado en el vector de

clonación, El DNA plasmídico de las 5 colonias seleccionadas, se mandaron a
secuenciar por el método de Sanger por electroforesis capilar. En la carpeta de
prácticas llamada “secuencias”, encontrarás los resultados de las secuenciaciones.

11. Observa el alineamiento cuidadosamente y enumera, que secuencias

corresponden al clon PpUmamiT2, según tu secuencia de referencia, y cuales no
corresponden. Elimina las secuencias que varíen mayoritariamente con la secuencia
de referencia, estas se podrán eliminar seleccionando la “X” ubicada en la parte
superior izquierda donde aparece el nombre de la secuencia, una vez pinches en la
“X” aparecerá un cuadro de dialogo confirmando que quieres eliminarlo.

La 2ª secuencia la hemos eliminado ya que no la tendremos en cuenta para nuestro

estudio.

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 De acuerdo con el cromatograma, en el alineamiento:
• ¿Que fluoroforo corresponde con Adenina, Timina, Citosina y Guanina?
La adenina se corresponde con el fluoruro verde.
La timina se corresponde con el fluoruro rojo.
La citosina se corresponde con el fluoruro azul.
La guanina se corresponde con el fluoruro amarillo.

• Al inicio y/o al final de algunas lecturas de secuenciación está el carácter ‘N’, ¿qué
significa?
Eso significa que la máquina no puede determinar el nucleótido exacto
• Identifique que lecturas son “forward” y cuales son “reverse”.
PLM00279842+1+F es reverse , las demás forward
• ¿En la posición 624, cual es el nucleótido por consenso que sería considerado en
esta posición? Nota: Para encontrar las diferencias en el alineamiento, se puede
navegar usando “find mismatches” usando los cursores
La guanina
• El inicio y el final de la secuenciación las lecturas son de peor calidad. ¿Porque crees
que esto sucede?
La calidad de las lecturas en el inicio y el final de una secuenciación puede ser peor
debido a varios factores, como la amplificación no específica, la calidad de la muestra y
los reactivos y equipos utilizados. Es importante tener en cuenta que la secuenciación
de ADN es un proceso complejo que depende de muchos factores, y se deben realizar
controles de calidad rigurosos para garantizar resultados precisos y confiables.

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