Resumen de purificación de PETase

Art.1

Clonación. La PETasa de Ideonella sakaiensis (número de acceso de GenBank: GAP38373.1) sin los
29 aminoácidos N-terminales se sintetizó químicamente (GENE ray Biotech Co., Shanghai, China),
se ligó en el vector pET32a y se expresó en Escherichia coli.

Mutagénesis dirigida al sitio. Las variantes se construyeron usando un kit de mutagénesis dirigida
al sitio QuickChange (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) con el plásmido PETasa de tipo
salvaje como plantilla. Se construyó R103G / S131A (DM) utilizando S131A como plantilla. Las
secuencias de los oligonucleótidos de mutagénesis se enumeran en la Tabla complementaria 1.
Los productos de PCR se incubaron con DpnI (New England Biolabs, Hitchin, Reino Unido) para
digerir el molde de ADN original y luego se transformaron por separado en la cepa XL1-Blue de E.
coli. Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación.

Purificación de proteínas. El plásmido pET32a-PETasa, ya sea de tipo salvaje o variantes, se

transformó en células de E. coli BL21trxB (DE3) que se cultivaron en medio LB a 37 ° C hasta una
DO600 de ~ 0,8 y luego se indujeron con isopropil β-D 0,6 mM. tiogalactopiranósido (IPTG) a 16 ° C
durante 24 h. Las células se recogieron mediante centrifugación a 5000 xg durante 15 min y luego
se resuspendieron en un tampón de lisis que contenía TrisHCl 25 mM, NaCl 150 mM e imidazol 20
mM (pH 7,5), seguido de rotura con una prensa francesa. Los restos celulares se eliminaron
mediante centrifugación a 17.000 xg durante 1 h. A continuación, se aplicó el sobrenadante a una
columna de Ni-NTA con sistema FPLC (GE Healthcare). La proteína diana se eluyó a ~ 70 mM de
imidazol cuando se usó un gradiente de imidazol de 20 a 250 mM. Las fracciones que contenían la
proteína diana se combinaron y dializaron frente a un tampón que contenía Tris-HCl 25 mM y NaCl
150 mM (pH 7,5) y se sometieron a digestión con proteasa TEV durante la noche para eliminar la
etiqueta de His. Luego, la mezcla se pasó a través de otra columna de Ni-NTA. los

La proteína sin marcar se eluyó con el tampón libre de imidazol. La pureza de cada proteína (>
95%) se comprobó mediante análisis SDS-PAGE. Las proteínas purificadas se concentraron cada
una a 30 mg mL-1 para el cribado de cristalización.
Art.2

Expresión de proteínas y purificación de PETasa

El gen de codones optimizados para la PETasa de la cepa 201-F6 de I.sakaiensis sin péptido señal
(Genscript, Piscataway, NJ), identificado mediante SignalP (DTU Bioinformatics, Kongens Lyngby,
Dinamarca) (38), se sintetizó y se clonó en un pET24b vector (EMD Biosciences, Madison, WI) y
transformado en Escherichia coli BL21-Gold (DE3) (Agilent Technologies, La Jolla, CA). Las bacterias
se cultivaron en Terrific Broth (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y se indujo la expresión de
proteínas durante 18 ha 25 ° C usando tiogalactopiranósido de isopropil b-D-1 1,0 mM después de
alcanzar una densidad óptica a 600 nm de 0,7. Las células se recogieron por centrifugación, luego
se lisaron mediante sonicación en tampón desnaturalizante que contenía clorhidrato de guanidina
6 M y fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5). Los lisados aclarados que contenían PETasa marcada con
His se cargaron en Ni-Sepharose (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA), se lavaron dos veces
con tampón de lisis y luego se eluyeron usando imidazol 350 mM. La proteína se replegó mediante
diálisis durante la noche a 4ºC frente a tampón que contenía L-arginina 400 mM, hosfato de sodio
50 mM (pH 7,5) y NaCl 150 mM. La proteína replegada se purificó adicionalmente mediante
cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex75 (GE Healthcare) en tampón
que contenía fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5) y NaCl 90 mM. Las fracciones correspondientes a un
pico monodisperso se ensayaron y se inspeccionaron visualmente mediante SDS-PAGE (Fig. S1).

Art. 3

El gen Is PETasa se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un

gen sintetizado con optimización de codones para la expresión en células de Escherichia coli como
molde (Tabla complementaria 2 ). La secuencia de nucleótidos correspondiente al péptido señal
se eliminó del ADN sintético. A continuación, el producto de PCR se subclonó en pET15b, y el
vector de expresión pET15a: IsPETasa resultante se transformó en la cepa de E. coli Rosetta gami-
B, que se cultivó en 11 l de medio de caldo de lisogenia que contenía ampicilina a 37ºC. Después
de la inducción mediante la adición de 1 mM de isopropil β- D-1-tiogalactopiranósido, el cultivo se
incubó adicionalmente durante 16 horas a 18 ° C. A continuación, las células se recolectaron
mediante centrifugación a 4000  xg durante 10 min a 20 ° C. El sedimento celular se resuspendió
en tampón A (Na _ { 2} HPO _ { 4} - HCl 50 mM , pH 7,0 y NaCl 100 mM) y luego se rompió
mediante ultrasonidos. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 13.500 × 
gdurante 20 min, y el sobrenadante se aplicó a una columna de agarosa Ni-NTA (Qiagen). Después
de lavar con tampón A que contenía imidazol 30 mM, las proteínas unidas se eluyeron con
imidazol 300 mM en tampón A. Finalmente, se eliminaron trazas de contaminantes mediante
cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna de grado de preparación Superdex
200 (320 ml, GE Healthcare ) equilibrado con tampón A. Todos los pasos de purificación se
realizaron a 4 ° C. El grado de pureza de la proteína se confirmó mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. La proteína purificada se concentró a 28 mg ml -1 en 50
mM de Na 2 HPO 4-HCl, pH 7,0 y NaCl 100 mM. Los experimentos de mutagénesis dirigida al sitio
se realizaron utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick Change (Stratagene). La
expresión y purificación de variantes de Is PETasa y Tf Cut2 se realizaron en las mismas
condiciones que las utilizadas para la proteína nativa de Is PETasa. Para asegurarse de que no haya
cambios en el plegado de la variante total, se realizó el experimento de dicroísmo circular (Fig. 7
complementaria ).

Art. 4

Preparación de plásmidos y cepas para la expresión de PETasa en E. coli y B. subtilis. El gen PETasa
(número de acceso de GenBank, GAP38373.1) fue codificado optimizado y sintetizado por Generay
Biotechnology (Shanghai, China) para la expresión en E. coli. La alineación del ADN de la secuencia
codificante optimizada y la secuencia codificante original se muestra en la Figura S1. El servidor
LipoP 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/ services / LipoP) predijo que los 29 aminoácidos N-terminales
serían el péptido señal (denominado SPPETase). El gen PETasa optimizado sin SPPETasa se
amplificó a partir del gen PETasa sintetizado utilizando pares de cebadores P1 / P2. Después de la
digestión por NdeI / XhoI, la PETasa sin SPPETasa se ligó a la pET21b (+) (Novagen, Madison, WI,
EE.UU.), generando el plásmido pET21b-noSP-PETasa. El plásmido se transformó en E. coli BL21
(DE3), produciendo la cepa recombinante BL21 (DE3) -noSP. El plásmido pHT43R se construyó
eliminando el gen lacI y la secuencia codificante del péptido señal AmyQ en E. coli / B. subtilis
vector lanzadera pHT43 (Figura S2) y se utiliza para la expresión constitutiva de PETasa en B.
subtilis. En primer lugar, se amplificó el gen PETasa sin secuencia señal utilizando el par de
cebadores P3 / P4. Después de digerido por KpnI / XbaI, se insertó en pHT43R, dando lugar al
plásmido recombinante pHT43R-noSP-PETasa. En segundo lugar, las secuencias de péptidos señal
de SPAmyE, SPBpr, SPSacB, SPPhoD y SPYwbN se amplificaron a partir del ADN cromosómico de B.
subtilis 168 utilizando pares de cebadores P7 / P8, P9 / P10, P11 / P12 y P13 / P14,
respectivamente. La secuencia codificante de SPPETasa se amplificó a partir del gen de PETasa
sintetizado utilizando el par de cebadores P15 / P16. Las secuencias señal digeridas con BamHI /
KpnI se insertaron en los sitios correspondientes entre el promotor constitutivo Pgrac y la
secuencia codificante de NoSP-PETasa del plásmido pHT43R-noSPPETasa, generando los plásmidos
pHT43R-SPAmyE-PETasa, pHT43RSPBpr-PETasa, pHT43R-SPSacB-PETasa, pHT43R-SPPhoD-PETase,
pHT43R-SPYwbN-PETase y pHT43R-SPPETase-PETase, respectivamente. Por último, estos
plásmidos recombinantes se transformaron en B. subtilis 168, produciendo las cepas 168-noSP,
168-SPAmyE, 168-SPBpr, 168-SPSacB, 168-SPPhoD, 168-SPYwbN y 168-SPPETasa. Como control, el
plásmido pHT43R se transformó en B. subtilis 168, generando la cepa 168-C.

Todas las proteínas recombinantes en este estudio contienen una etiqueta C-terminal 6 × His para
purificación y análisis de transferencia Western.

Los componentes se eliminaron mediante recombinación homóloga utilizando los plásmidos

pIEFAdCd, pIEFAyCy y pIEFAc.19 Para la ruptura del operón tatAd-tatCd, primero, el pIEFAdCd
linealizado con XhoI se transformó en B. subtilis 168 y se cultivó en placas de agar LB
suplementadas con 100 μg / mL espectinomicina. La PCR de colonias se usó para confirmar que
tatAd-tatCd estaba interrumpido por el gen de resistencia a espectinomicina (spc) y el gen de
toxina mazF. En segundo lugar, los clones positivos se cultivaron en 20 ml de medio LB sin
antibióticos durante 24 h. Este paso se utilizó para eliminar los casetes spc y mazF, lo que
generaría una cepa con resistencia a isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG). En tercer lugar, el cultivo
se sembró en una placa LB complementada con IPTG 1 mM. Para confirmar la deleción de los
casetes spc y mazF, se cultivaron las colonias en las placas LB suplementadas con espectinomicina.
Las colonias sensibles a espectinomicina se analizaron adicionalmente mediante PCR y
secuenciación de ADN. Finalmente, se obtuvo la cepa recombinante ΔTatAdCd (Figura S3A). De
manera similar, tatAytatCy y tatAc se eliminaron, generando las cepas ΔTatAyCy y ΔTatAc (Figura
S3B, C). Sobre la base de ΔTatAyCy y ΔTatAc, el tatAd-tatCd se eliminó, generando las cepas
ΔTatAdCdAyCy y ΔTatAdCdAc, respectivamente. Basado en ΔTatAyCy y ΔTatAdCdAyCy, se eliminó
tatAc, generando ΔTatAyCyAc y ΔTotal Tat. El plásmido pHT43R-SPPETasa-PETasa se transformó
en cepas defectuosas, dando lugar a las cepas ΔTatAdCd-SPPETasa, ΔTatAyCy SPPETasa, ΔTatAc-
SPPETasa, ΔTatAdCdAyCy-SPPETasa, ΔAdCdAyCy-SPPETasa, ΔAdCdAyCy-SPPETasa, ΔAdCdAyCy-
SPPETasa, ΔAdCdAc-SPPETTasa, ΔAdCdAc-SPPETTasa. Los plásmidos pHT43R-SPBpr-PETasa,
pHT43R-SPSacB-PETasa y pHT43R-SPPhoD-PETasa se transformaron en ΔTotal Tat, produciendo las
cepas ΔTotal Tat-SPBpr, ΔTotal Tat-SPSacB y ΔTotal Tat-SPPhoD.

Expresión heteróloga y purificación de PETasa recombinante. Se cultivó E. coli BL21 (DE3) -noSP en
medio LB suplementado con 100 μg / ml de ampicilina a 37 ° C hasta una DO600 de 0,8. Después
de la inducción mediante la adición de IPTG 0,6 mM, el cultivo se incubó a 16 ° C durante 24 h. Las
células se recogieron por centrifugación (13000 g, 10 min, 4ºC), se resuspendieron en Tris-HCl 20
mM (pH 7,5, imidazol 20 mM, NaCl 500 mM) y se rompieron mediante sonicación en hielo. Luego
se obtuvo el extracto libre de células por centrifugación (13000g, 10 min, 4 ° C) y se almacenó a 4 °
C para su purificación. Las cepas de B. subtilis recombinantes se cultivaron en medio LB
suplementado con cloromicetina 10 μg / ml a 30 ° C durante 20 h. Las células de B. subtilis y el
sobrenadante de cultivo se obtuvieron por centrifugación (13000 g, 10 min, 4 ° C),
respectivamente. Las células se resuspendieron posteriormente en tampón de lisis (tampón de
fosfato de potasio 100 mM, pH 7,0) que contenía 5 mg / ml de lisozima. Después de incubarse a 37
° C durante 1 h, las células se rompieron mediante sonicación en hielo. Luego, el extracto libre de
células se recogió por centrifugación (13000 g, 10 min, 4 ° C). Tanto el sobrenadante del cultivo
como el extracto libre de células se almacenaron a 4 ° C para su posterior estudio. La purificación
de PETasa recombinante expresada en E. coli y B. subtilis se realizó mediante el kit de purificación
His Bind (Novagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la purificación, la
enzima en el tampón de elución (imidazol 1 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7,9) se cambió más
a tampón fosfato (Na2HPO4-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0) mediante un amicon dispositivo de
filtro centrífugo ultra-4 (Millipore, EE. UU.), y luego se almacena a 4 ° C. La concentración de
proteína purificada se determinó mediante el kit de ensayo CoomassiePlusTM (Bradford) (Thermo
Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Art.5

2.1. Construcción de vectores de expresión

El gen de codón optimizado para IsPETasa se sintetizó [6] y se subclonó en un vector pET22b (þ)
(Novagen / Merck) sin su secuencia líder. Debido a la existencia de un sitio de restricción Nco I
(CCATGG), agregamos dos nucleótidos (CG) frente al gen insertado para evitar un cambio de
marco, lo que resultó en la adición de Met y Ala en el extremo N de las proteínas secretadas. . La
secuencia líder PelB del producto de clonación (pET22b: IsPETasa) se reemplazó usando enzimas
de restricción Nde I y NcoI con cinco péptidos señal diferentes amplificados a partir del genoma de
E. coli K12 mediante PCR. Estos incluyeron los péptidos señal de la proteína periplásmica de unión
a maltosa / maltodextrina, maltoporina, chaperona molecular periplásmica SurA, proteína de
intercambio tiol: disulfuro DsbA y proteína del sistema Tol-Pal TolB (pET22b-SPMalE: IsPETasa,
pET22b-SPLamB: IsPETasa, pET22bSETasa , pET22b-SPDsbA: IsPETase y pET22b SPTolB: IsPETase).
También se preparó un vector pET21a (Novagen / Merck) que contenía el gen IsPETasa como
control negativo (pET21a-PET) y contenía el gen de codón optimizado entre el sitio de restricción
Nde I y Xho I. Todos los cebadores utilizados en este trabajo se resumen en la Tabla 1.

2.2. Expresión de las proteínas recombinantes

Los vectores de expresión pET22b: IsPETase, pET22b-SPMalE: IsPETase, pET22b-SPLamB: IsPETase,

pET22b-SPSurA: IsPETase, pET22bSPDsbA: IsPETase, pET22b-SPTolB: IsPETase y pET21a: E. coli-
BL21a se transformaron en DEPETi T1R, que se cultivó a 37 ° C en un matraz que contenía 1 L de
medio de caldo de lisogenia y 200 mg de ampicilina L1 hasta una densidad óptica de 0,6 a 600 nm.
Después de la inducción mediante la adición de 0,1 mM de isopropil b-D-1-tiogalactopiranósido
(IPTG), el cultivo se incubó adicionalmente durante 24 horas a 18ºC con agitación vigorosa (130
rpm).

2.3. Fraccionamiento celular y preparaciones de proteínas

Las células se recolectaron luego por centrifugación a 6000 g durante 30 min a 4 C. Se recolectaron
alícuotas (100 mL) de cada fracción de medio de 1 L y se concentraron 50 veces a 2 mL usando un
filtro centrífugo Amicon® Ultra15 10 K (Millipore) a 4 C. En este paso, se recogieron muestras de
las fracciones concentradas para su uso en SDS-PAGE. Las fracciones concentradas se dializaron
hasta 50 ml contra tampón A enfriado con hielo (TriseHCl 40 mM, pH 8,0) y se cargaron en una
columna de agarosa Ni-NTA (Qiagen). Después de lavar con tampón A que contenía imidazol 9
mM, las proteínas unidas se eluyeron con 15 ml de imidazol 300 mM en tampón A. Las fracciones
de elución de cada muestra se concentraron finalmente a 2 ml usando un filtro centrífugo y se
prepararon para SDS PAGE. Las proteínas purificadas se cuantificaron utilizando un
espectrofotómetro de microplacas BioTek ™ Epoch y un software de análisis de datos de
microplacas Gen5 ™. El valor del coeficiente de extinción de la proteína se obtuvo utilizando la
herramienta ProtParam del servidor ExPASy [15].
Art. 6

2.5. Expresión y purificación de proteínas en E. coli

Todas las proteínas de tipo salvaje y mutantes se clonaron en el vector pET28a y se transformaron
en células E. coli BL21 (DE3) que se cultivaron en medio Luria-Bertani (LB) a 37ºC hasta una DO600
de 0,6 a 0,8. Usando el plásmido que se construyó en la síntesis de proteína libre de células como
plantilla, la PETasa de tipo salvaje y R61A, L88F e I179F se clonaron mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Se introdujeron sitios BamHI y EcoRI en ambos extremos del gen
clonado y se clonaron en pET28a mediante digestión con endonucleasas de restricción.
Posteriormente, el cultivo se enfrió a 16 C y se indujo con isopropil b-D tiogalactopiranósido (IPTG)
a una concentración final de 0,1 mmol L1 durante 20 ha 16 C Y. Ma et al. / Ingeniería 4 (2018) 888–
893 889 y 160 r min1. Las células se recolectaron por centrifugación. (25 min, 10ºC, 4000 r min1).
Pellets de células de la celda de 200 ml los cultivos se resuspendieron en 10 ml de tampón de lisis
Ni-NTA (50 mmol L1 NaH2PO4, 300 mmol L1 NaCl, 10 mmol L1 imidazol, pH 8). Las células se
rompieron mediante sonicación en hielo y los lisados se centrifugaron (30 min, 10ºC, 4000 r min1).
El sobrenadante se aplicó a una columna de níquel marcada con His (Beyotime Biotechnology,
China). Después de lavar la proteína no unida con 10 ml de tampón de lisis, la proteína unida se
eluyó con tampón de elución (50 mmol L1 Tris-HCl, pH 7,5, 300 mmol L1 NaCl, 200 mmol L1
imidazol). A continuación, se llevó a cabo el intercambio de tampón a 50 mmol de L1 Na2HPO4-
HCl (pH 7,0) y 100 mmol de solución de L1 NaCl usando una columna de filtración en gel PD-10 (GE
Healthcare, EE.UU.).