Clonar una secuencia en un vector pPICZ implica varios pasos.

Aquí te dejo un resumen del

proceso:

 Preparación del inserto y el vector: Primero, necesitas obtener la secuencia de ADN que
quieres clonar (el inserto) y el vector pPICZ. Ambos deben ser cortados con las mismas
enzimas de restricción para que puedan unirse correctamente1.
 Digestión enzimática: La construcción obtenida y el vector se someten a restricción con las
enzimas EcoR1 y NotI1. Esto genera extremos compatibles en el inserto y el vector.
 Purificación del inserto: El inserto de la digestión enzimática se purifica1.
 Ligación: Luego, se realiza la ligación del inserto en el vector pPICZ que ha sido digerido
con las mismas enzimas1.
 Transformación: Finalmente, se transforma una cepa de E. coli (como DH10b) con el vector
ligado1.

Método: Diseño de primers con sitios de corte para clonación

Autor: Alberto Checa Rojas
Ciencias naturales > Ciencias biológicas > Bioquímica y biología molecular
30 enero, 2020
Descripción
Los sitios de restricción se incorporan dentro de los primers 5′ (directo) y 3′ (inverso) cuando se
amplifica un gen blanco mediante PCR. La elección del sitio de restricción en los primers es muy
importante para que pueda ser incorporado en la posición correcta dentro de un plásmido. La
clonación basada en PCR es versátil y permite que cualquier fragmento de ADN se coloque en
cualquier vector de su elección con mínimas limitaciones. En general, el primer debe contener
alrededor de 15-18 pb de secuencia del gen blanco que es requerido para realizar la PCR. Pero
además, debe agregar el sitio de restricción en el extremo 5 ‘ del primer más una secuencia aleatoria
de 6 pb para asegurar que la enzima de restricción pueda cortar eficiente al ADN.

Materiales
 Computadora
 Secuencia del vector
 Secuencia del gen
 Secuencia de las enzimas
 Software para visualizar los primers (SnapGene)
Procedimiento
1. Busque la secuencia de su vector en una base de datos de su elección y descargue su
secuencia en formato fasta
2. Abra el software SnapGene en “New DNA File” y corte y pegue dentro del recuadro blanco
la secuencia, si esta en formato FASTA borre el encabezado o “header”
3. Si es todo un plásmido marque en la topología que es circular, si es un fragmento de una
secuencia de ADN coloque que es lineal
4. NOTA: si su gen lo quiere usar para expresión de proteínas coloque la secuencia CDS.
Si no conoce la secuencia CDS le recomendamos haga una
busqueda https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/CCDS/CcdsBrowse.cgi
5. Asegurese de que tiene codon de inicio y de paro, para más información ver: Gen: Desde el
código genético hasta la ingeniería genética
6. Agregue un nombre/título para su archivo (ej.: Gen1) y de continuar (OK). NOTA: se verá
un recuadro verde donde especifique la longitud de la secuencia en número nucleótidos
7. Aparecerá en una ventana el mapa de la secuencia con diferentes sitios de corte, junto con
los codones de inicio y de paro
8. De un click en la parte inferior izquierda en la pestaña de secuencia
9. Coloque el puntero en el inicio del codón de inicio y arrastre el puntero dejando apretando
el botón izquierdo del mouse o doble click en su mouse pad, hasta 55-60°C de Tm (melting
temperature).
10. Suelte el botón izquierdo y vaya a la parte superior donde dice Primers y seleccione add
primers
11. Seleccione Top strand y observe que la dirección de la amplificación de su primer 5′ a 3′ sea
la correcta
12. Nombre su primer y verifique el tamaño del primer y su porcentaje de GC sea el adecuado
(≥18 nt y ≤50% GC) y las Tm sean las mismas para ambos Primers
13. Copie la secuencia de su primer y colóquela en un archivo ex profeso (*.txt, *.doc)
14. Coloque de ser necesario un color y una descripción de ese primer
15. Repita los pasos 8 al 14 pero empezando por el codón de paro y colocando bottom strand
16. No olvide etiquetar bien en su documento nuevo las secuencias y su dirección Fw y Rev
(forward and reverse)
17. Teniendo una su hoja de texto coloque títulos a sus primers, estos primers iniciales son para
las primeras amplificaciones
18. Coloque otra línea con nuevos títulos agregando el sitio de restricción de su interés ej.
Primer1_BamHI, Primer2_HindIII).
19. Agregue manualmente el sitio de corte del primer1 a lado de codón de inicio (si queremos
colocar BambHI busque la secuencia y colóquela en la dirección correcta 5′-
3′ https://international.neb.com/products/r0136-bamhi#Product%20Information. [1] NOTA:
si olvidó copiar las secuencias de doble click en el primer coloreado
20. Realice el mismo procedimiento para su primer2
 21. Coloque de 5-6 nucleótidos aleatoriamente antes de sus secuencia de Primer1_BamHI y
después de su secuencia Primer2_HindIII. NOTA: si no coloca estas secuencias su enzima
no podrá cortar el sitio de corte
22. Después de colocar la secuencia del Primer2 es importante que saque su reverso, puede
realizarlo con la ayuda de este
programa https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html [2]
23. Teniendo el reverso corte y pegue toda su secuencia de interés original (FASTA sin
encabezado al documento) y coloquele un título ej.: Gene1
24. Posteriormente coloque las secuencias con los sitios de corte y los nucleótidos aleatorios
25. Verifique su secuencia completa agregandola nuevamente a SnapGene paso 2 y renombre
su archivo Gen1_sitios de corte
26. Observe el mapa de su gen y verifique que se armó correctamente y se observan los sitios
de corte
27. Diseñe primers agregando los sitios de corte como se indican en el punto 9 en adelante.
28. Cuando realice sus amplificaciones empiece con los primers 1 y 2 y cuando obtenga una
banda limpia y clara realice un segundo round de PCR con los primers que contienen los
sitios de corte.
29. Para ligar su secuencia en un plasmido le recomendamos seguir el siguiente
protocolo http://conogasi.org/articulos/metodo-ligamiento-con-t4-adn-ligasa/ [3]
Método: ligamiento con T4 ADN ligasa
Autor: Alberto Checa Rojas
Coautor: Orlando Santillán Godínez
Ciencias naturales > Ciencias biológicas > Bioquímica y biología molecular | Biotecnología
10 enero, 2018
La reacción con la enzima ligasa cataliza la unión de dos moléculas deseadas de ADN (inserto y
vector) en un plásmido generalmente a partir de la formación de enlaces covalentes.
Los plásmido [1] son vectores de clonación útiles porque son fáciles de duplicarse en un alto número
de copias en las células bacterianas, además de que son faciles de aislar y purificar. Los plásmidos
más comúnmente utilizados en la tecnología del ADN recombinante [2] se replican en E. coli. En
general, estos plásmidos se han diseñado para optimizar su uso como vectores en la clonación de
ADN. Para seleccionar un vector de clonación se deben conciderar las siguientes características:
1. El ADN inserto debe tener dos sitios de corte en los extremos donde se ligara al plásmido
(ej. sitios Hind III, BamHI, etc.). NOTA: estos sitios pueden ser agregados en los primers
de una PCR
2. El vector debe poseer sitios únicos de corte para las enzimas de corte de nuestro inserto
3. El plásmido debe ser de tamaño pequeño
4. El vector debe tener una replicación independiente.
5. Debe tener algún marcador de selección (ej.: antibiótico)
Una vez seleccionado el vector, éste es cortado con las enzimas de restricción [3] y mezclado al igual
que nuestro ADN deseado (inserto). La unión de ambas moléculas involucra la formación de un
enlace fosfodiester entre el extremo 5′ de una de las moléculas con el extremo 3′ de la otra. Esta
reacción es catalizada por enzimas llamadas ADN ligasas. La ligasa más ampliamente usada es la
T4 ligasa, esta enzima permite unir fragmentos con extremos romos o cohesivos complementarios.
La reacción necesita de un medio iónico debido a que la enzima T4 es sensible a pequeñas
variaciones en la concentración de sal, además la enzima requiere ATP como cofactor.

Material
1. ADN inserto
2. Plásmidos
3. Tubos de 1.5 mL
4. Gradilla para tubos de 1.5 mL
5. Guantes
6. Micropipetas
7. Hielo
8. Mezclador con calor (tipo Thermomixer)
Reactivos
1. Enzimas de restricción
2. Buffer para enzimas
3. T4 ligasa
4. Agua ultra pura libre de nucleasas
Procedimiento
1. Se coloca en una gradilla un tubo de 1.5 mL y se adiciona:
ADN inserto 37.5 ng
ADN vector 50.0 ng
Buffer 10X 2 μl
T4 ligasa 1 μl
Agua ultra pura llervar a 20 μl
NOTA: esta reacción se prepara sobre hielo.
2. Se mezcla suavemente con una pipeta y se centrifuga brevemente
3. Se coloca el tubo en el thermomixer y se incuba la reacción a 14-16 °C toda la noche o a
temperatura ambiente durante 2 horas. NOTA: alternativamente, puede usarse una alta
concentración de ADN ligasa de T4 en una ligadura de 10 minutos) .
4. Al terminar la incubación inactive la enzima con calor a 65 ° C durante 10 minutos.
5. Enfríe sobre hielo y transforme 1-5 μl de la reacción en 50 μl de células competentes [4].
Nota: La reacción de ligación de extremos cohesivos se lleva a cabo a una temperatura de 12o a
16oC para mantener un balance entre el alineamiento de los extremos cohesivos del ADN y la
actividad de la enzima.