BIOLOGIA CELULAR Y

MOLECULAR
DISEÑO DE PRIMERS

Salomé Calahorrano MSc.

 OBJETIVOS
Reconocer los Usar herramientas
parámetros para el informáticas para el
diseño de primers diseño de primers

Interpretar los Diseñar un par de

resultados obtenidos primers para PCR que
bioinformáticas funcionen :D
 PRIMER

Reverse
primer

Forward
primer
Primers
• Deben ser almacenados correctamente
• DNAsas
• Preparar solución stock (alícuotas)
RECONSTITUCIÓN DE PRIMERS Y
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE
TRABAJO
• Liofilizado

nmol x 10 = V (uL)

Ficha Técnica
PCR
PÁRAMETROS DE LOS PRIMERS

Temperatura de fusión
Longitud y temperatura de
anillamiento

GC Contenido G-C Estructuras

secundarias
LONGITUD DE LOS PRIMERS

17-28 pares de bases

< 17 Hibridaciones
inespecíficas >28 Tasas más lentas
de hibridación
TEMPERATURA DE FUSIÓN
Temperatura de fusión (Tm)
• 2 primers con temperaturas
similares (dentro de los 2°C)
• Valor referencial (60-64°C)
Fórmula de Marmur
Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C
GGAATTCGAAAAATGATCC

Tm = 4 * (4+3) + 2 * (8+4)
Tm = 52°C
TEMPERATURA DE ANILLAMIENTO
Temperatura de
anillamiento (-5°C de la
de fusión)
• Depende de la
composición y longitud
de los primers
• Muy baja: inespecífico
• Muy alta: bajo
rendimiento de
amplificación

Gradiente de temperatura
Tm = 52°C Ta = ?
CONTENIDO G-C
Evitar regiones con alto contenido de G-C
Contenido G-C: 50-60% Regiones con bases idénticas
• Repeticiones (>3bp) ex. TTT

GGAATTCGAAAAATGATCC
Contenido G-C = (G+C)/Longitud del primer
Contenido G-C = (4+3)/19 = 0.3684*100% = 36.84%
 ESTRUCTURAS SECUNDARIAS
• Secuencias complementarias al primer

Rouchka, Eric & Khalyfa, Abdelnaby & Cooper, Nigel. (2005). MPrime: Efficient large scale multiple primer and
oligonucleotide design for customized gene microarrays. BMC bioinformatics. 6. 175.
ESTRUCTURAS
SECUNDARIAS
 ¿Qué pasa si el primer no está correctamente
diseñado?
• Mispriming
• Ausencia de primer
(estructura secundaria)
Codones
ORF: codón inicio y codón fin

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/
EJEMPLO
Se obtiene una secuencia de 910 núcleotidos para del gen p53, diseñar
primers que amplifiquen la región codificante

TCCTACAGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTG
GGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATG
ACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGC
ATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGT
GGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAAC
AGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTA
ATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGA
AGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCC
AACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCC
GTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGG
GAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGC
CATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGACATTCTCCACTTCTTGTTCCCCACT
GACAGCCTCCCACCCCCATCTCTCCCTCCCCTGCCATTTTGGGTTTTGGGTCTTTGAACCCTTGCTTGCA
EJEMPLO
FORWARD PRIMER Longitud del
primer?

5ˈ TCCTACAGTA CTCCCCTGCC CTCAACAAG ATGTTTT 3 ˈ Temperatura

de
anillamiento?

TCCTACAGTA CTCCCCTGC Contenido G-C?

3ˈ AGGATGTCAT GAGGGGACGG GAGTTGTTC TACAAAA 5ˈ

Se puede
autohibridar ?
EJEMPLO
Se obtiene una secuencia de 910 núcleotidos para del gen p53, diseñar
primers que amplifiquen la región codificante

TCCTACAGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTG
GGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATG
ACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGC
ATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGT
GGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAAC
AGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTA
ATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGA
AGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCC
AACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCC
GTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGG
GAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGC
CATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGACATTCTCCACTTCTTGTTCCCCACT
GACAGCCTCCCACCCCCATCTCTCCCTCCCCTGCCATTTTGGGTTTTGGGTCTTTGAACCCTTGCTTGCA
EJEMPLO
>NM_057220.3 Drosophila melanogaster gurken (grk)

FORWARD PRIMER Longitud del

primer?

5ˈ GACTGACATT CTCCACTTCT TGTTCCCCA CT 3 ˈ x

Temperatura
GAGGTGAAGA ACAAGGGGT de
anillamiento?
3 ˈ CTGACTGTAA GAGGTGAAGA ACAAGGGGT GA 5ˈ
Contenido G-C?

3 ˈ GAGGTGAAGA ACAAGGGGT 5ˈ Se puede

autohibridar ?

5 ˈ TGGGGAACA AGAAGTGGAG 3ˈ
EJEMPLO ¿Cuál es el tamaño del amplicón?
5 ˈ TCCTACAGTA CTCCCCTGC 3ˈ
Se obtiene una secuencia de 910 núcleotidos para del gen
p53, diseñar primers que amplifiquen la región 5 ˈ TGGGGAACA AGAAGTGGAG 3ˈ
codificante

1 TCCTACAGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTG
71 GGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATG
141 ACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGC
211 ATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGT
281 GGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAAC
351 AGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTA
421 ATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGA
491 AGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCC
561 AACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCC
631 GTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGG
701 GAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGC
771 CATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGACATTCTCCACTTCTTGTTCCCCACT
841 GACAGCCTCCCACCCCCATCTCTCCCTCCCCTGCCATTTTGGGTTTTGGGTCTTTGAACCCTTGCTTGCA
Elegir un molde
1. Identificar el gen de interés o la parte de ADN que se desee amplificar
Recomendación: organismos completamente secuenciados
Se puede usar secuencias parcialmente secuenciadas (db)
El objetivo de la PCR:
Secuencia pequeña (>100 bp)
Secuencia codificante
Gen entero
Secuencia intergénica
Operones (procariotas)
*Secuencias muy grandes pueden ser dificiles de amplificar (>10kb)
Elegir un molde
2. Decidir en donde comienza y en donde termina el amplicon
BUSQUEDA DE LA SECUENCIA GÉNICA
GenBank
 Escherichia coli K12 fur
GenBank
 BUSQUEDA DE LA SECUENCIA GÉNICA
(SIN ANOTACIÓN)
• BLAST
• Identificar
• Especificar un lugar del gen
• Que otros microorganismos tiene ese gen
• Que tan preserva es la secuencia

• Amplificar la misma secuencia de diferentes organismo

• Diseñar un primer que se una a una región conservada de un gen variable en
un grupo de organismos
BLAST

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
BLAST
Espera por se está buscando en la base de datos
PRIMER BLAST
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome
 Ejemplo

E. coli fur (447bp)

1 atgactgata acaataccgc cctaaagaaa gctggcctga aagtaacgct tcctcgttta 1 22
61 aaaatcctgg aagttcttca ggagccggac aaccatcacg tcagtgcgga agatttatac
121 aaacgtctga tcgatatggg tgaagaaatt ggtctggcta cggtatatcg cgtactgaac
400 447
181 cagtttgacg acgctggtat cgtcacccgc cacaattttg aaggcggtaa atccgtattt
241 gaactgacac agcaacatca ccacgatcac ctgatctgcc tcgactgcgg caaggttatc
301 gaatttagtg atgattccat cgaagcgcgt cagcgtgaaa ttgccgcaaa acatggcatt
361 cgcctgacta accacagtct ctatctttac ggtcactgtg ccgaaggcga ttgccgcgaa
421 gatgaacatg cgcacgaagg caaataa

Organismo: Coliiformes
EJEMPLO
Gen
Human zinc finger protein
419 (ZNF419) transcript
variant 5

NM_001098494
PARÁMETROS BÁSICOS PRIMERS
• PCR exitosa (especificidad y eficiente amplificación)
• La secuencia
• Primer

Tip: Chequear siempre la literatura

Barak, J. D., Sananikone, K., & Delwiche, M. J. (2005). Comparison of primers for the detection of pathogenic
Escherichia coli using real-time PCR. Letters in Applied Microbiology, 41(2), 112–118
HERRAMIENTAS PARA EL DISEÑO DE
PRIMERS
ORDENAR LOS PRIMERS
• Sigma-Aldritche http://www.sigmaaldrich.com
• Life Technologiese http://www.lifetechnologies.com
• Eurofinse http://www.operon.com

Identificar los
nombres del
primer forward y
reverse
Conclusiones
• Revisión de los parámetros para diseño de primers
• Manejo de primers
• Preparación de primers