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Guia # 8 - biología molecular, PCR y multiplicación ADN

Biologia (Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca)

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Guías de laboratorio # 8

Biología Molecular Laboratorio

William Andrés Nengua Urrego.

Presentado a: Gladys Pinilla.

Universidad colegio mayor de Cundinamarca.

Facultad de Ciencias de la salud

Bacteriología y laboratorio clínico

Bogotá D.C.

2020

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PRE- LABORATORIO

1. ¿Cuáles son las características más predominantes de la Taq polimerasa?

La polimerasa Taq es un tipo de ADN polimerasa termoestable, nombrada de esta forma

debido a que es producida por la bacteria Thermus aquaticus (T-aq), es ideal para la PCR
gracias a esta estabilidad térmica. Como veremos, la PCR utiliza altas temperaturas
repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus cadenas.

La PCR de inicio en caliente evita la amplificación de productos no específicos, amplifica

los objetivos de baja abundancia y ofrece una configuración de reacción conveniente a
temperatura ambiente.

2. Explique la PCR multiplex, nested y RT PCR y sus aplicaciones.

PCR múltiplex

Consiste en hacer diversas implicaciones en el mismo tubo de reacción colocando múltiples

parejas de cebadores. Las secuencias a detectar han de estar lo suficientemente lejos unas de
otras para que las amplificaciones no interfieran entre sí.

Esta técnica se utiliza en la detección del gen de la distrofina en la distrofia muscular de

Duchenne; un gen enorme (de más de 2 millones de pares de bases), que no es adecuado para
ser estudiado mediante análisis indirecto, y que además presenta una marcada heterogeneidad
en sus mutaciones.

El análisis de sonda fluorogénica, desarrollado en 1997, es un método sencillo que puede ser
aplicado a la detección de HPV y subtipos en varios tipos de muestras. La técnica se basa en
la actividad 5'->3 ́ exonucleolítica de la Taq polimerasa que aumenta la señal de marcadores
fluorescentes al liberarlos de las sondas específicas para esos genomas durante PCR múltiple.
Esa fluorescencia puede ser detectada en un fluorómetro automático y se correlaciona con la
cantidad de ADN de HPV presente en la muestra antes de la amplificación.

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PCR anidada

La PCR anidada conocida como Nested PCR es una variante de la PCR convencional que
comprende dos rondas de amplificación con distintos pares de cebadores en cada una, con el
fin de incrementar la sensibilidad y la especificidad de la detección. Primero se realiza una
reacción con los cebadores externos para amplificar una región de ADN más extensa, que
contiene el segmento diana. Después, este producto de amplificación se utiliza como molde
de una segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región específica.

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RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa-transcripción inversa)

Se utiliza para la detección y amplificación de ARN. Permite estudiar la expresión de

determinados genes (su traducción a proteínas). En primer lugar se extrae el ARN total de
las células en estudio y se separa la fracción correspondiente al mensajero (ARNm). Tras
purificarlo el ARN se transcribe a ADN mediante una transcriptasa inversa, por cada
molécula de ARNm se sintetiza una molécula de cADN monocatenaria que posteriormente
se ha de convertir en bicatenaria utilizando una ADN polimerasa (la rTth ADN polimerasa
de Thermus thermophilus es un enzima recombinante y termoestable que actúa como
transcriptasa inversa y como ADN polimerasa simultáneamente). A partir de aquí se aplica
la técnica de PCR lo que permite una detección de la expresión de ARNm mucho más
sensible que con Northern blot o con hibridación in situ 76. La, 80. La secuencia del
fragmento amplificado se determina mediante secuenciación automática de ADN. Existen
diversos kits comerciales, como Gene Amp de ARN-PCR (Pekin-Elmer, Alemania) que
pueden ser utilizados para RT-PCR,50,80.

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Aplicación en dermatología

La RT-PCR puede ser aplicada al ARN extraído de mínimos volúmenes de sangre o en

material archivado como extensiones en laminillas, así como en secciones de tejidos. Por
ello, la RT-PCR es muy útil para detectar la presencia de virus ARN (como el virus del
sarampión) y el análisis citogenético molecular de translocaciones cromosómicas.

Esta técnica se puede usar por ejemplo para detectar la expresión proteica de antígeno
específico prostático en células (detección de micro metástasis o células tumorales
circulantes).

3. Mencione brevemente la función de los componentes más usuales de una PCR (DNA
polimerasa; iniciadores, cebadores o primers; dNTPs o desoxirribonucleótidos
trifosforilados; Buffer y Cloruro de magnesio).

El templado son las cadenas de ADN que se separan y funcionan como molde para que la
enzima sintetice las nuevas cadenas que llevan la secuencia blanco de interés. Por su parte,

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la ADN polimerasa se encarga de la catálisis de la reacción, sintetizando las nuevas cadenas

de ADN que llevan la secuencia blanca. La enzima más usada con frecuencia se llama Taq
ADN polimerasa, que proviene de una bacteria termófila llamada Thermus aquaticus, la cual
vive en condiciones de temperatura muy altas y por eso su ADN polimerasa es capaz de
soportar ese tipo de temperaturas. El rasgo que distingue a esta enzima bacteriana de otras
ADN polimerasas de otros organismos es su capacidad para mantener su funcionalidad a
temperaturas altas, por lo que se le considera una enzima termoestable.

Los primers son secuencias de oligonucleótidos que flanquean y delimitan la secuencia

blanca que se desea amplificar y son complementarios a ésta. Generalmente su tamaño oscila
entre 15-25 pares de bases y la cantidad de G-C no debe ser más del 55% de la secuencia. Si
no se respetan estas reglas, existe la posibilidad de la formación de dímeros de primers, es
decir, de productos inespecíficos. Son dos secuencias diferentes de primers las que se
utilizan en la PCR, una denominada «forward» o sentido y otra «reward» o anti sentido;
ambas deben estar diseñadas para que hibriden con el templado y las cadenas de ADN puedan
ser extendidas por la Taq polimerasa en dirección 5’-3 (como sucede endógenamente).

Por su parte, los dNTP’s son los ladrillos o bases nitrogenadas con los que la Taq polimerasa
construye las nuevas cadenas de ADN. Son factores importantes que contribuyen a la
especificidad de la reacción, por ello es importante que su concentración sea la adecuada ya
que de lo contrario pueden afectar la función de la Taq polimerasa. Normalmente, se utilizan
a una concentración que oscila entre 0.2 a 1.0 mM. El buffer es la solución amortiguadora
que se usa en la reacción y generalmente está compuesta de Tris-HCL (pH = 8) cuya
concentración final de trabajo debe ser 1X. El magnesio es un cofactor enzimático que
influye en la especificidad de la reacción, por eso se debe tener una concentración adecuada
para que no afecte el rendimiento de la Taq polimerasa; regularmente su concentración oscila
entre 0.5 y 2.5 mM. En ocasiones ya viene incluido en el buffer, pero en otras se le tiene que
agregar. El agua es el disolvente en la reacción y se usa en su forma destilada libre de
nucleasas, enzimas que degradan a los ácidos nucleicos.

4. ¿Cómo se diseña un cebador y cuáles son los parámetros a tener en cuenta?

algoritmos habituales para el diseño de cebadores, que deben cumplir tres condiciones:

• Una pareja de cebadores debe tener temperaturas de alineamiento muy cercanas para
maximizar el rendimiento, lo cual suele traducirse en un contenido en GC similar,
entre 50% y 60%.
• Los primers no deben favorecer horquillas ( hairpins ) ni ser complementarios. El
siguiente esquema muestra un cebador con una horquilla potencial a la izquierda y un
par de cebadores que se aparean a la derecha:

• Tras analizar una gran colección de primers publicados en la literatura, parece que
conviene evitar secuencias que terminen en GGG,GGT,ATT,CGA,TAA o TTA
(Onodera, 2007).

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Hay muchos programas que pueden ayudar en el diseño de primers en la web, como por
ejemplo:

• primer3
• Vector NTI
• in sillico PCR en procariotas y en animales

o estos otros para diseñar primers degenerados, que permiten reconocer y por tanto amplificar
varias secuencias similares

• CODEHOP (sin mantenimiento)

• amplicon
• primer s4 clades (específico para aplicaciones filogenéticas).

calcular la Tm, que es la temperatura a la que la mitad de los primers se han hibridado con
el ADN molde, o la cantidad de ADN bicatenario a cualquier temperatura, por ejemplo, a la
temperatura de apareamiento, la más crítica, que a menudo se aproxima como Tm - 5.

Una aproximación burda es llamada regla de Wallace, que se basa solamente en la secuencia,
donde GC y AT son el número de nucleótidos G/C y A/T en la secuencia del cebador,
respectivamente:

Otra alternativa más precisa es la siguiente ecuación, que relaciona exactamente la

temperatura con la proporción de ADN bicatenario, donde [A] es la concentración de hebras
en exceso (los primers), [B] el ADN molde que queremos amplificar, el cambio de
entalpía, ΔS el cambio de entropía y la constante de Boltzmann (R=1.987 cal/mol K):

5. Si la técnica de PCR es exponencial, en cada ciclo se obtiene el doble de producto,

calcule cuántos millones de copias obtendría después de 34 ciclos en la PCR.

si la técnica es exponencial y cada uno obtiene el doble del producto, podemos decir que
arrancando desde el ciclo 1 la base exponencial por el resultado del ciclo es dos y se sostiene
la base por el doble de resultados.

primer ciclo = 1 ADN resultado 2 ADN.

se duplica por lo cual tomamos 2 como base y se aumenta el exponencial hasta el número de
ciclos al que se somete la muestra.

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El resultado final de la exponencial nos indica el número de réplicas en la muestra después

de la cantidad de ciclos.

(2)34 = 17179869184

2: # de veces que se replica la muestra.

34: # de ciclos de la muestra.

17.179.869.184: cantidad de réplicas después de 34 ciclos.

POST-LABORATORIO

1. ¿Qué condiciones deben tener los Primers utilizados para la PCR?

• Una pareja de cebadores debe tener temperaturas de alineamiento muy cercanas para
maximizar el rendimiento, lo cual suele traducirse en un contenido en GC similar,
entre 50% y 60%.
• su tamaño oscila entre 15-25 pares de bases.
• evitar secuencias que terminen en GGG, GGT, ATT, CGA, TAA o TTA.

2. Explique en qué consiste la PCR en tiempo real.

La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) es la capacidad de

monitorear el progreso de la PCR a medida que ocurre (es decir, en tiempo real). Por
lo tanto, los datos se recopilan durante todo el proceso de PCR, en lugar de al final
de la PCR. Esto revoluciona por completo la forma en que uno se acerca a la
cuantificación de ADN y ARN basada en PCR. En la PCR en tiempo real (qPCR), las
reacciones se caracterizan por el punto en el tiempo durante el ciclo en el que se
detecta por primera vez la amplificación de una diana en lugar de la cantidad de diana
acumulada después de un número fijo de ciclos. Cuanto mayor sea el número de
copias iniciales del ácido nucleico diana, antes se observará un aumento significativo
de la fluorescencia. Por el contrario, un ensayo de punto final (también llamado
"ensayo de lectura en placa") mide la cantidad de producto de PCR acumulado al final
del ciclo de PCR.

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3. Para que se utiliza una sonda marcada en la qPCR

Los sistemas de PCR en tiempo real se mejoraron mediante la introducción de sondas

marcadas con fluorógenos que utilizan la actividad nucleasa 5´ de la ADN polimerasa Taq.
La disponibilidad de estas sondas fluorogénicas permitió el desarrollo de un método en
tiempo real para detectar solo productos de amplificación específicos. El desarrollo de sondas
marcadas con fluorógenos también permitió eliminar el procesamiento posterior a la PCR
para el análisis de la degradación de la sonda.
Cómo funciona la química de detección de secuencias TaqMan
La química TaqMan utiliza una sonda fluorogénica para permitir la detección de un producto
de PCR específico a medida que se acumula durante la PCR. Así es como funciona:

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Proceso de paso

1. Se construye una sonda de oligonucleótidos que contiene un tinte fluorescente

indicador en el extremo 5 'y un tinte extintor en el extremo 3'. Mientras la sonda
está intacta, la proximidad del tinte extintor reduce en gran medida la
fluorescencia emitida por el tinte indicador por la transferencia de energía de
resonancia de fluorescencia (FRET) a través del espacio.
2. Si la secuencia diana está presente, la sonda se hibrida corriente abajo de uno de
los sitios del cebador y es escindida por la actividad nucleasa 5 'de la ADN
polimerasa Taq a medida que se extiende este cebador.
3. Esta escisión de la sonda:
o Separa el tinte indicador del tinte apagador, aumentando la señal del
tinte indicador.
o Elimina la sonda de la hebra diana, lo que permite que la extensión
del cebador continúe hasta el final de la hebra plantilla. Por tanto, la
inclusión de la sonda no inhibe el proceso de PCR global.
4. Se escinden moléculas de colorante indicador adicionales de sus respectivas
sondas con cada ciclo, lo que da como resultado un aumento de la intensidad de
la fluorescencia proporcional a la cantidad de amplicon producido.

4. En qué consiste una RT PCR, PCR nested o anidada y una PCR multiplex.

PCR múltiplex. Consiste en hacer diversas implicaciones en el mismo tubo de reacción

colocando múltiples parejas de cebadores. Las secuencias a detectar han de estar lo
suficientemente lejos unas de otras para que las amplificaciones no interfieran entre sí.

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Esta técnica se utiliza en la detección del gen de la distrofina en la distrofia muscular de

Duchenne; un gen enorme (de más de 2 millones de pares de bases), que no es adecuado para
ser estudiado mediante análisis indirecto, y que además presenta una marcada heterogeneidad
en sus mutaciones.

La PCR anidada conocida como Nested PCR es una variante de la PCR convencional que
comprende dos rondas de amplificación con distintos pares de cebadores en cada una, con el
fin de incrementar la sensibilidad y la especificidad de la detección. Primero se realiza una
reacción con los cebadores externos para amplificar una región de ADN más extensa, que
contiene el segmento diana. Después, este producto de amplificación se utiliza como molde
de una segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región específica.

RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa-transcripción inversa). Se utiliza para la

detección y amplificación de ARN. Permite estudiar la expresión de determinados genes (su
traducción a proteínas). En primer lugar se extrae el ARN total de las células en estudio y se
separa la fracción correspondiente al mensajero (ARNm). Tras purificarlo el ARN se
transcribe a ADN mediante una transcriptasa inversa, por cada molécula de ARNm se
sintetiza una molécula de cADN monocatenaria que posteriormente se ha de convertir en
bicatenaria utilizando una ADN polimerasa (la rTth ADN polimerasa de Thermus
thermophilus es un enzima recombinante y termoestable que actúa como transcriptasa
inversa y como ADN polimerasa simultáneamente).

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Bibliografía:

1. https://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa_m%
C3%BAltiple#PCR_M%C3%BAltiple_Anidada.
2. https://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/dermatologia/v09_sup1/tecnicas_2.htm
3. https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf.
4. https://eead-csic-compbio.github.io/bioinformatica_estructural/node28.html.
5. https://www.thermofisher.com/co/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-
pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/essentials-real-time-pcr.html

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