Práctica no. 1.

Diseño de oligonucleótidos para PCR

Introducción.

La Reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés
(Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular descrita en 1985 por
Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN
particular.

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. Tras la amplificación, resulta
mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causante de una
enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN
amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una
técnica muy extendida.

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar
hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para
separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a
continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

Para llevar a cabo una reacción de PCR debemos añadir en un tubo un par de
oligonucleótidos que actúen como cebadores para la ADN polimerasa. La elección de estos
oligonucleótidos (cebadores o primers) es crucial dado que han de delimitar la región a
amplificar. En concreto, deben ser complementarios a cada uno de los extremos 3´ de la
región a amplificar. Además del ADN y de los primers, es necesario añadir a la reacción los
4 tipos de desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs) que componen el ADN (dATP,
dGTP, dTTP y dCTP, en una mezcla equimolar de cada uno de ellos), una solución buffer
para mantener la reacción al pH adecuado, asi como el ión Mg+2 como cofactor de la enzima
Por supuesto, añadiremos por último también la ADN polimerasa que, en este caso, ha de
ser una polimerasa termostable capaz de resistir las elevadas temperaturas a la que vamos
a someter a nuestro tubo de reacción.
Los oligonucleótidos o primers son los encargados de dar la especificidad a la reacción por
PCR, por ello es de vital importancia que se diseñen de la manera correcta, ya que un buen
diseño evitará la aparición de productos inespecíficos durante la reacción
Existen varios criterios que se deben de seguir para el diseño, los cuales se enumeran a
continuación:

 Cada primer individual debe contar con una longitud de 18 a 24 bases. De ser
necesario puede contener más de 24 bases, pero nunca menos de 18 si se va a
utilizar para una reacción de PCR.
 Se debe mantener un contenido de G:C (Guanina:Citosina) entre 40 y 60 %.
 De preferencia la primera base del extremo 3’ debe ser una G o una C.
 Evitar regiones con potencialidad para formar estructuras secundarias internas.
 Secuencias adicionales pueden ser agregadas solo en el extremo 5’ del primer (no
incluir cuando se estima la Tm del primer).
 La temperatura de fusión de cada primer (Tm), puede ser calculada por medio de
diferentes ecuaciones y la diferencia de la temperatura entre cada pareja de primers
para PCR no debe mayor de 5°C.

La temperatura de fusión (Tm) de un primer es la temperatura a la cual la mitad de las

moléculas del primer están unidas a su secuencia blanco durante la fase de alineamiento
de la PCR. Por esta razón el cálculo de esta temperatura es de vital importancia para la
reacción de PCR y la diferencia de temperaturas entre cada primer no debe ser mayor de
5°C para que se pueda asegurar que a una temperatura de alineamiento dada, los dos
primers se alinearán a su secuencia blanco.
Existen muchos métodos para estimar el valor de la temperatura de fusión.

Para secuencias de 20 bp o menos, existe la siguiente aproximación:

Tm = 2ºC (A + T) + 4ºC (G + C)
donde se asume una concentración de sal de 0.9M, tipica de "dot blot" y otros ensayos de
hibridización
A continuación tenemos otra expresión para el calculo de Tm
Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - 500/L + 16.6 log[M],
donde L se refiere a la longitud del oligonucleótido, y [M] es la concentración de cationes
monovalentes.
La mayoría de los programas informáticos para el diseño de oligonucleótidos cuentan con
la herramienta para el cálculo de la Tm de cada primer y solo basta con introducir la
secuencia del oligonucleótido.
Objetivo:
Diseñar un par de oligonucleótidos para PCR a partir de la secuencia proporcionada.

Material
Secuencia de RNAm del transcrito de fusión bcr-abl
Consulta de la página de IDT para el cálculo de la Tm
(https://www.idtdna.com/calc/analyzer)
Programa: Serial Cloner (http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html)

Procedimiento

La leucemia granulocítica crónica en un 95% de los casos presenta una traslocación entre
los cromosomas 9 y 22, la cual produce un gen de fusión conocido como bcr-abl. Este gen
puede tener un rol muy importante en el desarrollo de la enfermedad. Una forma de
diagnosticar esta enfermedad es por medio de PCR, amplificando el gen de fusión que solo
se encuentra en las personas afectadas. A partir de la secuencia del gen de fusión bcr-abl
diseñe oligonucleótidos específicos según las instrucciones que le del profesor.

1. El profesor le proporcionará la secuencia del RNAm del gen de fusión bcr-abl y le

proporcionará el tamaño del producto amplificado que se desea obtener.
2. Una vez localizada la región donde va colocar el primer 5’, copiar la secuencia y
escribirla en el lugar indicado
3. Una vez localizada la región donde se va a colocar el primer 3’, copiar la secuencia
convertirla en antiparalela y escribirla en el lugar indicado.
4. Corroborar que todos los parámetros de diseño estén dentro de los rangos
establecidos
Resultados
Diseño de oligonucleótidos para la amplificación del gen de fusión bcr-abl

Tamaño del producto amplificado aproximado:

Parámetros del primer 5’

Secuencia del primer 5’:

Longitud:

%GC:

Tm:

Parámetros del primer 3’

Secuencia del primer 5’:

Longitud:

%GC:

Tm:

Tamaño exacto del producto amplificado: