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Reacción en cadena de la polimerasa: protocolo básico más estrategias de optimización y

resolución de problemas
Todd C. Lorenz 1
1 Microbiología, Inmunología y Genética Molecular, Universidad de California, Los Ángeles

Correspondencia a: Todd C. Lorenz en tlorenz@microbio.ucla.edu

URL: http://www.jove.com/video/3998
DOI: doi: 10.3791 / 3998

Palabras clave: Protocolos básicos, Edición 63, PCR, optimización, diseño de cebadores, temperatura de fusión, Tm, resolución de problemas, aditivos, potenciadores, cuantificación de
ADN de plantilla, termociclador, biología molecular, genética

Fecha de publicación: 22/5/2012

Cita: Lorenz, TC Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. ( 63), e3998, doi:
10.3791 / 3998 (2012).

Abstracto

En las ciencias biológicas ha habido avances tecnológicos que catapultan a la disciplina a edades doradas de los descubrimientos. Por ejemplo, el campo de la
microbiología se transformó con la llegada del microscopio de Anton van Leeuwenhoek, que permitió a los científicos visualizar procariotas por primera vez. El
desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de esas innovaciones que cambió el curso de la ciencia molecular con su impacto que abarca
innumerables subdisciplinas en biología. El proceso teórico fue delineado por Keppe y colaboradores en 1971; sin embargo, pasaron otros 14 años hasta que el
procedimiento completo de PCR fue descrito y aplicado experimentalmente por Kary Mullis mientras estaba en Cetus Corporation en 1985. La automatización y el
refinamiento de esta técnica progresaron con la introducción de una ADN polimerasa termoestable de la bacteria. Thermus aquaticus, en consecuencia el nombre Taq ADN
polimerasa.

La PCR es una técnica de amplificación poderosa que puede generar un amplio suministro de un segmento específico de ADN (es decir, un amplicón) a partir de solo una pequeña
cantidad de material de partida (es decir, plantilla de ADN o secuencia diana). Si bien es sencillo y, en general, no presenta problemas, existen dificultades que complican la
reacción y producen resultados falsos. Cuando la PCR falla, puede dar lugar a muchos productos de ADN no específicos de diferentes tamaños que aparecen como una escalera o
mancha de bandas en geles de agarosa. A veces no se forma ningún producto. Otro problema potencial ocurre cuando las mutaciones se introducen involuntariamente en los
amplicones, dando como resultado una población heterogénea de productos de PCR. Las fallas de PCR pueden volverse frustrantes a menos que se emplee paciencia y una
cuidadosa resolución de problemas para resolver y resolver los problemas. Este protocolo describe los principios básicos de PCR, proporciona una metodología que dará como
resultado la amplificación de la mayoría de las secuencias diana y presenta estrategias para optimizar una reacción. Siguiendo esta guía de PCR, los estudiantes deberían poder:

• Configurar reacciones y condiciones de ciclos térmicos para un experimento de PCR convencional

• Comprender la función de varios componentes de la reacción y su efecto general en un experimento de PCR Diseñar
• y optimizar un experimento de PCR para cualquier plantilla de ADN
• Solucionar problemas de experimentos de PCR fallidos

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El componente de video de este artículo se puede encontrar en http://www.jove.com/video/3998/

Protocolo

1. Diseño de imprimaciones

El diseño de cebadores apropiados es esencial para el resultado exitoso de un experimento de PCR. Al diseñar un conjunto de cebadores para una región específica de
ADN deseada para la amplificación, un cebador debe aparearse con la hebra positiva, que por convención está orientada en la dirección 5 ' → 3' (tambi én conocida
como hebra con sentido o sin plantilla) y la otro cebador debe complementar la hebra negativa, que está orientada en la dirección 3 ' → 5' (hebra antisentido o
plantilla). Hay algunos problemas comunes que surgen al dise ñar cebadores: 1) autoanillado de cebadores que da como resultado la formación de estructuras
secundarias como bucles de horquilla ( Figura 1a); 2) el apareamiento del cebador entre sí, en lugar de la plantilla de ADN, creando
dímeros de imprimación Figura 1b); 3) temperaturas de fusión drásticamente diferentes (T metro) para cada cebador, lo que dificulta la selección de una temperatura de hibridación que
permitirá que ambos cebadores se unan de manera eficiente a su secuencia objetivo durante el ciclo temático ( Figura 1c) ( Ver las secciones CÁLCULO
TEMPERATURA DE FUSIÓN (T metro) y MODIFICACIONES A LAS CONDICIONES DE CICLISMO para obtener más información sobre T metro s).

1. A continuación se muestra una lista de características que deben tenerse en cuenta al diseñar imprimaciones.
1. La longitud del cebador debe ser de 15 a 30 residuos de nucleótidos (bases).
2. El contenido óptimo de GC debe oscilar entre el 40 y el 60%.
3. El extremo 3 'de los imprimadores debe contener una G o C para sujetar el imprimador y evitar la "respiración" de los extremos, aumentando la eficacia del imprimado. La "respiración"
del ADN ocurre cuando los extremos no permanecen recocidos, sino que se deshilachan o parten. Los tres enlaces de hidrógeno en pares GC ayudan a prevenir la respiración, pero
también aumentan la temperatura de fusión de los cebadores.

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4. Los extremos 3 'de un conjunto de cebadores, que incluye un cebador de cadena positiva y un cebador de cadena negativa, no deben ser complementarios entre sí, ni el
extremo 3' de un cebador único puede ser complementario de otras secuencias en el cebador. Estos dos escenarios dan como resultado la formación de dímeros de
cebadores y estructuras de bucle de horquilla, respectivamente.
5. Temperaturas óptimas de fusión (T metro) para las imprimaciones oscilan entre 52-58 ° C, aunque el intervalo se puede ampliar a 45-65 ° C. La T final metro
para ambos cebadores no debe diferir en más de 5 ° C.
6. Deben evitarse las repeticiones de di-nucleótidos (p. Ej., GCGCGCGCGC o ATATATATAT) o las series de una sola base (p. Ej., AAAAA o CCCCC) ya que pueden provocar el
deslizamiento a lo largo del segmento cebado de ADN o la formación de estructuras de bucle de horquilla. Si es inevitable debido a la naturaleza de la plantilla de ADN,
solo incluya repeticiones o ejecuciones de una sola base con un máximo de 4 bases.

Notas:

1. Hay muchos programas de computadora diseñados para ayudar en el diseño de pares de cebadores. Herramienta de diseño NCBI Primer http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/
imprimación-chorro / y Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ son sitios web recomendados para este fin.
2. Con el fin de evitar la amplificación de pseudogenes u homólogos relacionados, podría ser útil ejecutar una explosión en NCBI para comprobar la especificidad diana de los
cebadores.

2. Materiales y reactivos
1. Al configurar un experimento de PCR, es importante estar preparado. Use guantes para evitar contaminar la mezcla de reacción o los reactivos.
Incluya un control negativo y, si es posible, un control positivo.
2. Coloque todos los reactivos necesarios para el experimento de PCR en un cubo de hielo recién lleno y déjelos descongelar por completo antes de preparar una reacción ( Figura
2). Mantenga los reactivos en hielo durante todo el experimento.
• Los reactivos de PCR estándar incluyen un conjunto de cebadores apropiados para el gen o segmento de ADN diana que se desea amplificar, ADN
polimerasa, un tampón para la ADN polimerasa específica, desoxinucleótidos (dNTP), molde de ADN y agua estéril.
• Los reactivos adicionales pueden incluir sal de magnesio Mg 2+ ( a una concentración final de 0,5 a 5,0 mM), sal de potasio K + (a una
concentración final de 35 a 100 mM), dimetilsulfóxido (DMSO; a una concentración final de 1-10%), formamida (a una concentración final de
1,25-10%), albúmina de suero bovino (a una concentración final de 10-100 μg / ml) y Betaína (a una concentración final de 0,5 M a 2,5 M). Los aditivos se
analizan con más detalle en la sección de resolución de problemas.

3. Organice el equipo de laboratorio en el banco de trabajo.

• Los materiales incluyen tubos y tapas de PCR, una gradilla para tubos de PCR, un marcador resistente al etanol y un conjunto de micropipetas que
dispensan entre 1 y 10 μl (P10), 2-20 μl (P20), 20-200 μl (P200) y 200-1000 μl (P1000), así como un termociclador.
• Al configurar varios experimentos de PCR que utilizan los mismos reactivos, se pueden escalar adecuadamente y combinar en una mezcla
maestra (Master Mix). Este paso se puede realizar en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,8 ml (ver Notas).
• Para analizar los amplicones resultantes de un experimento de PCR, se requieren reactivos y equipo para electroforesis en gel de agarosa. Para
aproximar el tamaño de un producto de PCR, se necesita un estándar de tamaño de peso molecular apropiado y disponible comercialmente.

3. Configuración de una mezcla de reacción

1. Empiece por hacer una tabla de reactivos que se agregarán a la mezcla de reacción (ver Tabla 1).
2. A continuación, etiquete los tubos de PCR con el marcador resistente al etanol.
3. Los volúmenes de reacción variarán dependiendo de las concentraciones de los reactivos madre. Las concentraciones finales (CF) para una reacción típica de 50 µl son las
siguientes.
• Tampón X (generalmente suministrado por el fabricante de la ADN polimerasa; puede contener 15 mM de MgCl 2). Agregue 5 l de tampón 10X por reacción.
• DNTP 200 μM (50 μM de cada uno de los cuatro nucleótidos). Agregue 1 μl de dNTP 10 mM por reacción (dATP, dCTP, dTTP y dGTP están en
2,5 mM cada uno).
• 1,5 mM de Mg 2+. Agregue solo si no está presente en el tampón 10X o según sea necesario para la optimización de la PCR. Por ejemplo, para obtener 4.0 mM Mg 2+
necesario para la producción óptima de amplicones de un segmento de ADN conservado de 566 pb que se encuentra en un micobacteriófago no caracterizado añadir 8
μl de MgCl 25 mM 2 a la reacción Figura 3).
• 20 a 50 pmol de cada imprimación. Agregue 1 l de cada cebador 20 m.
• Suma 10 4 a 10 7 moléculas (o alrededor de 1 a 1000 ng) plantilla de ADN. Añada 0,5 μl de ADN de micobacteriófago genómico de 2 ng / μl.
• Agregue de 0,5 a 2,5 unidades de ADN polimerasa por 50 μl de reacción (consulte las recomendaciones del fabricante) .Por ejemplo, agregue 0,5 μl de Sigma.
0,5 unidades / μl Taq ADN polimerasa.
• Agregue agua destilada estéril QS para obtener un volumen final de 50 μl por reacción, según lo predeterminado en la tabla de reactivos (QS es una abreviatura en latín
de quantum satis, que significa la cantidad que se necesita). Por tanto, se requieren 33 µl por reacción para llevar el volumen hasta 50 µl. Sin embargo, debe tenerse en
cuenta que el agua se agrega primero pero requiere inicialmente hacer una tabla de reactivos y determinar los volúmenes de todos los demás reactivos agregados a la
reacción.

4. Protocolo básico de PCR

1. Coloque una placa de 96 pocillos en el cubo de hielo como soporte para los tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml. Permitir que los reactivos de PCR se añadan en tubos de PCR
fríos de pared delgada de 0,2 ml ayudará a prevenir la actividad nucleasa y el cebado inespecífico.
2. Pipetee los siguientes reactivos de PCR en el siguiente orden en un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml ( Figura 4): Agua estéril, tampón de PCR 10X,
dNTP, MgCl 2, cebadores y plantilla de ADN (ver Tabla 1). Dado que los experimentos deben tener al menos un control negativo, y posiblemente un control positivo, es
beneficioso configurar una mezcla maestra en un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml (consulte la explicación en las notas).

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3. En tubos separados para PCR de pared fina de 0,2 ml ( Figura 4) agregue todos los reactivos con la excepción de la plantilla de ADN para un control negativo
(aumente el agua para compensar el volumen faltante). Además, otra reacción (si hay reactivos disponibles) debe contener un control positivo usando ADN molde
yo cebadores previamente conocidos por amplificar en las mismas condiciones que los tubos experimentales de PCR.
4. Taq La ADN polimerasa se almacena típicamente en una solución de glicerol al 50% y para una completa dispersión en la mezcla de reacción se requiere una mezcla suave de los
reactivos de PCR pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces. La micropipeta debe ajustarse a aproximadamente la mitad del volumen de reacción de la mezcla
maestra al mezclar, y se debe tener cuidado para evitar la introducción de burbujas.
5. Ponga tapas en los tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml y colóquelos en el termociclador ( Figura 5). Una vez que la tapa del termociclador esté firmemente cerrada,
inicie el programa (consulte Tabla 2).
6. Una vez finalizado el programa, los tubos de PCR de pared fina de 0,2 ml se pueden retirar y almacenar a 4 ° C. Los productos de la PCR se pueden detectar
cargando alícuotas de cada reacción en pocillos de un gel de agarosa y luego teñiendo el ADN que ha migrado al gel después de la electroforesis con bromuro de
etidio. Si hay un producto de PCR, el bromuro de etidio se intercala entre las bases de las hebras de ADN, lo que permite visualizar las bandas con un iluminador
UV.

Notas:

1. Al configurar varios experimentos de PCR, es conveniente reunir una mezcla de reactivos común a todas las reacciones (es decir, Master Mix). Por lo
general, el cóctel contiene una solución de ADN polimerasa, dNTP, tampón de reacción y agua en un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml. La cantidad de
cada reactivo añadido a la mezcla maestra es equivalente al número total de reacciones más el 10% redondeado al alza a la reacción completa más
cercana. Por ejemplo, si hay 10 x 0,1 = 1 reacción, entonces (10 + 1) x 5 μl de tampón 10X equivale a 55 μl de tampón 10X para la mezcla maestra. Los
reactivos de la mezcla maestra se mezclan a fondo bombeando suavemente el émbolo de una micropipeta hacia arriba y hacia abajo unas 20 veces
como se describe anteriormente. Cada tubo de PCR recibe una alícuota de la mezcla maestra a la que se aplica la plantilla de ADN, los cebadores
necesarios, Tablas 1 y 7).
2. El siguiente sitio web ofrece una calculadora para determinar el número de copias de una plantilla de ADN ( http://www.uri.edu/research/gsc/resources/
cndna.html ). El número total de copias de ADN bicatenario se puede calcular utilizando la siguiente ecuación:

Número de copias de ADN = (cantidad de ADN (ng) x 6.022x10 23) / ( longitud de ADN x 1x10 9 ng / ml x 650 Daltons)

El cálculo del número de copias de ADN se utiliza para determinar cuánta plantilla se necesita por reacción.
3. Pueden producirse falsos positivos como consecuencia del arrastre de otra reacción de PCR que se visualizaría como múltiples productos no deseados en un
gel de agarosa después de la electroforesis. Por lo tanto, es prudente utilizar la técnica adecuada, incluir un control negativo (y un control positivo cuando sea
posible).
4. Si bien el bromuro de etidio es la tinción más común para los ácidos nucleicos, existen varias alternativas más seguras y menos tóxicas. El siguiente sitio web
describe varias de las alternativas, incluido el azul de metileno, el violeta cristal, el SYBR Safe y el rojo gel, junto con descripciones de cómo usar y detectar el
producto final ( http://bitesizebio.com/articles/ethidium-bromide-the-alternatives/ ).
5. Si bien la mayoría de las máquinas de PCR modernas utilizan tubos de 0,2 ml, algunos modelos pueden requerir reacciones en tubos de 0,5 ml. Consulte el manual de su termociclador para
determinar el tamaño de tubo apropiado.

5. Cálculo de la temperatura de fusión (T metro)

1. Conociendo la temperatura de fusión (T metro) de los cebadores es imprescindible para un experimento de PCR exitoso. Aunque hay varios T metro
calculadoras disponibles, es importante tener en cuenta que estos cálculos son una estimación de la T real metro debido a la falta de información específica sobre una reacción
en particular y las suposiciones hechas en los algoritmos para la T metro calculadoras mismas. Sin embargo, la termodinámica del vecino más cercano
Se prefieren los modelos sobre el cálculo más convencional: T metro ≈ 4 (GC) + 2 (AT). El primero dar á una T más precisa metro estimación porque tiene en
cuenta la energía de apilamiento de los pares de bases vecinos. Este último se utiliza con más frecuencia porque los cálculos son
simple y se puede hacer rápidamente a mano. Consulte la sección Solución de problemas para obtener información sobre cómo las diversas condiciones de PCR y los aditivos afectan la
temperatura de fusión.

Para calcular la T metro valores por modelos termodinámicos del vecino más cercano, se recomienda una de las siguientes calculadoras:

http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/

http://www.cnr.berkeley.edu/~zimmer/oligoTMcalc.html

http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/

http://www.finnzymes.com/tm_determination.html

http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?#forms::melting

6. Configuración de condiciones de ciclo térmico

1. Los termocicladores de PCR calientan y enfrían rápidamente la mezcla de reacción, lo que permite la desnaturalización inducida por calor del ADN dúplex (separación de
cadenas), el apareamiento de los cebadores con las cadenas positivas y negativas de la plantilla de ADN y el alargamiento del producto de PCR. Los tiempos de ciclo se calculan
en función del tamaño de la plantilla y el contenido de GC del ADN. La fórmula general comienza con un paso de desnaturalización inicial a 94 ° C a 98 ° C, dependiendo de la
temperatura óptima para la actividad de la ADN polimerasa y el contenido de GC del ADN molde. Una reacción típica comenzará con una desnaturalización de un minuto a 94 °
C. Más de 3 minutos puede inactivar la ADN polimerasa, destruyendo su actividad enzimática. Un método, conocido como PCR de inicio en caliente, extiende drásticamente el
tiempo de desnaturalización inicial de 3 minutos a 9 minutos. Con PCR de arranque en caliente, la ADN polimerasa se añade una vez finalizada la etapa inicial de
desnaturalización exagerada. Esta modificación del protocolo evita la probable inactivación del

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Enzima ADN polimerasa. Consulte la sección Solución de problemas de este protocolo para obtener más información sobre la PCR de inicio en caliente y otros métodos
alternativos.
2. El siguiente paso es configurar el termociclador para que inicie la primera de 25 a 35 rondas de un ciclo de temperatura de tres pasos ( Tabla 2). Si bien aumentar el número de
ciclos por encima de 35 dará como resultado una mayor cantidad de productos de PCR, demasiadas rondas a menudo dan como resultado el enriquecimiento de productos
secundarios indeseables. Los tres pasos de temperatura en un solo ciclo cumplen tres tareas: el primer paso desnaturaliza la plantilla (y en ciclos posteriores, los amplicones
también), el segundo paso permite el apareamiento óptimo de los cebadores y el tercer paso permite que la ADN polimerasa se una a la plantilla de ADN y sintetizar el
producto de PCR. La duración y la temperatura de cada paso dentro de un ciclo pueden modificarse para optimizar la producción del amplicón deseado.

El tiempo para la etapa de desnaturalización se mantiene lo más breve posible. Por lo general, de 10 a 60 segundos es suficiente para la mayoría de las plantillas de ADN. El
tiempo y la temperatura de desnaturalización pueden variar según el contenido de GC del ADN molde, así como la velocidad de rampa, que es el tiempo que tarda el
termociclador en cambiar de una temperatura a la siguiente. La temperatura para este paso suele ser la misma que la utilizada para la fase de desnaturalización inicial (paso #
1 anterior; por ejemplo, 94 ° C).

Un paso de recocido de 30 segundos sigue dentro del ciclo a una temperatura establecida aproximadamente 5 ° C por debajo de la T aparente metro de los cebadores (idealmente entre 52 ° C y 58
° C).

El ciclo concluye con un paso de elongación. La temperatura depende de la ADN polimerasa seleccionada para el experimento. Por ejemplo,
Taq La ADN polimerasa tiene una temperatura de elongación óptima de 70 ° C a 80 ° C y requiere 1 minuto para alargar los primeros 2 kb, luego requiere un minuto extra por
cada 1 kb adicional amplificado. La ADN polimerasa de Pfu es otra enzima termoestable que tiene una temperatura de alargamiento óptima de 75 ° C. Se recomienda la Pfu DNA
Polymerase para su uso en PCR y reacciones de extensión de cebadores que requieren alta fidelidad y requieren 2 minutos por cada 1 kb para amplificarse. Consulte las
recomendaciones del fabricante para conocer las temperaturas de alargamiento exactas y el tiempo de alargamiento indicado para cada ADN polimerasa específica.

3. La fase final del ciclo térmico incorpora un período de alargamiento extendido de 5 minutos o más. Este último paso permite finalizar la síntesis de muchos
amplicones incompletos y, en el caso de Taq La ADN polimerasa permite la adición de un residuo de adenina a los extremos 3 'de todos los productos de la PCR.
Esta modificación está mediada por la actividad transferasa terminal de Taq ADN polimerasa y es útil para posteriores procedimientos de clonación molecular
que requieren un saliente 3 '.
4. La terminación de la reacción se logra enfriando la mezcla a 4 ° C y / o mediante la adición de EDTA a una concentración final de 10 mM.

7. Consideraciones importantes al solucionar problemas de PCR

Si las condiciones de PCR estándar no producen el amplicón deseado, es necesaria la optimización de la PCR para obtener mejores resultados. La rigurosidad de una reacción puede
modularse de modo que la especificidad se ajuste alterando las variables (por ejemplo, concentraciones de reactivo, condiciones de ciclo) que afectan el resultado del perfil de
amplicón. Por ejemplo, si la reacción no es lo suficientemente estricta, se generarán muchos amplicones falsos con longitudes variables. Si la reacción es demasiado rigurosa, no se
producirá ningún producto. La resolución de problemas de las reacciones de PCR puede ser una tarea frustrante en ocasiones. Sin embargo, un análisis cuidadoso y una buena
comprensión de los reactivos utilizados en un experimento de PCR pueden reducir la cantidad de tiempo y ensayos necesarios para obtener los resultados deseados. De todas las
consideraciones que afectan la rigurosidad de la PCR, la titulación de Mg 2+ y / o manipular las temperaturas de recocido probablemente resolverá la mayoría de los problemas. Sin
embargo, antes de cambiar nada, asegúrese de que un resultado erróneo no se deba a un error humano. Comience por confirmar que todos los reactivos se agregaron a una
reacción determinada y que los reactivos no estaban contaminados. También tome nota del resultado erróneo y haga las siguientes preguntas: ¿Son visibles los dímeros de
imprimación en el gel después de la electroforesis (estos se ejecutan como pequeñas bandas <100 b cerca de la parte inferior del carril)? ¿Hay productos no específicos (bandas que
migran a un tamaño diferente al producto deseado)? ¿Faltaba algún producto? ¿Está el ADN diana en un plásmido o en un extracto de ADN genómico? Además, es aconsejable
analizar el contenido de GC del amplicón deseado.

1. Primero determine si alguno de los reactivos de PCR es catastrófico para su reacción. Esto se puede lograr preparando nuevos reactivos (p. Ej., Stocks de trabajo
nuevos, nuevas diluciones) y luego agregando sistemáticamente un reactivo nuevo a la vez a las mezclas de reacción. Este proceso determinará qué reactivo
fue el culpable del fallido experimento de PCR. En el caso de ADN muy antiguo, que a menudo acumula inhibidores, se ha demostrado que la adición de
albúmina de suero bovino puede ayudar a aliviar el problema.
2. Los dímeros de cebadores pueden formarse cuando los cebadores se recogen preferentemente por sí solos o se aparean con el otro cebador en la reacción. Si esto ocurre,
aparecerá un pequeño producto de menos de 100 pb en el gel de agarosa. Empiece por alterar la proporción de plantilla a cebador; si la concentración del cebador es muy
superior a la concentración de la plantilla, es más probable que los cebadores se hibriden entre sí o entre sí sobre la plantilla de ADN. Agregar DMSO o usar un método de
ciclo térmico de arranque en caliente puede resolver el problema. Al final, puede que sea necesario diseñar nuevas imprimaciones.

3. Los productos no específicos se producen cuando la rigurosidad de la PCR es excesivamente baja, lo que da como resultado bandas de PCR inespecíficas con longitudes
variables. Esto produce un efecto de escalera sobre un gel de agarosa. Entonces es aconsejable elegir condiciones de PCR que aumenten el rigor. Un frotis de varios tamaños
también puede resultar de cebadores diseñados para secuencias altamente repetitivas cuando se amplifica el ADN genómico. Sin embargo, los mismos cebadores pueden
amplificar una secuencia diana en un plásmido sin encontrar el mismo problema.
4. Es probable que la falta de productos de PCR se deba a condiciones de reacción demasiado estrictas. Los dímeros de los cebadores y las estructuras de bucle en horquilla que se forman con los
cebadores o en el ADN molde desnaturalizado también pueden prevenir la amplificación de los productos de la PCR porque estas moléculas ya no pueden emparejarse con la contraparte de
ADN deseada.
5. Si no se ha analizado el contenido de GC, es hora de hacerlo. La PCR de regiones ricas en GC (contenido de GC> 60%) plantea algunos de los mayores
desafíos para la PCR. Sin embargo, hay muchos aditivos que se han utilizado para ayudar a aliviar los desafíos.

8. Manipulación de reactivos de PCR

Comprender la función de los reactivos utilizados en la PCR convencional es fundamental cuando se decide por primera vez cuál es la mejor manera de alterar las condiciones de reacción para
obtener el producto deseado. El éxito simplemente puede depender de cambiar la concentración de MgCl 2, KCl, dNTP, cebadores, plantilla de ADN o ADN polimerasa.
Sin embargo, la concentración incorrecta de tales reactivos puede conducir a resultados falsos, disminuyendo la rigurosidad de la reacción. Cuándo
Para solucionar problemas de PCR, solo se debe manipular un reactivo a la vez. Sin embargo, puede ser prudente valorar el reactivo manipulado.

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1. Sal de magnesio Mg 2+ ( concentración de reacción final de 0,5 a 5,0 mM)

Las ADN polimerasas termoestables requieren la presencia de magnesio para actuar como cofactor durante el proceso de reacción. Cambiar la concentración de
magnesio es uno de los reactivos más fáciles de manipular con quizás el mayor impacto en la rigurosidad de la PCR. En general, el rendimiento del producto de PCR
aumentará con la adición de mayores concentraciones de Mg. 2+. Sin embargo, el aumento de las concentraciones de Mg 2+ también va a
Disminuir la especificidad y fidelidad de la ADN polimerasa. La mayoría de los fabricantes incluyen una solución de cloruro de magnesio (MgCl 2) a lo largo de
con la ADN polimerasa y una solución tampón de PCR 10X. Las soluciones tampón de PCR 10 X pueden contener MgCl 15 mM 2, que es suficiente para una
reacción de PCR típica, o se puede agregar por separado a una concentración optimizada para una reacción en particular. Mg 2+ no se consume realmente en
la reacción, pero la reacción no puede continuar sin que esté presente. Cuando hay demasiado Mg 2+, puede prevenir la desnaturalización completa de la plantilla de ADN
estabilizando la cadena dúplex. Demasiado Mg 2+ también puede estabilizar el apareamiento espurio de cebadores a sitios de plantilla incorrectos y disminuir la especificidad
dando como resultado productos de PCR no deseados. Cuando no hay suficiente Mg 2+, la reacción no continuará, resultando en ningún producto de PCR.

2. Sal de potasio K + (concentración de reacción final de 35 a 100 mM)

Los productos de PCR más largos (de 10 a 40 kb) se benefician de la reducción de la sal de potasio (KCl) de su concentración de reacción normal de 50 mM, a menudo junto
con la adición de DMSO y / o glicerol. Si el amplicón deseado está por debajo de 1000 pb y se forman productos largos no específicos, la especificidad puede mejorarse
titulando KCl, aumentando la concentración en incrementos de 10 mM hasta 100 mM. El aumento de la concentración de sal permite que las moléculas de ADN más cortas
se desnaturalicen preferentemente en moléculas de ADN más largas.
3. Deoxinucleótidos 5'-trifosfatos (concentración de reacción final de 20 y 200 μM cada uno)

Los desoxinucleótidos 5'-trifosfatos (dNTP) pueden causar problemas para la PCR si no se encuentran en las concentraciones equivalentes adecuadas (es decir, [A] = [T] = [C] =
[G]) y / o debido a su inestabilidad por repetición congelación y descongelación. La concentración habitual de dNTP es 50 μM de CADA UNO de los cuatro dNTP. Sin embargo, la
PCR puede tolerar concentraciones entre 20 y 200 μM cada una. Las concentraciones más bajas de dNTP pueden aumentar tanto la especificidad como la fidelidad de la
reacción, mientras que las concentraciones excesivas de dNTP pueden inhibir la PCR. Sin embargo, para fragmentos de PCR más largos, puede ser necesaria una concentración
de dNTP más alta. Un gran cambio en la concentración de dNTP puede requerir un cambio correspondiente en la concentración de Mg 2+.

4. ADN polimerasas térmicamente estables

Las enzimas de PCR y los tampones asociados con esas enzimas han recorrido un largo camino desde la Taq Primero se empleó la ADN polimerasa. Por tanto, la
elección de una enzima adecuada puede resultar útil para obtener los productos amplicón deseados. Por ejemplo, el uso de Taq Puede preferirse la ADN
polimerasa sobre la ADN polimerasa Pfu si se desea la procesividad y / o la adición de un residuo de adenina a los extremos 3 'del producto de PCR. La adición de
una adenina 3 'se ha convertido en una estrategia útil para clonar productos de PCR en vectores TA con proyecciones de timina 3'. Sin embargo, si la fidelidad es
más importante, una enzima como Pfu puede ser una mejor opción. Varios fabricantes tienen una serie de ADN polimerasas específicas diseñadas para
necesidades especializadas. Observe las condiciones de reacción y las características del amplicón deseado y luego haga coincidir el experimento de PCR con la
ADN polimerasa adecuada. La mayoría de los fabricantes tienen tablas que ayudan a la selección de la ADN polimerasa al enumerar características como fidelidad,
rendimiento, velocidad, longitudes óptimas de diana y si es útil para amplificación rica en GC o PCR de inicio en caliente.
5.

La calidad y pureza del ADN tendrá un efecto sustancial en la probabilidad de éxito de un experimento de PCR. Las concentraciones de ADN y ARN pueden ser
determinado utilizando sus medidas de densidad óptica a 260 nm (OD 260). La masa de ácidos nucleicos purificados en solución se calcula en 50 μg /
ml de ADN bicatenario o 40 μg / ml para ARN o ADN monocatenario en una DO 260 = 1.0. Los contaminantes de la extracción de ADN son inhibidores comunes en la
PCR y deben evitarse con cuidado. Los inhibidores comunes de la extracción de ADN de la PCR incluyen proteínas, ARN, disolventes orgánicos y
detergentes. Utilizando la máxima absorción de ácidos nucleicos OD 260 comparado con el de las proteínas OD280 (OD 260/280), es posible determinar
una estimación de la pureza del ADN extraído. Idealmente, la relación de OD 260/280 está entre 1.8 y 2.0. OD inferior 260/280 es indicativo de contaminación por
proteínas y / o disolventes que, con toda probabilidad, será problemático para la PCR.

Además de la calidad del ADN molde, la optimización de la cantidad de ADN puede beneficiar enormemente el resultado de un experimento de PCR. Aunque es
conveniente determinar la cantidad en ng / μl, que a menudo es el resultado de los nanoespectrofotómetros modernos, la unidad relevante para un experimento
de PCR exitoso es el número de moléculas. Es decir, ¿cuántas copias de la plantilla de ADN contienen una secuencia complementaria a los cebadores de PCR? Las
moléculas diana óptimas están entre 10 4 a 10 7 moléculas y se puede calcular como se describe en las notas anteriores.

9. Reactivos aditivos

Los reactivos aditivos pueden producir resultados cuando todo lo demás falla. Comprender los reactivos y para qué se utilizan es fundamental para determinar
qué reactivos pueden ser más efectivos en la adquisición del producto de PCR deseado. La adición de reactivos a la reacción se complica por el hecho de que la
manipulación de un reactivo puede afectar la concentración utilizable de otro reactivo. Además de los reactivos que se enumeran a continuación, muchas
empresas de biotecnología ofrecen aditivos patentados comercialmente disponibles.

10. Aditivos que benefician a las plantillas enriquecidas de GC

1. Dimetilsulfóxido (concentración de reacción final de 1 a 10% de DMSO)

En experimentos de PCR en los que el ADN de la plantilla es particularmente rico en GC (contenido de GC> 60%), la adición de DMSO puede mejorar la reacción.
interrumpiendo el emparejamiento de bases y reduciendo eficazmente el T metro. Algunos T metro Las calculadoras incluyen una entrada variable para agregar la concentración
de DMSO deseada en el experimento de PCR. Sin embargo, agregar más del 2% de DMSO puede requerir agregar más ADN polimerasa como se ha hecho
demostrado inhibir Taq ADN polimerasa.
2. Formamida (concentración de reacción final del 1,25 al 10%)

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Al igual que DMSO, la formamida también interrumpe el emparejamiento de bases al tiempo que aumenta la rigurosidad del apareamiento del cebador, lo que da como resultado un
cebado menos no específico y una mayor eficiencia de amplificación. También se ha demostrado que la formamida es un potenciador de las plantillas ricas en GC.
3. 7-deaza-2'-desoxiguanosina 5'-trifosfato (concentración de reacción final de dc 7 GTP; 3 dc 7 GTP: 1 dGTP 50 μM)

Usando 3 partes, o 37,5 μM, del análogo de base de guanosina dc 7 GTP junto con 1 parte, o 12,5 μM, dGTP desestabilizará la formación de estructuras
secundarias en el producto. A medida que se desnaturaliza el amplicón o el ADN molde, a menudo formará estructuras secundarias como lazos en forma de
horquilla. Incorporación de dc 7 GTP en el amplicón de ADN prohibirá la formación de estas estructuras aberrantes.

Nota:

corriente continua 7 GTP atenúa la señal de tinción con bromuro de etidio, por lo que se usa en una proporción de 3: 1 con dGTP.

4. Betaína (concentración de reacción final de 0,5 M a 2,5 M)

La betaína (N, N, N-trimetilglicina) es un análogo de aminoácido bipolar que reduce e incluso puede eliminar la dependencia de la temperatura de fusión del ADN de la
composición de nucleótidos. Se utiliza como aditivo para ayudar a la amplificación por PCR de dianas ricas en GC. La betaína se emplea a menudo en combinación con DMSO
y puede mejorar en gran medida las posibilidades de amplificar el ADN diana con un alto contenido de GC.

11. Aditivos que ayudan a la PCR en presencia de inhibidores

1. Los detergentes no iónicos funcionan para suprimir la formación de estructuras secundarias y ayudar a estabilizar la ADN polimerasa. Se pueden usar detergentes
no iónicos como Triton X-100, Tween 20 o NP-40 en concentraciones de reacción de 0,1 a 1% para aumentar la producción de amplicones. Sin embargo,
concentraciones superiores al 1% pueden inhibir la PCR. La presencia de detergentes no iónicos disminuye la rigurosidad de la PCR, lo que puede conducir a la
formación de productos falsos. Sin embargo, su uso también neutralizará los efectos inhibidores del SDS, un contaminante ocasional de los protocolos de
extracción de ADN.
2. La adición de proteínas específicas como la albúmina de suero bovino (BSA) utilizada a 400 ng / μl y / o la proteína del gen T4 32 a 150 ng / μl ayuda a la PCR en
la presencia de inhibidores como FeCl 3, hemina, ácido fúlvico, ácido húmico, ácidos tánicos o extractos de heces, agua dulce y agua marina. Sin embargo,
algunos inhibidores de la PCR, incluidas las sales biliares, bilirrubina, EDTA, NaCl, SDS o Triton X-100, no se alivian con la adición de BSA o
Proteína del gen 32 de T4.

12. Modificaciones a las condiciones de ciclismo

1. La optimización de la temperatura de hibridación mejorará cualquier reacción de PCR y debe considerarse en combinación con otros aditivos y / o
junto con otras modificaciones de las condiciones de los ciclos. Por tanto, para calcular la temperatura óptima de recocido se emplea la siguiente
ecuación:

Primer + 0,7 T metro Producto - 14,9

T OPTAR
a = 0,3 T metro

T metro
Cebador se calcula como el T metro del par menos estable usando la ecuación:

T metro
Cebador = ((ΔH / (ΔS + R x ln (c / 4))) - 273.15 + 16.6 log [K +] Donde ΔH es la suma de los cambios de entalpía del vecino más cercano para los híbridos; ΔS es
la suma de los cambios de entropía del vecino más cercano; R es la constante de gas (1,99 cal K-1 mol-1); C es la concentración de cebador; y [K +] es la
concentración de potasio.

La última ecuación se puede calcular utilizando uno de los T metro calculadoras enumeradas en el siguiente sitio web:

http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/melting/sup_mat/servers_list.html

T metro
Producto se calcula de la siguiente manera:

T metro
Producto = 0,41 (% GC) + 16,6 log [K +] - 675 / longitud del producto

Para la mayoría de las reacciones de PCR, la concentración de potasio ([K +]) será de 50 mM.
2. La PCR de inicio en caliente es una modificación versátil en la que el tiempo de desnaturalización inicial aumenta drásticamente ( Tabla 4). Esta modificación puede incorporarse
con o sin otras modificaciones a las condiciones de ciclismo. Además, a menudo se usa junto con aditivos para la formación de amplicones temperamentales. De hecho, la PCR
de inicio en caliente se incluye cada vez más como un aspecto regular de las condiciones generales de los ciclos. Se ha demostrado que el arranque en caliente aumenta la
producción de amplicones, al tiempo que aumenta la especificidad y fidelidad de la reacción. El fundamento del inicio en caliente
La PCR es para eliminar el dímero del cebador y el cebado no específico que puede resultar como consecuencia de establecer la reacción por debajo de la T metro. Por lo tanto, un
La reacción típica de arranque en caliente calienta la muestra a una temperatura por encima de la T óptima. metro, al menos a 60 ° C antes de que pueda producirse cualquier
amplificación. En general, la ADN polimerasa se retiene de la reacción durante el tiempo de desnaturalización inicial alargado. Aunque otros componentes de
la reacción a veces se omite en lugar de la ADN polimerasa, aquí nos centraremos en la ADN polimerasa. Existen varios métodos que permiten que la ADN
polimerasa permanezca inactiva o separada físicamente hasta que se complete el período de desnaturalización inicial, incluido el uso de una barrera de cera sólida,
anticuerpos anti-ADN polimerasa y proteínas accesorias. Alternativamente, la ADN polimerasa puede simplemente añadirse a la reacción después de que se
complete el ciclo de desnaturalización inicial.
3. Touchdown PCR (TD-PCR) está destinado a eliminar algunas de las conjeturas de la T metro limitaciones de cálculo poniendo entre corchetes las temperaturas de
recocido calculadas. El concepto es diseñar dos fases de condiciones de ciclismo ( Cuadro 5). La primera fase emplea sucesivamente menores
temperaturas de recocido cada segundo ciclo (tradicionalmente 1.0 ° C), comenzando a 10 ° C arriba y terminando en la T calculada metro o ligeramente por debajo. La fase dos
utiliza las condiciones estándar de 3 pasos con la temperatura de recocido establecida en 5 ° C por debajo de la T calculada metro por otros 20 a 25

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ciclos. La función de la primera fase debería aliviar la mala imprimación, otorgando una ventaja de 4 veces al producto correcto. Por lo tanto, después de 10 ciclos,
una ventaja de 410 veces produciría 4096 copias del producto correcto sobre cualquier imprimación falsa.
• Stepdown PCR es similar a TD-PCR con menos incrementos en la primera fase de cebado. Como ejemplo, la primera fase baja
temperaturas de recocido cada segundo ciclo en 3 ° C, comenzando a 10 ° C por encima y terminando a 2 ° C por debajo de la T calculada metro. Como TD-
PCR, la fase dos utiliza las condiciones estándar de 3 pasos con la temperatura de recocido establecida en 5 ° C por debajo de la T calculada metro durante otros 20 a 25
ciclos. Esto permitiría que el producto correcto tuviera una ventaja de 256 veces sobre los productos de imprimación falsa.
• Slowdown PCR es simplemente una modificación de TD-PCR y ha tenido éxito para amplificar secuencias extremadamente ricas en GC (por encima del 83%) ( Tabla 6). El
concepto tiene en cuenta una característica relativamente nueva asociada con los termocicladores modernos, que permite el ajuste de la velocidad de la rampa, así
como la tasa de enfriamiento. El protocolo también utiliza dc 7 GTP para reducir la formación de estructuras de 2 ° que podrían inhibir la reacción. La velocidad de la
rampa se reduce a 2,5 ° C s- 1 con una velocidad de enfriamiento de 1,5 ° C s- 1 para los ciclos de recocido. La primera fase comienza con una temperatura de recocido de
70 ° C y reduce la temperatura de recocido en 1 ° C cada 3 rondas hasta que alcanza los 58 ° C. La segunda fase continúa luego con una temperatura de recocido de 58 °
C durante 15 ciclos adicionales.

4. La PCR anidada es una herramienta poderosa que se utiliza para eliminar productos falsos. El uso de cebadores anidados es particularmente útil cuando hay varios genes
parálogos en un solo genoma o cuando hay un número bajo de copias de una secuencia diana dentro de una población heterogénea de secuencias ortólogas. El procedimiento
básico implica dos conjuntos de cebadores que amplifican una sola región de ADN. Los cebadores externos se encuentran a caballo entre el segmento de interés y se utilizan
para generar productos de PCR que a menudo son inespecíficos en 20 a 30 ciclos. A continuación, se utiliza una pequeña alícuota, normalmente de unos 5 μl de los primeros 50
μl de reacción, como plantilla de ADN para otras 20 a 30 rondas de amplificación utilizando el segundo conjunto de cebadores que se hibridan en una ubicación interna en
relación con el primer conjunto.

Otros protocolos de PCR son más especializados y van más allá del alcance de este artículo. Los ejemplos incluyen RACE-PCR, Multiplex-PCR,
Vectorette-PCR, Quantitative-PCR y RT-PCR.

13. Resultados representativos

Se generaron resultados de PCR representativos siguiendo los protocolos básicos de PCR descritos anteriormente. Los resultados incorporan varias
estrategias de resolución de problemas para demostrar el efecto de varios reactivos y condiciones en la reacción. Genes de la levadura en ciernes
Saccharomyces cerevisiae y de un micobacteriófago no caracterizado se amplificaron en estos experimentos. Se empleó el protocolo estándar de PCR
de 3 pasos descrito en la Tabla 2 para los tres experimentos descritos a continuación.

Antes de configurar el experimento de PCR, el ADN genómico de ambos S. cerevisiae y el Mycobacteriophage fueron cuantificados y diluidos a una concentración que permitiría
entre 10 4 y 10 7 moléculas de ADN por reacción. Las existencias de trabajo se prepararon de la siguiente manera. Una preparación de ADN de levadura genómica produjo 10 4 ng / μl.
Se generó una dilución de 10 ng / μl añadiendo 48 μl en 452 μl de tampón TE pH 8.0. Desde el S. cerevisiae el genoma es de aproximadamente 12,5 Mb, 10 ng contienen 7,41 X 10 5 moléculas.
La preparación de ADN de micobacteriófagos genómicos produjo 313 ng / μl. Se generó una dilución de 2 ng / μl añadiendo 6,4 μl en 993,6 μl de tampón TE pH 8,0. Este ADN de
fago tiene aproximadamente 67 Kb. Por tanto, 1 ng contiene 2,73 X 10 7 moléculas, que se encuentra en el límite superior del ADN generalmente utilizado para una PCR. Las
existencias de trabajo se utilizaron luego para generar las soluciones Master Mix descritas en Cuadro 7. Los experimentos variaron las condiciones del ciclo como se describe a
continuación.

En Figura 3a, ADN genómico de S. cerevisiae se utilizó como plantilla para amplificar el gen GAL3, que codifica una proteína implicada en la galactosa
metabolismo. El objetivo de este experimento fue determinar el Mg óptimo 2+ concentración para este conjunto de reactivos. Sin MgCl 2 estaba presente en el tampón
de PCR original y tuvo que suplementarse a las concentraciones indicadas con un rango probado de 0,0 mM a 5,0 mM. Como se muestra en la
En la figura, aparece un producto de PCR del tamaño esperado (2098 pb) a partir de un Mg 2+ concentración de 2,5 mM (carril 6) con una concentración óptima a 4,0
mM (carril 9). La concentración recomendada proporcionada por el fabricante fue de 1,5 mM, que es la cantidad proporcionada en tampones de PCR típicos. Quizás
sorprendentemente, la concentración necesaria para la formación del producto en este experimento excedió esta cantidad.

Se utilizó una plantilla de ADN diferente para el experimento presentado en Figura 3b. Se utilizó ADN genómico de un micobacteriófago para amplificar un
segmento de ADN conservado de 566 pb. Como en el experimento anterior, el Mg óptimo 2+ había que determinar la concentración. Como se muestra en Figura 3b, la
amplificación del producto de PCR deseado requiere al menos 2,0 mM de Mg 2+ ( carril 5). Si bien hubo más variabilidad en la cantidad de producto
formado a concentraciones crecientes de MgCl 2, la mayor parte del producto de PCR se observó a 4 mM de Mg 2+ ( carril 9), la misma concentración observada para el
gen de levadura GAL3.

Nótese que en los experimentos presentados en Figuras 3A y 3B, se obtuvo una banda discreta utilizando las condiciones de ciclo que se cree que son óptimas en función de las
temperaturas de recocido del cebador. Específicamente, la temperatura de desnaturalización fue de 95 ° C con una temperatura de recocido de 61 ° C, y
la extensión se llevó a cabo durante 1 minuto a 72 ° C durante 30 ciclos. A continuación, se realizó la extensión final de 5 minutos a 72ºC. Para el tercer experimento
presentado en Figura 3c, Se realizaron tres cambios en las condiciones de ciclo utilizadas para amplificar el gen de levadura GAL3. Primero, la temperatura de
recocido se redujo a una temperatura subóptima de 58 ° C. En segundo lugar, el tiempo de extensión se amplió a 1 minuto y 30 segundos. En tercer lugar, el número
de ciclos se incrementó de 30 a 35 veces. El propósito era demostrar los efectos de las condiciones de amplificación subóptimas (es decir, reducir la rigurosidad de la
reacción) en un experimento de PCR. Como se muestra en Figura 3c, ¿Qué era una banda discreta en Figura 3a, se convierte en una mancha de productos no
específicos en estas condiciones de ciclo subóptimas. Además, con la rigurosidad general de la reacción reducida, una cantidad menor de Mg 2+ se requiere para
formar un amplicón.

Los tres experimentos ilustran que cuando Mg 2+ las concentraciones son demasiado bajas, no hay producción de amplicones. Estos resultados también demuestran que
cuando ambas condiciones de ciclo están diseñadas correctamente y los reactivos están en concentraciones óptimas, el experimento de PCR produce un amplicón
discreto correspondiente al tamaño esperado. Los resultados muestran la importancia de realizar experimentos de PCR con un rigor suficientemente alto (por ejemplo,
bandas discretas frente a un frotis). Además, los experimentos indican que cambiar un parámetro puede influir en otro parámetro, afectando así el resultado de la
reacción.

Reactivo Concentración de stock Volumen 13X ** Concentración final

soluciones

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Mezcla maestra

Estéril H 2 O QS hasta 50 μl QS hasta 650 μl

Tampón de PCR 10 veces 5 μl 65 μl 1X

dNTP's 10 mM 1 μl 13 μl 200 μM
MgCl 2 25 mM 3 μl 39 μl 1,5 mM

Imprimación hacia adelante 20 μM = 20 pmol / μl 1 μl 13 μl 20 pmol

Imprimación inversa 20 μM = 20 pmol / μl 1 μl 13 μl 20 pmol

Plantilla de ADN Variable Variable Variable ~ 10 5 Moléculas

Taq ADN polimerasa 5 Unidades / μl * 0,5 μl 6,5 μl 2.5 Unidades

50 μl / Reacción

Tabla 1. Reactivos de PCR en el orden en que deben agregarse.

* Las unidades pueden variar entre fabricantes

* * Agregue todos los reactivos a la mezcla maestra, excepto los que necesiten titulación o que puedan variar en función de la reacción. La mezcla maestra que se muestra en la tabla anterior se
calcula para 11 reacciones más 2 reacciones adicionales para adaptarse a la pérdida de transferencia de la pipeta, lo que garantiza que haya suficiente alícuota para cada tubo de reacción.

Temperatura de ciclo de PCR

Paso de ciclo estándar de 3 pasos Tiempo Número de ciclos

Desnaturalización inicial 94 ° C hasta 98 ° C 1 minuto 1
Desnaturalización 94 ° C 10 a 60 segundos 30 25-35

Recocido 5 ° C por debajo de T metro segundos

Extensión 70 ° C hasta 80 ° C Dependiente de amplicón y ADN

polimerasa

Extensión final 70 ° C hasta 80 ° C 5 minutos 1

Sostener* 4°C ∞ 1

Tabla 2. Ciclos de PCR estándar de 3 pasos.

* La mayoría de los termocicladores tienen la capacidad de hacer una pausa a 4 ° C indefinidamente al final de los ciclos.

Ciclos de PCR de 2 pasos

Paso de ciclo La temperatura Tiempo Número de ciclos

Desnaturalización inicial 94 ° C hasta 98 ° C 1 minuto 1
Desnaturalización 94 ° C 10 a 60 segundos 25-35

Recocido / Extensión 70 ° C hasta 80 ° C Dependiente de amplicón y ADN

polimerasa

Extensión final 70 ° C hasta 80 ° C 5 minutos 1

Tabla 3. Ciclos de PCR de 2 pasos.

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Temperatura de ciclo de PCR de

Paso de ciclo arranque en caliente Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial 60 ° C hasta 95 ° C 5 minutos y luego agregue la 1
ADN polimerasa

Desnaturalización 94 ° C 10 a 60 segundos 30 25-35

Recocido 5 ° C por debajo de T metro segundos

Extensión 70 ° C hasta 80 ° C Dependiente de amplicón y ADN

polimerasa

Extensión final 70 ° C hasta 80 ° C 5 minutos 1

Cuadro 4. Ciclos de PCR de inicio en caliente.

Ciclos de PCR de touchdown

Paso de ciclo La temperatura Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial 94 ° C hasta 98 ° C 1 minuto 1
Desnaturalización 94 ° C 10 a 60 segundos 30 2

Recocido X = 10 ° C por encima de T metro segundos

Extensión 70 ° C hasta 80 ° C Dependiente de amplicón y ADN

polimerasa

Desnaturalización 94 ° C 10 a 60 segundos 30 28

Recocido X-1 ° C reduce 1 ° C cada dos segundos

ciclos
Amplicón y polimerasa
70 ° C hasta 80 ° C dependiente
Extensión
Desnaturalización 94 ° C 10 a 60 segundos 30 20-25

Recocido 5 ° C por debajo de T metro segundos

Extensión 70 ° C hasta 80 ° C Dependiente de amplicón y ADN

polimerasa

Extensión final 70 ° C hasta 80 ° C 5 minutos 1

Cuadro 5. Ciclos de PCR de contacto.

Ciclos de PCR de desaceleración

Paso de ciclo La temperatura Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial 94 ° C hasta 98 ° C 1 minuto 1
Desnaturalización 94 ° C 10 a 60 segundos 30 2

Recocido X ° C = 10 ° C por encima de T metro segundos

Extensión 70 ° C hasta 80 ° C Amplicón y polimerasa

dependiente

Desnaturalización 94 ° C 10 a 60 segundos 30 28

Recocido X-1 ° C reduce 1 ° C cada dos segundos

ciclos

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70 ° C hasta 80 ° C * Amplicón y polimerasa

Extensión dependiente

Desnaturalización 94 ° C 10 a 60 segundos 30 20-25

Recocido 5 ° C por debajo de T metro segundos

Extensión 70 ° C hasta 80 ° C Amplicón y polimerasa

dependiente

Extensión final 70 ° C hasta 80 ° C 5 minutos 1

Cuadro 6. Ciclos de PCR de desaceleración.

* Para PCR de ralentización, la velocidad de rampa se reduce a 2,5 ° C s- 1 con una velocidad de enfriamiento de 1,5 ° C s- 1 para los ciclos de recocido.

Solución de reserva Volumen agregado a 50 13 X Maestro de levadura 13 X Maestro de fagos Concentración final
μl de reacción Mezcla Mezcla

Estéril H 2 O qs a 50 μl = 31 μl o qs hasta 650 μl = 396,5 qs hasta 520 μl = 403 μl

30,5
Tampón de PCR 10 veces 5 μl 65 μl 65 μl 1X
dNTP's 10 mM 1 μl 13 μl 13 μl 200 μM
MgCl 2 Valoración Agregado a cada Agregado a cada Agregado a cada Ver titulación variable
reacción reacción reacción

Imprimación hacia adelante 20 μM = 20 pmol / μl 1 μl 13 μl 13 μl 20 pmol

Imprimación inversa 20 μM = 20 pmol / μl 1 μl 13 μl 13 μl 20 pmol

Plantilla de ADN 2 ng / μl de fago o 10 ng / 0,5 μl de fago o 1 μl de 6,5 μl 13 μl ~ 10 7 Moléculas Fago

μl de levadura levadura
o ~ 10 5 Moléculas
Levadura

Polimerasa 0,5 unidades / μl ** 0,5 μl 6,5 μl 6,5 μl 0.5 Unidades / Reacción

40 μl + 10 (valoración) μl /
reacción

VALORACIÓN

[MgCl 2] 0,00 mM 0,5 mM 1,0 mM 1,5 mM 2,0 mM 2,5 mM 3,0 mM 3,5 mM 4,0 mM 4,5 mM 5,0 mM

MgCl 2 0,00 μl 1,00 μl 2,00 μl 3,0 μl 4,00 μl 5,00 μl 6,00 μl 7,00 μl 8,00 μl 9,00 μl 10,00 μl

H2 O 10,00 μl 9,00 μl 8,00 μl 7,00 μl 6,00 μl 5,00 μl 4,00 μl 3,00 μl 2,00 μl 1,00 μl 0,00 μl

Cuadro 7. Titulación de Mg 2+ utilizado en Figura 3.

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Figura 1. Problemas comunes que surgen con los cebadores y la amplificación por PCR de 3 pasos del ADN diana. (a) Auto-recocido de imprimaciones que da como resultado la
formación de una estructura de bucle de horquilla secundaria. Tenga en cuenta que los cebadores no siempre se templan en los extremos y pueden formar estructuras de bucle más
pequeñas. (b) El cebador se hibrida entre sí, en lugar de la plantilla de ADN, creando dímeros de cebador. Una vez que las imprimaciones se templan entre sí, se alargarán hasta los
extremos de la imprimación. (c) Ciclos de PCR que generan un amplicón específico. El ciclo de PCR estándar de 3 pasos incluye la desnaturalización del ADN molde, la hibridación de
los cebadores y la extensión del ADN diana (amplicón) por la ADN polimerasa.

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Figura 2. Cubo de hielo con reactivos, pipetas y gradillas necesarios para una PCR. (1.) pipeta P-200, (2.) pipeta P-1000, (3.) pipeta P-20, (4.) P-10
pipeta, (5.) placa de 96 pocillos y tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml, (6.) Reactivos que incluyen Taq polimerasa, tampón de PCR 10X, MgCl 2, agua esterilizada, dNTP,
cebadores y plantilla de ADN, (7.) tubos de 1,8 ml y gradilla.

Figura 3. Ejemplo de un Mg 2+ titulaciones utilizadas para optimizar un experimento de PCR utilizando un protocolo estándar de PCR de 3 pasos. (a) S. cerevisiae Se utilizó
ADN genómico de levadura como molde para amplificar un gen GAL3 de 2098 pb. En los carriles 1-6, donde el Mg 2+ la concentración es demasiado baja, no se forma
ningún producto (carriles 1-5) o se forma muy poco producto (carril 6). Los carriles 7 a 11 representan concentraciones óptimas de Mg 2+ para este experimento de PCR
como lo indica la presencia del producto amplicón de 2098 pb. (b) Se usó un molde de ADN genómico de micobacteriófago no caracterizado para amplificar un
amplicón de 566 pb. Carriles 1 - 4, el Mg 2+ la concentración es demasiado baja, como lo indica la ausencia de producto. Los carriles 5-11 representan concentraciones
óptimas de Mg 2+ para esta PCR como lo indica la presencia del producto amplicón de 566 kb. (C) . S. cerevisiae Se usó ADN genómico de levadura como molde para
amplificar un gen GAL3 de 2098 pb como se indica en el panel a. Sin embargo, la temperatura de hibridación se redujo de 61 ° C a 58 ° C, lo que resultó en bandas de
PCR no específicas con longitudes variables que producían un efecto de mancha en el gel de agarosa. Carriles 1-4, donde el Mg 2+

la concentración es demasiado baja, no se forma producto. Los carriles 5-8 representan concentraciones óptimas de Mg 2+ para esta PCR como se ve por la presencia
de un frotis y una banda alrededor del tamaño del producto del amplicón de 2098 kb. Los carriles 9-11 son indicativos de condiciones excesivamente estrictas sin
formación de producto. (ac) Lanes 12 es un control negativo que no contenía ADN molde. El carril M (marcador) se cargó con NEB 1 kb Ladder.

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Figura 4. Tubos estériles utilizados para PCR. (1.) Tubo de 1,8 ml (2.) Tubo de PCR individual de pared delgada de 0,2 ml, (3.) Tubos de PCR de pared delgada en tiras de 0,2 ml y tapas.

Figura 5. Ciclador térmico. Imagen izquierda del termociclador cerrado. La imagen de la derecha contiene tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml colocados en el bloque calefactor de un
termociclador abierto.

Discusión

La PCR se ha convertido en una herramienta indispensable en el arsenal de las ciencias biológicas. La PCR ha alterado el curso de la ciencia permitiendo a los biólogos ceder poder
sobre los genomas y crear genes híbridos con funciones novedosas, permitiendo pruebas clínicas específicas y precisas, obteniendo conocimientos sobre los genomas y la
diversidad, así como simplemente clonando genes para análisis bioquímicos adicionales. La aplicación de la PCR está limitada únicamente por la imaginación del científico que ejerce
su poder. Hay muchos libros y artículos que describen nuevos usos especializados de la PCR, y se desarrollarán muchos más en los próximos años.

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generación de ciencia biológica. Sin embargo, independientemente de los enfoques previstos, el marco fundamental sigue siendo el mismo. PCR, en toda su
grandeza, es un in vitro aplicación para generar grandes cantidades de un segmento específico de ADN.

Diseñar un experimento de PCR requiere pensamiento y paciencia. Los resultados que se muestran en la Figura 3 ejemplifican uno de los principales desafíos al
diseñar una estrategia de optimización para PCR. Es decir, a medida que se cambia un parámetro de la PCR, puede afectar a otro. Por ejemplo, si la PCR inicial se
llevó a cabo a una temperatura de recocido subóptima (58 ° C) con un Mg óptimo 2+ concentración de 2,0 mM, entonces el resultado produciría un frotis como se ve
en la Figura 3c. Un intento de resolver el frotis podría implicar el establecimiento de condiciones de PCR con reacciones que contienen 2,0
mM MgCl 2 y ajustar la temperatura de recocido a 61 ° C. Sin embargo, como se ve en la Figura 3a, esto no produciría ningún producto. En consecuencia, es
aconsejable valorar los reactivos, en lugar de agregar una concentración a una sola reacción, al solucionar problemas de resultados falsos. También el
Los ajustes más comunes que se requieren para optimizar un experimento de PCR son cambiar el Mg 2+ concentración y corregir las temperaturas de recocido. Sin
embargo, si estos cambios no minimizan o anulan los resultados aberrantes, la titulación de los aditivos y / o el cambio de los protocolos de condición de ciclo como se
describe en las Tablas 2-6 pueden aliviar el problema. Si todo lo demás falla, rediseñe los cebadores e intente, vuelva a intentarlo.

Divulgaciones

No tengo nada que revelar.

Agradecimientos

Un agradecimiento especial a Kris Reddi de UCLA por preparar los reactivos y verter geles ya Erin Sanders de UCLA por su inspiración, orientación, apoyo y corrección del manuscrito.
También me gustaría agradecer a Giancarlo Costaguta y Gregory S. Payne por proporcionar el ADN genómico de levadura y los cebadores para amplificar el gen GAL3. También me
gustaría agradecer a Bhairav Shah por tomar fotografías del equipo de laboratorio y los reactivos utilizados para hacer las figuras 2 - 4. La financiación para este proyecto fue
proporcionada por el HHMI (subvención HHMI No. 52006944).

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