temario

0 Plasmidios 0 Detección  de  

0 Tipos  de  vectores transformantes.
0 Preparación  de  un  
fragmento  de  ADN  para   0 Expresión  génica
clonar
0 Enzimas  de  restricción
0 Amplificación  por  PCR
0 Preparación  de  un  cDNA
0 Incorporación  de  DNA  
foráneo
0 Preparación  de  células  
competentes
Generalidades:  Que  son  los  
plásmidos
0 Son  elementos  extra-­‐‑ 0 Son  dependientes  en  mayor  
cromosomales  que  van   o  menor  extensión  de  
desde  1  kb  a  200  kb. elementos  del  huésped  
0 La  mayoría  son  de  doble   (enzimas  y  proteínas  para  la  
hebra. transcripción).  
0 Poseen  elementos  que  le   0 Poseen  elementos  que  le  
permite  su  replicación   permiten  mantenerse  de  
independiente  (repABC   manera  estable  en  la  células  
Cassette)   huésped  y  ser  heredados  en  
0 Pueden  ser  de  amplio   células  hijas.
espectro-­‐‑de  huésped  o  
restringido.
 Generalidades:  Que  son  los  
plásmidos
0 Plasmidios
0 Relicación
0 Theta:  primer  de  ARN  (Uni  o  
Bidireccional)
0 Círculo  rodante:  Nick  en  el  ADN  que  
funciona  como  primer
0 en  la  mayoría  son  ventajosos  para  
la  bacteria.
Diversidad
Producen  compuestos  orgánicos
Antibióticos
etc,.
 plásmidos
0 Cuando  dos  o  mas  plásmidos  comparten  elementos  de  la  misma  
maquinaria  de  replicación.
0 Ambos  plásmidos  competirán  durante  la  replicación  y  en  la  etapa  
de  partición  dentro  de  las  células  hijas.
0 ESTOS  PLASMIDIOS  NO  PUEDEN  COEXISTIR  JUNTOS  
0 Incompatibilidad

Si  
De  distinto  grupo  de  Incop.
coexisten  

Si  No  
coexisten   Mismo    grupo  de  Incop.
 Estabilidad  

0 Mantención  estable  en  diferentes  géneros  de  bacteria.

0 Control  de  la  replicación  vs tasa  de  crecimiento  del  huésped.

0 Bacterias  tiempo  de  crecimiento  en  medio  de  cultivo:  

0 Existe  un  acoplamiento  de  la  replicación  del  plasmidio  

en  la  etapa  inicial  (control  de  la  iniciación)
0 Luego  un  desacople.
 Replicación

Figure  7-­2Plasmid  DNA  replication

The parental strands are shown in blue, and newly synthesized daughter strands
are shown in red. The short segments represent the A·T and G·C base pairs
connecting the complementary strands. Once DNAreplication is initiated at the
origin (ORI), it continues in both directions around the circular molecule until
the advancing growing forks merge and two daughter molecules are produced.
The origin is the only specific nucleotide sequence required for replication of the
entire circular DNA molecule.
 Otras  características
0 Sitio  de  múltiple  clonamiento
Scanning electron micrograph
0 Marcador  de  selección

0 Amplio  rango  de  huésped

0 Restringido  rango  de  huésped

Agarose gel
 Vector
0 Es  un  agente  que  puede  llevar  un  fragmento  de  ADN  en  una  
células  huésped.

0 Si  es  usado  para  la  reproducción  de  fragmentos  de  ADN  es  
llamado  "cloning  vector".

0 Si  es  usado  para  expresar  ciertos  genes  es  llamado  Vector  

de  expresión.

0 Vectores  mas  comunes:  incluyen  los  plasmidios  Lambda  

phage,  cosmid and  yeast  artificial  chromosome  (YAC).  
 Que  elemntos hay  

Promotor  
Site

Origin  of  
Replication

Antibiotic  
Resistance   Multiple  
Gene Cloning  
Site
0 typical  plasmid  vector. It  contains  a  polylinker  which  can  recognize  several  different  
restriction  enzymes,  an  ampicillin-­‐‑resistance  gene  (ampr)  for  selective  amplification,  and  a  
replication  origin  (ORI)  for  proliferation  in  the  host  cell.
 Vector

0 Plasmidos  como    vector  (pBR322  )

0 Phage  como  vector        (λPhage  Vectors )
0 Cosmidos
0 M13  Phage  Vector
0 Phagemids(pBS)
0 Eukaryotic  Vectors  and  Very  High  Capacity  Vectors
 Promotores

0 En  los  vectores  de  expresión,  se  suelen  introducir  

promotores  regulables.

0 Se  expresa  el  gen  clonado  en  respuesta  a  cambios  en  las  

condiciones  de  cultivo.

0 Por  que  es  regulado?

0 PROTEÍNAS  FORÁNEAS,  PUEDEN  SER  TÓXICAS  PARA  LA  CÉLULA  O  INHIBIR  
EL  CRECIMIENTO.

0 Permiten  la  transcripción  de  genes  por  secuencias  específicas  

que  reconocen  una  RNA  polimerasa.  especifica

0 Vectores  clonamiento No  se  utilizan  para  expresar    

(solo  inducible)
 pBR322

ori

The  plasmid  pBR322  is  one  of  the  most  commonly  used  E.coli cloning  vectors.  pBR322  is  4361 bp  in  
length  and  contains:  (1)  the  replicon  rep responsible  for  the  replication  of  plasmid  (source  – plasmid  
pMB1);;  (2)  rop gene  coding  for  the  Rop  protein,  which  promotes  conversion  of  the  unstable  RNA I  –
RNA II  complex  to  a  stable  complex  and  serves  to  decrease  copy  number  (source  – plasmid  pMB1);;  (3)
bla gene,  coding  for  beta-­lactamase  that  confers  resistance  to  ampicillin  (source  – transposon  Tn3);;  (4)  
tet gene,  encoding  tetracycline  resistance  protein  (source  – plasmid  pSC101).
pUC18/19
pUC18  and  pUC19  vectors  are  small,  high  copy  number,  E.coli plasmids,  
2686 bp  in  length.  They  are  identical  except  that  they  contain  multiple  
cloning  sites  (MCS)  arranged  in  opposite  orientations.  pUC18/19  plasmids  
contain:  (1)  the  pMB1  replicon  rep responsible  for  the  replication  of  
plasmid  (source  – plasmid  pBR322).  The  high  copy  number  of  pUC  
plasmids  is  a  result  of  the  lack  of  the  rop gene  and  a  single  point  mutation  
in  rep of  pMB1;;  (2)  bla gene,  coding  for  beta-­lactamase  that  confers  
resistance  to  ampicillin  (source  – plasmid  pBR322);;  (3)  region  of  E.coli
operon  lac containing  CAP  protein  binding  site,  promoter  Plac,  lac repressor  
binding  site  and  5’-­terminal  part  of  the  lacZ gene  encoding  the  N-­terminal  
fragment  of  beta-­galactosidase  (source  – M13mp18/19).  This  fragment,  
whose  synthesis  can  be  induced  by  IPTG,  is  capable  of  intra-­allelic  (alfa)  
complementation  with  a  defective  form  of  beta-­galactosidase  encoded  by  
host  (mutation  lacZDM15).  In  the  presence  of  IPTG,  bacteria  synthesize  
both  fragments  of  the  enzyme  and  form  blue  colonies  on  media  with  X-­Gal.  
Insertion  of  DNA  into  the  MCS  located  within  the  lacZ gene  (codons  6-­7  of  
lacZ are  replaced  by  MCS)  inactivates  the  N-­terminal  fragment  of  beta-­
galactosidase  and  abolishes  alfa-­complementation.  Bacteria  carrying  
recombinant  plasmids  therefore  give  rise  to  white  colonies.
pGEM-­‐‑3Z
 Some  antibiotics  commonly  used  as  selective  
agents

Antibiotic Description

Ampicillin  (Amp) Inhibits  bacterial  cell  wall  synthesis;;  inactivated  by  b-­
lactamase,  which  cleaves  the  b-­lactam  ring  of  amp
Hygromycin  B  (HygB)

Kanamycin  (Kan) Binds  to  30S  ribosomal  subunit  and  inhibits  protein  
synthesis;;  inactivated  by  a  phosphotransferase
Neomycin  (Neo) Binds  to  30S  ribosomal  subunit  and  inhibits  protein  
synthesis;;  inactivated  by  a  phosphotransferase
Streptomycin  (Str)

Tetracycline  (Tet) Binds  to  30S  ribosomal  subunit  and  inhibits  protein  
synthesis;;  tetr gene  encodes  a  protein  which  prevents  
transport  of  tet  into  the  cell
Escherichia  coli  K-­‐‑12  cepa  huésped
Bacteria
Crecer  la  bacteria:

1. Medio  nutritivo

2.  Crecer  toda  la  noche  

3.  E.  coli.  Puede  dividirse  

cada  20  minutos.
1) Extraer  el  DNA  plasmidial
1) Usando  un  método  adecuado

2)  Amplificar  un  fragmento  de  ADN

3)  Extraer  un  fragmento  por  digestión  enzimática

Clonando  un  DNA  foráneo  dentro  de  un  vector  
de  expresión

Enzimas  de  restricción.  

Proceder  a  realizar  una  
digestión  enzimática

Tratamiento  con  Fosfatasa  

Alcalina:  
Remueve  los  grupos  fosfatos    
en  la  posición  5’  de  la  molécula  
de  DNA  –

T4  DNA  ligasa  –Unión  de  una  

grupo    5’  fosfato  (P)  
de  la  molécula  de    DNA  a  un  3’  
hidroxilo  libre  (OH)
Cloning  into  a  Plasmid
1) 2)
cDNA is usually oligo dT primed, or by
random primers

mRNA
AAAAAA...
TTTTTT...

Obtención del cDNA

Utilizando dos set de partidores

amplifico (PCR) la secuencia de interés y
obtengo un fragmento de DNA
Estrategia  de  clonamiento  
común
 Como  transformamos  una  
célula  bacteriana
0 Es  un  proceso  natural  que  poseen  las  bacterias,  
involucrado  en  obtener  DNA  desde  el  medio  
ambiente.

0 Hoy  en  día  esa  capacidad  es  explotada.

Transformación  bacteriana
1)  E.  coli, tipo  JM109,  DH5α™,  and  XL-­‐‑1  Blue,  cepas  diferentes  a  la  
cepas  silvestres
Estas  cepas  llevan  mutaciones  en  su  genoma  para  ayudar  a  
propagarlas  y  estabilidad:

2)  Mutación  en  el  gen  rec A  (recA1),  gen  involucrado  en  la  
recombinación.  Por  lo  tanto  se  LIMITA  la  recombinación  del  
plásmidio con  el  genoma  de  la  bacteria  huésped

3)  Cada  una  de  estas  cepas  también  lleva  una  mutación  end A1  que  
inactiva  las  nucleasas  que  puedan  ser  co-­‐‑purificadas  con  el  
plásmidio
 Captación de  DNA

0 Transformación  
0 La  célula  se  hace  competente  para  captar  DNA
0 Transfección
0 Cuando  se  utiliza  como  vector  de  clonamiento  un  
bacteriófago  o  virus,  por  lo  tanto  el  huésped  es  infectado.  
0 Electroporación  
0 La  célula  es  colocada  en  un  campo  eléctrico.
0 Se  producen  pequeños  poros  en  la  membrana  
0 Se  pone  en  contacto  en  DNA  y  las  células.  
 Células  competentes
ž Capacidad  de  captar  DNA  foráneo

ž Tratadas  con  CaCl2 en  fase  exponencial

ž Membrana  es  permeable  a  los  iones  Cloro  pero  no  a  los  iones  Calcio.

ž Cloro  entra  a  la  célula  y  produce  un  movimiento  de  Agua.

ž El  influjo  de  agua  hace  que  la  célula  se  hinche  y  de  esta  manera  capte  el  ADN,    
acompañado  de  un  golpe  de  calor  de  42  °C  (expresión  de  heat shock  genes),  
permiten  que  la  bacteria  sobreviva  a  este  shock  térmico.  
Bacteria
TRANSFORMATION  
PROCEDURE
 Preparación células  
competentes  con  CaCl2
Lavado  CaCl2 ShocK térmico  a   Crecimiento
42ºC
Incubación a
0ºC con el
• Permeabilidad   plásmido. • Permite  la  
entrada del   • Recuperación  .
de  la  
membrana plásmido Sembrado
sobre  agar-­‐‑
antibiótico.