2.

ESCOGIENDO UN VECTOR DE CLONACIN

Andrew Preston

1. INTRODUCCIN

Desde la construccin de la primera generacin de vectores de clonacin
generales a inicios de 1970, el nmero de plsmidos creados ha aumentado
considerablemente. As, una decisin crtica a la cual actualmente tienen que
hacer los investigadores es Qu plsmido usar en un proyecto en particular? A
pesar de la desconcertante eleccin de uno comercial y otros vectores disponibles,
la eleccin de cual vector de clonacin utilizar, puede ser decidido aplicacin
ciertos criterios: tamao del inserto, nmero de copias, incompatibilidad, marcador
seleccionable, sitios de clonacin y funciones especializadas del vector. Muchos
de estos criterios son dependientes uno del otro. Este captulo discute estos
criterios en el contexto para escoger un plsmido para su uso como vector de
clonacin y la Tabla 1 muestra las caractersticas de los vectores de clonacin
ms comnmente usados.

2. CRITERIOS PARA ESCOGER UN VECTOR DE CLONACIN

2.1. Tamao del inserto

Para proyectos en los cuales se desea que se clone una pieza especifica de ADN,
una consideracin es el tamao del inserto de ADN. La mayora de los plsmidos
de clonacin generales pueden llevar un inserto de ADN mayor o tamao
alrededor a las 15kb. Insertos de un tamao mayor restringen en la correcta
replicacin de los plsmidos (particularmente para vectores de alto nmero de
copias) y pueden causar problemas con la estabilidad del inserto. Muchos tipos de
vectores se encuentran disponibles para la clonacin de largos fragmentos de
ADN. Estos son los ms comnmente usados para construir libreras de clones
que a veces son representativas de todo el genoma. Las libreras de clones son
entonces proyectadas para identificar el clon en particular que lleva el ADN de
inters.

2.1.1. Cosmidos (1,2)

Los csmidos son un tipo de vector convencional que contienen una pequea
regin del ADN del bacterifago conteniendo un extremo cohesivo (cos). Este
contiene todos los elementos que actan en cis para el empaquetamiento del ADN
viral dentro de las particulas . Para clonar ADN en estos vectores fragmentos de
ADN linear genmico es ligado in vitro al vector de ADN y este es entonces
empaquetado dentro de las partculas del bacterifago. En la introduccin a
clulas husped de E. coli, el vector es circularizado para formar un plasmido largo
que contendr el fragmento de ADN clonado. Los cosmidos son usados ms
comnmente para generar grandes libreras de insertos. Gracias a estas
restricciones de empaquetamiento, el vector ms el inserto deberan abarcar un
tamao entre 28 y 45kb.
Tabla 1 MCS= Multiplies sitios de clonacin
Vectores de clonacin ms usados

Plsmido

Caracteristias

Fuente comercial
pUC18, pUC19
Tamao pequeo (2.7kb)
Alto nmero de copias
Multiples sitios de clonacin
Marcador resistente a la
ampicilina
Seleccin Azul/Blanca
NEB
Vector pBluescript
As Puc
Sitio de replicacin de cadena
sencilla
Promotores T7 y SP6
flanqueantes de MCSa
Stratagene
Vectores pACYC
Bajo nmero de copias (15
copias por celula)
Origen de replicacin p15A
NEB
Supercos
Vector csmido
Dos sitios cos
Tamao del inserto de 30-42kb
Marcador afn a la ampicilina
Promotores T3 y T7
flanqueantes al sitio de
clonacin
Stratagene
EMBL3
Vector reemplazante de
Sitios MCS: SalI, BamHI y
EcoRi


Promega
zap

Vector
Escisin in vivo en Vector
fagmido pBluescript
Capacidad de clonacin de
10kb
Seleccin Azul/Blanco

Stratagene
pBeloBAC11
Vector BAC
Inserto mayor de 1Mb
Promotores T7 y SP6
flanqueantes al sitio del
insercin
Seleccin Azul/Blanco
NEB
Sitio cos
Sitio LoxP
2.1.2. Vectors

El genoma del bacterifago comprende 48.502 pb. Al entrar en la clula
husped, el fago adopta una de dos ciclos de vida: crecimiento ltico o lisogenia.
En el crecimiento ltico, aproximadamente 100 nuevos viriones se sintetizan y
envasados antes de la lisis de la clula husped, liberando la progenie del fago
para infectar nuevos huspedes. En la lisogenia, el genoma del fago se somete a
la recombinacin en el cromosoma husped, donde se replica y se hereda junto
con la sede de ADN (3). Cul de los dos ciclos de vida diferentes se adopta, se
determina por la multiplicidad de la infeccin y el estado nutricional de la clula
husped. Cuanto mayor sea la multiplicidad de la infeccin y el ms pobre es el
estado nutricional de la clula, la lisogenia se ve ms favorecida.

El uso de como un vector de clonacin implica slo el ciclo ltico. Esto hace que
el tercio medio del genoma , que codifica funciones para la regulacin de la
expresin gnica y el establecimiento de la lisogenia, sea redundante para estos
fines. Es esta la capacidad de reemplazar esta porcin del genoma con ADN
extrao sin afectar el ciclo de vida ltico que hace que til como vector de
clonacin. Vectores de insercin tienen el ADN no esencial suprimido y
contienen un solo sitio para la insercin de ADN. Tpicamente 5-11 kb de ADN
extrao puede ser acomodado en estos vectores. Los vectores de repuesto
contienen sitios de restriccin especficos que flanquean los genes no esenciales.
La digestin del ADN vector lineal en estos lugares produce dos "brazos" que se
ligan al ADN extrao. Muchos vectores disponibles comercialmente se venden
como brazos predigeridos y purificados. Los vectores de sustitucin tpicamente
pueden alojar entre 8 y 24 kb de ADN extrao, dependiendo del vector.

Durante la fase temprana de la infeccin, ADN se replica de manera
bidireccional, en forma circular desde un nico origen de replicacin antes de
cambiar a la replicacin a travs de un modo de crculo rodante. Esto produce un
concatmero de genomas en una disposicin de cabeza a cola que se procesa a
continuacin para dar los genomas individuales para el envasado. El cambio a la
replicacin de crculo rodante depende de la interaccin entre las funciones de
recombinacin del codificado de husped y el fago. Como el dominio de la
recombinacin de diferentes vectores puede variar, se insta al investigador para
asegurar que la cepa de E. coli usado para la infeccin es capaz de replicarse
correctamente el fago. Esta informacin se suministra generalmente con vectores
disponibles comercialmente. Un gran nmero de caractersticas que ayudan en la
clonacin y seleccin de fago recombinante tambin se han incorporado en
vectores . A menudo, el uso de estas funciones tambin necesita el uso de cepas
husped particulares.

2.1.2. Cromosomas artificiales bacterianos (5,6)

Los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) son molculas de ADN circulares.
Contienen un replicn que se basa en el factor F que comprende oriS y repE
codificando una helicasa impulsada por ATP junto con parA, parB y parC para
facilitar la particin precisa (vase el Captulo 1). El factor F es capaz de
transportar hasta un cuarto del cromosoma de E. coli y, por lo tanto, BAC son
capaces de mantener insertos de ADN muy grandes (a menudo hasta 350 kb); sin
embargo, muchas bibliotecas BAC contienen inserciones de alrededor de 120 kb.
Las versiones ms recientes de vectores de BAC contienen sitios para facilitar la
recuperacin de ADN clonado (por ejemplo, loxP) (7). Un fragmento de ADN se
clona en vectores de BAC en una manera similar a la clonacin en vectores de
clonacin generales; ADN es ligado a un vector linealizado y luego introducido en
una cepa de E. coli de clonacin por electroporacin.

2.2. Nmero de Copias

Diferentes vectores de clonacin se mantienen a diferentes nmeros de copias,
dependiendo del replicn del plsmido (ver Captulo 1). En la mayora de los casos
en los que se clona un fragmento de ADN para el mantenimiento y amplificacin
de la manipulacin posterior, mayor es el rendimiento del plsmido recombinante a
partir de cultivos de E. coli, el mejor. En este escenario, un vector de alto nmero
de copias es deseable, como aquellos cuya replicacin es impulsada
por el replicn ColE1 (8). Los plsmidos basados en ColE1 originales tienen un
nmero de copias de 15-20. Sin embargo, un replicn ColE1 mutante, como se
encuentra en la serie de pUC de plsmidos (9), produce un nmero de copias de
500-700 como resultado de una mutacin puntual dentro de la molcula
reguladora de ARNII (ver Captulo 1) que la hace ms resistente a la inhibicin por
RNAI (10). Cabe sealar que esta mutacin es sensible a la temperatura. El ARNII
mutante es resistente a la inhibicin de ARNI a 37 C o 42 C pero no a 30 C,
temperatura a la cual el nmero de copias de plsmidos pUC vuelve al plsmido
ColE1 no mutado.

En algunos casos, un nmero alto de copias puede causar problemas para la
clonacin de ADN. Por ejemplo, el ADN clonado puede codificar protenas que son
txicas para la clula cuando est presente en niveles altos. Esto es
particularmente cierto en protenas de membrana. Incluso si la protena se expresa
pobremente a partir del ADN clonado, la presencia de muchos cientos de copias
del gen en el plsmido puede elevar el nivel de protena a niveles txicos. En
estos casos, el uso de un plsmido con un nmero de copias inferior puede reducir
la dosis de genes por debajo de un nivel en el que se produce toxicidad. Por
ejemplo, pBR322 est basado en el replicn original de ColE1 y por lo tanto tiene
un nmero de copias de 15-20 (11). La serie de plsmidos pACYC estn basados
en el replicn p15A, que tiene un nmero de copias de 18-22 (12). Plsmidos de
bajo nmero de copias incluyen pSC101 (nmero de copias alrededor del 5) (13),
mientras que BAC se mantienen a una copia por clula (5).

2.3. Incompatibilidad

La incompatibilidad se refiere al hecho de que los diferentes plsmidos a veces no
pueden coexistir en la misma clula. Esto ocurre si las dos plsmidos diferentes
comparten funciones que son necesarias para la replicacin y / o particin de las
clulas hijas. La competencia directa para estas funciones a menudo conduce a la
prdida de uno de los plsmidos de la clula durante el crecimiento de un cultivo.
El tamao de plsmido tambin puede influir en el mantenimiento dentro de un
cultivo, como plsmidos ms grandes requieren ms tiempo para la replicacin y,
por lo tanto, puede ser invadida por una replicacin ms rpida de los plsmidos
ms pequeos. Por lo tanto, plsmidos basados en ColE1 son incompatibles con
otros plsmidos basados en ColE1 pero son compatibles con R6K o plsmidos
basados en p15A.
La incompatibilidad slo se convierte en un problema si se requiere que los dos
plsmidos se mantengan juntos (por ejemplo, si la clonacin en una cepa de E.
coli que contiene un plsmido auxiliar) (vase el Captulo 3)

2.4. Marcador seleccionable

La introduccin de plsmidos en clulas de E. coli es un proceso ineficiente. Por lo
tanto, se requiere de un mtodo de seleccin de aquellas clulas que han recibido
un plsmido. Adems, las clulas que no contienen un plsmido tienen una
ventaja de crecimiento sobre los que lo hacen y, por lo tanto, tienen que replicar
tanto en el cromosoma como en el ADN plsmido adicional. Esto tiene una
consecuencia particular cuando se trata de un alto nmero de copias o grandes
plsmidos. En este caso, una presin selectiva debe ser impuesta para el
mantenimiento del plsmido. Casi todos los plsmidos convencionales utilizan un
gen de resistencia a antibiticos como marcador seleccionable, llevado en la
columna vertebral del vector. Por lo tanto, la adicin del antibitico adecuado al
medio de crecimiento matar las clulas que no contienen el plsmido y producen
un cultivo en el que todas las clulas contiengan un plsmido. En muchos casos,
la eleccin del antibitico no est restringido. Sin embargo, algunas cepas de
clonacin de E. coli son inherentemente resistentes a algunos antibiticos y, por lo
tanto, el mismo antibitico no se puede utilizar como una seleccin de aquellas
clulas que llevan un plsmido en particular. El genotipo de la cepa de clonacin
deseado se debe comprobar antes de la clonacin (ver Captulo 3). En algunas
situaciones, las aplicaciones posteriores hacen que algunos antibiticos no sean
opciones adecuadas. Por ejemplo, la mutacin de los genes en fragmentos de
ADN clonados se realiza generalmente mediante la interrupcin del gen mediante
la insercin de un casete de resistencia a los antibiticos. Este tanto muta el gen
como acta como un marcador para la mutacin. A menudo, la mutacin se
introduce en el organismo del que se deriva el ADN. En este caso, slo algunos
antibiticos son adecuados para su uso debido a las restricciones particulares
sobre la introduccin de resistencias a antibiticos en algunas bacterias contra las
que el antibitico se utiliza como un agente teraputico o debido a la resistencia
inherente del organismo original al antibitico. En estos proyectos, el vector no
debera conferir resistencia al antibitico para ser utilizado en la aplicacin de
corriente abajo.

Algunos vectores plasmdicos contienen dos casetes de resistencia a antibiticos.
Por ejemplo, pACYC177 contiene tanto genes de resistencia a la kanamicina
como a la ampicilina. Muchos de los sitios de clonacin en este vector se
encuentran en estos genes y la clonacin en uno de estos sitios inactiva la
resistencia de un antibitico particular. Los perfiles de las resistencias a los
antibiticos de clones recombinantes son una manera de seleccionar aquellos que
llevan fragmentos de ADN de insercin. Vectores ms recienten llevan ahora sitios
de clonacin especializados (poliengarce, sitio de clonacin mltiple; ver Subttulo
2.5.) que aquellos en los que la clonacin de ADN del inserto no interfiere con
funciones vectoriales inherentes. Las resistencias a los antibiticos ms comunes
realizados en los vectores utilizados en E. coli son la resistencia a la ampicilina,
kanamicina, tetraciclina y cloranfenicol.

2.4.1. Ampicilina

Este frmaco inhibe la transpeptidasa bacteriana implicada en la biosntesis de
peptidoglicano y por lo tanto inhibe la biosntesis de la pared celular (14). Como
tal, la ampicilina inhibe las fases log de las bacterias pero no aquellos en una fase
estacionaria. La resistencia a la ampicilina es conferida por una -lactamasa, que
rompe el anillo de -lactama de ampicilina (14). La -lactamasa ms comnmente
expresada por los vectores de clonacin que es codificada por el gen bla (15).

2.4.2. Kanamicina

Es miembro de la familia de antibiticos aminoglicsido, la kanamicina fue aislada
por primera vez de Streptomyces kanamyceticus en J apn en 1957. Este
policatin se tiene en la clula bacteriana a travs de los poros de la membrana
externa, pero cruza la membrana citoplasmtica en un proceso dependiente de
energa que utiliza el potencial de membrana. La molcula interacta con tres
protenas ribosomales y con rRNA de 30S en la subunidad ribosmica, para evitar
la transicin de un complejo de iniciacin a un complejo de cadena de
alargamiento, y por lo tanto inhibe la sntesis de protenas. La resistencia a la
kanamicina es conferida por aminofosfotransferasas. Estos comnmente
codificados por los vectores Aph (3 ')-I de Tn903 y Aph (3')-II a partir de Tn, 5 el
cual transfiere de fosfato desde el ATP a la kanamicina para inactivarla (16). Es
importante sealar que estos dos genes de resistencia tienen diferentes
secuencias de ADN y, por lo tanto, diferentes mapas de restriccin. No va a haber
una hibridacin cruzada en condiciones rigurosas en hibridaciones Southern.

2.4.3. El cloranfenicol

Primeramente aislado de un actinomiceto del suelo en 1947, el cloranfenicol se
usa ampliamente como un antibitico de amplio espectro aunque su uso clnico se
ha visto limitado debido a la toxicidad de la mdula sea y la aparicin de
resistencia a cloranfenicol bacteriano inducida por frmacos. El cloranfenicol
inhibe la actividad de la peptidil transferasa ribosmica y por lo tanto inhibe la
sntesis de protenas (17). La resistencia al cloranfenicol es conferida por la
cloranfenicol acetil transferasa (CAT), que transfiere un grupo acetil de la acetil
CoA al cloranfenicol y lo inactiva (18).




2.4.4. Tetraciclina

Originalmente aislada de Streptomyces aureofaciens en 1948, en la actualidad hay
muchos derivados de la tetraciclina disponibles. Se unen a un solo sitio en la
subunidad ribosmica 30S para bloquear la unin del aminoacil ARNt al sitio
aceptor y por lo tanto inhiben la sntesis de protenas (19). La resistencia a la
tetraciclina es conferida por las protenas de eflujo, TetA (A-E), que catalizan la
exportacin dependiente de energa de la tetraciclina de la clula contra un
gradiente de concentracin (19).

2.5. Sitios de Clonacin

La clonacin de ADN en un vector por lo general implica la ligacin del fragmentos
de ADN inserto a un vector de ADN que ha sido cortado con una endonucleasa de
restriccin. Esto es facilitado por los fragmentos de ADN de insercin y el vector
que tiene extremos cohesivos compatibles. Por lo tanto, el vector de eleccin
puede ser uno que tienga un sitio de restriccin de endonucleasa que es
compatible con el inserto de fragmento de enzima generadora. Cabe sealar, sin
embargo, que cualquier fragmento de extremos romos se puede ligar a cualquier
otro fragmento de extremo romo y que incluso los fragmentos de ADN generados
por enzimas de restriccin generan salientes pueden hacer extremos romo (vase
el captulo 15). En muchos vectores antiguos, los sitios restriccin de
endonucleasa se dispersan alrededor del plsmido y eran a menudo uno de los
genes vectoriales. Por ejemplo, muchos de los sitios de clonacin en la serie
pACYC de vectores se encuentran dentro de uno de los genes de resistencia a
antibiticos de estos plsmidos. La clonacin en estos sitios inactivan el gen de
resistencia y la posterior sensibilidad al antibitico que se utiliza como una pantalla
para los plsmidos recombinantes que contienen el inserto de ADN.

Los vectores ms modernos a menudo contienen un tramo artificial de ADN que
tiene una alta concentracin de sitios de restriccin de endonucleasas que no se
producen en otras partes del plsmido. Estos mltiples sitios de clonacin (SCM) o
polienlazadores dan una amplia variedad de endonucleasas de restriccin para su
uso en la etapa de clonacin. Tambin limitan el sitio de clonacin para una
pequea regin del vector y por lo tanto permiten el posicionamiento especfico del
inserto de ADN cerca de otras caractersticas del vector. Por ejemplo, los SCM de
muchos vectores tales como la serie pUC estn flanqueadas por secuencias
complementarias a una serie universal de cebadores, la cebadores M13 directo e
inverso. Estos sitios promotores estn orientados de tal manera que la extensin
de los cebadores hibridados a estos sitios permiten la secuenciacin de ambos
extremos de un inserto de ADN en el MCS. De esta manera, un conjunto de
cebadores universales se puede utilizar para secuenciar cualquier inserto de ADN,
independientemente de que el sitio de ADN se insert en el MCS.

Muchos plsmidos contienen los SCM que se encuentran dentro de la secuencia
codificante del fragmento de lacZ. Esta caracterstica (azul / blanco de seleccin)
facilita la identificacin de las construcciones recombinantes que llevan un
fragmento clonado diferencindolas de clones que se derivan de la religacin del
vector de clonacin. Esta funcin se describe en el Captulo 19.

2.6. Funciones especializadas del plsmido

Algunos proyectos implicarn aplicaciones posteriores especficas que requieren
funciones de plsmidos especializados que slo estn presentes en algunos
plsmidos. Por ejemplo, tanto la serie de vectores pUC y pBluescript son de alto
nmero de copias, plsmidos de resistencia a ampicilina que contienen los SCM
que facilitan el uso de una amplia gama de endonucleasas de restriccin en la
etapa de clonacin. Sin embargo, una caracterstica presente en vectores
pBluescript que no est presente en vectores pUC son los promotores que
flanquean el MCS que permiten la transcripcin de la insercin de ADN en
cualquiera de las cadenas. El T7 y SP6 son dos promotores son reconocidos por
ARN polimerasas de bacterifagos que deben ser suministradas en trans. Estos
no transcriben los genes del hospedador u otros genes del plsmido, que permite
la transcripcin especfica de la insercin de ADN (vase el captulo 27).

Los vectores pBluescript son fagmidos. Ellos contienen un origen de una sola
cadena de bacterifago filamentoso de replicacin (el fago M13) y, por lo tanto,
son tiles para generar ADN de cadena sencilla (ver Captulo 13) para
aplicaciones tales como la secuenciacin de ADN o la mutagnesis dirigida al sitio.
La replicacin de cadena sencilla se inici mediante la infeccin con un fago
auxiliar que codifica las funciones necesarias. Estos vectores tambin pueden
replicarse como plsmidos de doble cadena convencionales. El origen de una sola
cadena puede existir en dos orientaciones. Esas versiones en el que est en la
misma orientacin que el origen del plsmido se denotan como "+", mientras que
aquellos con el origen en la orientacin opuesta se designan como "-". Muchos
plsmidos han sido diseados para conseguir la expresin de alto nivel de
protenas recombinantes a partir del ADN clonado. Estos vectores de expresin se
discuten en el Captulo 28.

3. Resumen

Al elegir un vector de clonacin para su uso en un proyecto de clonacin, el
investigador se enfrenta a una enorme variedad. Sin embargo, la aplicacin de un
pequeo nmero de criterios puede guiar de forma rpida la seleccin de un
vector adecuado. Muchos plsmidos contienen suficientes caractersticas que las
hacen adecuadas para una amplia gama de proyectos. Por lo tanto, el investigador
debe estar equipado con slo un pequeo nmero de vectores con el fin de
satisfacer la mayora de necesidades.