BIOLOGÍA MOLECULAR

El polimorfismo genético se define

por la existencia de varios alelos
(formas diferentes de un mismo
gen) en una población.

Este fenómeno resulta de mutaciones

pOLIMORFISMOS genéticas.

El polimorfismo es uno de los

elementos de la diversidad genética
que responde a la necesidad de
adaptación a un ambiente determinado.
 Se está estudiando cómo los polimorfismos
Los polimorfismos de nucleótido único
de nucleótido único, o SNPs, en el genoma
(SNP) son un tipo de polimorfismo que
humano se correlacionan con
producen una variación en un solo par de
enfermedades, con la respuesta de los
bases.
fármacos, y con otros fenotipos.
Se clasifican de acuerdo a la región donde se ubican y al efecto que ejercen sobre ella.

SNP reguladores (rSNP) y reguladores de los microRNA (miR-rSNP)

SNP ARN estructurales (srSNP)

Polimorfismos CNV ( copy number variation)

CNV multialélicas afectan ampliamente a

los genes y a su expresión, siendo la
principal fuente de variación de la dosis
génica en humanos (hasta un 88% de la
variabilidad)
o
¿QUÉ ES LA TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE?
•Eltérmino ADN recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de
segmentos o de moléculas de ADN que no se encuentran juntas de manera natural.

•La tecnología del ADN recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de
los ácidos nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la
investigación de bacterias y de virus.
¿CUÁLES SON SUS APLICACIONES?
•Aplicaciones en investigación y medicina
- Producción a gran escala de proteínas de utilidad
médica
- Animales transgénicos
- Terapia génica
Aplicaciones industriales
•Aplicaciones en agricultura
- Mejora genética de los cultivos
- Nuevos insecticidas naturales
1 CLONACION. La clonación de ADN, o clonación molecular, es la introducción
de un fragmento de ADN denominado inserto dentro de una molécula de
ADN denominada vector.
2 EXPRESAR UNA PROTEÍNA (CODIFICADA POR EL GEN DE INTERÉS)

¿Y CÓMO SE HACE?
1 SECUENCIA DE ADN DE INTERÉS
2 VECTOR : una molécula de ADN de doble cadena (DNAds), con capacidad de albergar un fragmento
de ADN exógeno (de otro origen), puede replicarse de manera autónoma e independiente del
genoma de la célula hospedera.
 VECTORES
Agentes que pueden insertar un fragmento de ADN dentro de
una célula huésped = MOLÉCULA DE ADN TRANSPORTADORA

• Inserción de hasta 10kb

1. Plásmidos
• Sistema más común

• Filamentosos (M13, capacidad de inserción 10kb)

• Tipo I (T1, capacidad 23kb)
• Lamba (capacidad 25kb)
•P1 (capacidad 100 kb)

3. Cósmidos

4. BAC • Capacidad de 300kb

• Cromosoma artificial de bacterias
 Células Huésped

Saccharomyces cereviseae,
Levaduras Pichia pastoris, etc.

Células mamíferas

Bacterias
 Cual es el vector
adecuado?

La elección de un
vector de clonación
depende del
tamaño del inserto
y la aplicación.
 Vector de clonación: El vector de clonación es
una pequeña porción de ADN que se puede
mantener de manera estable dentro de una
célula huésped. Se utiliza para introducir genes
en las células y obtener numerosas copias del
inserto.
Vector de expresión: El vector de expresión se
utiliza para introducir un gen específico en una
célula diana y los mecanismos de las células de
control para producir el producto génico
relevante.
Su objetivo es producir un tránscrito
(ARN) o la proteína producto de ese
tránscrito. Los vectores de expresión
pueden ser plásmidos o fagos
Los Vectores de clonación y vectores de expresión:

Comparten características comunes como

Son capaces de replicarse
el origen de la replicación, los sitios de
independientemente dentro de la célula
restricción únicos y el gen marcador
huésped.
seleccionable en su secuencia de vectores.
Todos los vectores de clonación tienen cuatro características especiales:

Contienen varios
Son auto-replicativos
sitios de restricción, Son relativamente
junto con el
que están presentes fáciles de recuperar
segmento de ADN
solo una vez en el de la célula huésped
extraño que llevan
vector.
Origen de la
replicación

Marcador de
selección

Sitio de
clonación
múltiple
Marcadores de
selección
1. Preparación del inserto de ADN que se va a clonar.
2. Preparación del vector para la clonación.
3. Ligación del inserto y el vector.
4. Preparación de células competentes.
5. Transformación celular.
6. Identificación de las colonias celulares que contienen el vector recombinante
Estrategia general de clonación.
Estrategias de
clonación

Enzimas de Restricción - YouTube

1. Plásmidos

¿Porqué son empleados como vectores?

Porque son:
- Pequeños.
- Producen múltiples copias.
PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE CLONADO

GEN LACZ
(MARCADOR
DE
SELECCIÓN)

SITIO DE
CLONADO
MÚLTIPLE

ORIGEN DE
REPLICACION
LIGACIÓN
ADN LIGASA
¿CON QUÉ?

TUBO CON MEZCLA DE

FRAGMENTO DE ADN Y
PLÁSMIDO DIGERIDOS CON
EcoRI
 PLÁSMIDO NO
RECOMBINANTE

PLÁSMIDO RECOMBINANTE
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

¿CÓMO?
TUBO CON MEZCLA DE TUBO CON CULTIVO
PLÁSMIDOS LÍQUIDO DE BACTERIAS
RECOMBINANTES Y NO
RECOMBINANTES
 BACTERIA NO
TRANSFORMADA

BACTERIA
TRANSFORMADA
SIEMBRA PLACAS CON MEDIO AGAR LB SUPLEMENTADO CON AMPICILINA, IPTG Y X-gal
INCUBACIÓN A 37°C POR 16 HORAS
A. BACTERIA NO
TRANSFORMADA

LA BACTERIA SIN
PLÁSMIDO NO CRECE
 TRES RESULTADOS POSIBLES ….

B. BACTERIA
TRANSFORMADA
CON PLÁSMIDO NO
RECOMBINANTE

EN UN MEDIO
CON IPTG Y Xgal

LA BACTERIA CON
PLÁSMIDO CRECE
 TRES RESULTADOS POSIBLES ….

C. BACTERIA
TRANSFORMADA
CON PLÁSMIDO
RECOMBINANTE

EN UN MEDIO
CON AMPICILINA

LA BACTERIA CON PLÁSMIDO

LA BACTERIA CON
NO RECOMBINANTE (GEN
PLÁSMIDO CRECE
LACZ DISRUPTO) ES BLANCA
Plásmidos como
vectores de
expresión
 PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE EXPRESIÓN
PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN EN
COMPONENTES: BACTERIAS

1. ORIGEN DE REPLICACIÓN
2. GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las bacterias que contienen el plásmido; ej. ampicilina)
3. SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE
4. PROMOTOR (debe ser fuerte para tener una expresión elevada)
5. SEÑAL DE TERMINACIÓN (finalización del ARNm)

PARA LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA EN PARA LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA EN

CÉLULAS DE MAMÍFEROS BACTERIAS
GENES REPORTEROS O MARCADORES
Vectores de expresión

PROMOTORES
Inducidos por diversos factores.

Inductores:
•Calor
•Fuente de carbono
•Presencia de algun compuesto
inductor
 Ejemplo: Habilidad de sobrevivir en
concentraciones de antibióticos normalmente
tóxicas tales como cloranfenicol y ampicilina,
frecuentemente debida a la presencia en la
bacteria de un plásmido que transporta genes
de resistencia a antibióticos.
•Lascélulas bacterianas son extremadamente útiles para la traducción activa de proteínas de mamíferos,
immunológicamente activas.
•La expresión de genes de mamíferos en bacterias necesita resolver los problemas siguientes:
1. Las proteínas producidas por estos métodos no presentan modificaciones post-tranduccionales.
2. los promotores eucariotas no son reconocidos por las ARN polimerasas bacterianas.
3. los genes eucariotas contienen intrones.
4. los ARNm eucariotas no son todo el tiempo traducidos por los ribosomas bacterianos.
5. las proteínas presentes en grandes cantidades en las bacterias forman cuerpos de inclusión insolubles
6. las proteínas eucariotas pueden ser reconocidas como cuerpos extraños por las proteasas de la bacteria y
ser degradadas.
EL CASO DE LA INSULINA HUMANA
SELECCIÓN DEL PROMOTOR

•Según la célula huésped:

- Bacteria
- Célula eucariotas
Según el tipo de ARN deseado en células eucariotas:
- ARNm: ARN POLIMERASA tipo II
-ARNsh: ARN POLIMERASA tipo III