Como

 funcionan  los  
vectores  de  expresión

EN  SISTEMAS  BACTERIANOS
Por  que  usar  vectores  de  expresión
Permiten  la  expresión  de  proteínas  o  enzimas  de    diferentes  
fuentes.  Con  fines  para:
◦ Caracterizar
◦ Determinar  función
◦ Estructura
◦ Etc.
◦ Producir  (proteína  o  peptido)  con  fines  farmacológicos
◦ Industriales.
Vectores  de  expresión  proteíca

Debe  ser  capaz  de  ser  transcrito  por  la  maquinaria  genética  
dentro  de  la  cual  se  transforma.    
vDebe  tener  un  promotor  para  la  ARN  polimerasa  específica.
vel  ARN  transcrito  debe  de  tener  un  sitio  de  reconocimiento  para  
ser    traducido.

vDebe  de  tener  una  secuencia  de  terminación  de  la  transcripción  
(se  transcriben  todas  las  proteínas  del  plásmido).
Vectores  de  expresión:  Que  
contienen

žPromotor:  secuencia  de  ADN  que  determina  el  sitio  

de  inicio  de  la  transcripción  par  la  ARN  polimerasa.
¡Operador

žSecuencia  de  Shine-­‐Dalgarno,  que  confiere  alta  

eficiencia  de  la  traducción  de  la  proteína.

žTener  una  secuencia  de  termino  de  la  transcripción

Otros  Elementos
ž una  secuencia  de  nucleótidos  que  codifica  un  pequeño  polipéptido
(una  “etiqueta”)  que  puede  ser  reconocido  por  anticuerpos  
específicos.

ž El  gen  clonado  y  la  etiqueta  se  expresan  conjuntamente  originando  

una  proteína  de  fusión,  fácilmente  detectable  con  los  anticuerpos.  

ž También  existen  “etiquetas”  que  permiten  la  purificación  rápida  de  la  
proteína  de  fusión  por  cromatografía  de  afinidad.
Plásmido  de  expresión
LaqI XbaI
XhoI

pT7
O   RBS Tamaño:  3-­5  kpb
Lac

ColE1,  

Kan  R
Como  elegir  un  sistema  de  
expresión

Debe  ser  compatible  con  la  célula  hospedera  (vector  

proc/cel proca.  vector  Euc/célula  Euc)  
Deben  existir  además
◦ Secuencias  de  terminación
◦ UAA,  UAG  o  UGA  
◦ Secuencia  de  inicio  de  la  traducción
 Origen  de  replicación
Es  un  segmento  de  ADN  
reconocido  por  la  maquinaria  
Celular  (DNA  Polimerasa,  
helicasas,  SSB  etc).
◦ Permite  replicarce dentro  de  la  
célula
 Proteínas  
necesarias

Solo  unos  
Regulación  
pocos  genes  
Positiva
de  expresan

RNA  
policistrónico
Regulación  
Negativa Regulación  
Fina  y  
coordinada
Control  de  la  expresión a  nivel  
transcripcional
qEl  control  de  los  genes  regulables  se  realiza  mediante  proteínas  
que  van  a  desarrollar  un  control  activador  o  inhibidor  sobre  el  
mecanismo  de  la  transcripción.  

qLas  células  contienen  un  conjunto  de  proteínas  que  al  unirse  a  
secuencias  específicas  del  ADN  activan  o  desactivan  los  genes.  
qEl  control  de  la  expresión  génica  permite  a  la  bacteria  ajustar  su  
metabolismo  a  cambios  ambientales.
 
Regulación génica

Las  células  varían  la  cantidad  de  enzimas  específicas  a  

través  de  la:  regulación  de  la  transcripción  de  genes
◦ genes  on o    genes  off
◦ Ej:  Si  la  célula  tiene  suficiente  triptófano,  no  necesita  sintetizar  
enzimas  usadas  para  producir  triptófano.
◦ Desperdicio  de  energía
◦ Se  desactivan  los  genes  que  codifican  para  esas    enzimas.
◦ Si  la  bacteria  se  encuentra  en  un  medio  que  no  contiene  glucosa  
como  fuente  de  carbono,  si  no  lactosa
◦ Se  activa  el  operón lactosa
 Genes  agrupados:  Concepto de  
  OPERON  
  Los  genes  regulables  que  codifican  proteínas  de  una  ruta  
metabólica    no  se  encuentran  dispersos  en  el  genoma,  sino  
que  están  normalmente  adyacentes,  agrupados  en  unidades  
de  funcionamiento  denominadas  operones,  y  su  transcripción  
está  bajo  el  control  de  proteínas  activadoras  y  represoras.  
 
 
 
 
 Operón

◦ genes  agrupados  que  tienen  funciones  relacionadas  

◦ ej. enzimas  en  una  vía  de  síntesis

◦ promotor  =  sitio  de  unión  a  RNA  polimerasa  

◦ Un  promotor  controla  la  transcripción  de  todos  los  
genes  del  operón
◦ Transcritos  como  1  unidad  y  se  forma  un  simple  
mRNA
◦ operador  =  secuencia  de  ADN  al  que  se  une  una  
proteína  reguladora,  que  reprime  o  activa.
¿Cómo desactivar los  genes?

Transcripción
◦ Detener la  RNA  polimerasa
Proteína Represora
◦ Se  une a  una secuencia de  DNA  cercano a  la  región
promotora bloqueando a  la  RNA  polimerasa
◦ Se  une al  sitio operador del  DNA
◦ Bloquea la  transcripción
 En ausencia de Lactosa

Gen regulador: proteína represora

En presencia de Lactosa
Operón  lactosa
En ausencia de Triptófano, la célula requiere sintetizarlo, por
lo tanto el represor se encuentra inactivo y el operón
activado, sintetizando en triptófano.
En presencia de Triptófano, la célula no requiere formarlo, por lo
tanto el represor se activa y el operón se detiene. No hay síntesis.
El  promotor  del  operón de  la  
lactosa  (lac)
žProveniente  del  operón lactosa.

¡ En  el  laboratorio,  la  inducción  se  realiza  añadiendo  un  inductor  que  a  diferencia  de  la  
lactosa,  no  se  metaboliza.

¡ IPTG  (isopropil-­‐b-­‐D-­‐tiogalactósido),  se  une  al  represor,  inactivándolo.

¡ Para  que  el  promotor  lac se  exprese  a  un    alto  nivel,  se  deberá  evitar  la  represión  
catabólica.  

¡ En  ausencia  de  glucosa  la  proteína  CAP  se  une  al  AMPc,  y  el  complejo  se  une  cerca  del  
promotor,  ayudando  a  la  ARN  polimerasa  a  comenzar  la  transcripción.

¡ Para  el  caso  particular  de  los  vectores  de  expresión,  se  suele  emplear  un  promotor  lac
mutante,  conocido  como  lacUV5  (con  una  sustitución  en  la  región  –10),  que  es  más  
potente  que  el  promotor  silvestre.  Esta  variante  es  reprimible  por  LacI e  inducible  por  IPTG.  
 Vector  pET
Sistema  comercial  (fue  creado  por  Moffatt BA,  Studier FW.  1986)  
Usan  una  RNA  polimerasa  del  fago  T7
Posee  el  gen  lacI codifica  para  una  proteína  represora  
Promotor  de  T7    específico  para  la  T7  RNA  polymerase de  fago  T7  (no  
reconoce  la  RNA  polimerasa  bacteriana)
Un  operador  lac operador  :    DONDE  OCURRE  la  inactivación  de  la  
transcripción.
Origen  de  replicación  del  f1  
Origen  de  ColE1
Este  vector  no  contiene  la  SD
Hoy  hay  ~33  diferentes  vectores  disponibles
 Vectores  pET

ž pET contiene  un  promotor  fuerte,  

¡ El  promotor  del  bacteriófago  T7  (P  T7).  Este  promotor  es  específico  de  T7,  no  deja  
acceso  del  ARN  pol de  la  E.  coli.  

¡ La  T7 ARN  pol usa  el  gen  de  T7  que  ha  sido  insertado  en  el  cromosoma  de  la  bacteria  
huésped.  
Sistema  de  la  polimerasa  de  T7  
en  presencia  de  IPTG
La  bacteria  huésped.

Se  utiliza  una  bacteria    BL21  (DE3),  en  cuyo  cromosoma  se  ha  
insertado  el  gen  que  codifica  por  la  T7  ARN  pol  precedido  del  
promotor  lacUV5.  

La  expresión  del  gen  de  T7  ARN  pol  se  controla  mediante  el  
promotor  LacUV5.  
◦ Promotor  del  operón  lactosa    inducible  por  la  IPTG.  

◦ Se  producen  bajos  niveles  de  expresión  en  condiciones  no  

inducidas
Sistemas  de  expresión  con  
promotores  regulables
Derivados  del  Plac  (inducibles  por  IPTG)
Derivados  del  Ptrp  (reprimibles  por  Trp)
Promotores  artificiales  Ptac.
Promotor  del  fago  T7  +  gen  ARN  pol  de  T7
Promotor  de  araBAD,  inducible  por  arabinosa
Promotor  de  phoS (inducible  en  ausencia  de  fosfatos).
Promotor  Sal,  inducible  por  Salicilato
Sistema  de  expresión
1. Expression Vector  (plasmids)
◦ pET
◦ pQE (cola  de  hostidinas de  Quigen)
◦ pGEX
2. Expression  Strain  (E.  coli )
◦ BL21(DE3)
◦ Rosetta(DE3)  
◦ Tuner(DE3)
◦ ADA494(DE3)
◦ Origami(DE3)
Tags

◦His6 for  metal  affinity  chromatography  (Ni)

◦FLAG  epitope  tage DYKDDDDK
◦CBP-­‐calmodulin binding  peptide  (26  residues)
◦c-­‐myc epitope  tag  EQKLISEEDL
◦Glutathione-­‐S-­‐transferase (GST)  tags
◦Cellulose  binding  domain  (CBD)  tags
The epitope tagging
technique  involves  fusion  of  a  protein  of  interest  to  a  peptide-­‐epitope  
that  is  recognized  by  a  readily  available  antibody.  

this  technique,  expression  of  the  fusion  protein  is  monitored  using  a  
tag-­‐specific  antibody,  allowing  a  new  protein  to  be  studied  without  
generating  a  new,  specific  antibody  to  that  protein.

Epitope  tagging  can  be  used  to  localize  gene  products  in  living  cells,
identify  associated  proteins,  track  movement  of  fusion  proteins  within  
the  cell,  or  characterize  new  proteins  by  immunoprecipitation.  
Fuente  :  vegetales

Extracción  de  
Clonando una proteína
mRNA Eucariota
La estilbeno sintetasa
RT-­PCR

TTTTTTT cDNA  de  

TTTTTTT
enzimas claves
 mAbs ID#1 280nm (1.00)
700

25.395
600

500

400

PCR HPLC 300

200

24.098
22.295
21.530
100

25.981
20.852
21.192
22.006

23.554
22.864

27.077
24.799
0

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 min

Clonamiento   Crecimientos  de  E.Coli en  precursores  

y  obtención  de  estilbenos

Análisis  de  expresión  de  Proteína

Tranformción
pA
CMV CITE
Lef2
Neo
pETR
Amp  r 6601bp
β-­globin
pA
Ori
Bacteria
Expresión  heteróloga
 Resumen Vector  
Expression
Vector  
Clonamiento
Hiperexpesión de  genes  bajo  el  
promotor  Fi10  del  fago  T7

Tiempo,  condiciones  de  crecimiento

◦Medio  de  cultivo
◦M9,  casa-­‐aminoácidos
◦Baja  concentración  de  glucosa
◦Se  crecen  los  cultivos  hasta  una  OD  de  0,5
◦Dilución  de  25  veces  y  se  incuba  con  
agitación  hasta  una  OD  de  0,45
 OD 0,45

IPTG=0,5 mM IPTG= 1mM IPTG=1,5 mM

Tiempos
1) 0 min
2) 10 min
3) 30 min
4) 60 min
M ui 10 30 60
ui 10 30 60

A las muestras inducidas se añaden

50 uCi de a-35S metionina