ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

10/marzo/2023
Todo lo que está en rosa es lo que dijo el doctor.
Endonucleasas. Cortan el ADN en secuencias específicas y forman trozos únicos de
cualquier fuente.
Las enzimas de restricción reconocen sitios específicos.
Se les llama RE porque su presencia en las bacterias inhibe el crecimiento.
Presente en células que tengan metilasas de unión específica.
Las enzimas de restricción son el sistema inmune de las bacterias. Estas enzimas
son capaces de reconocer cuando hay un DNA extraño. Se pegan a lo extraño y lo
destruyen. Siempre distinguen un sitio o secuencia específica. Cada enzima tiene su
sitio de restricción y siempre corta de la misma manera. Es la base de la ingeniería
genética.
Escinden una secuencia específica de doble hebra de 4 a 8 pares de bases.
Ejemplos: EcoRI- e.coli
SmaI- Serratia marcescens

Las enzimas son nombradas en base de en dónde son aisladas.

EcoRI: E=escherichia co= especie R= numero o cepa de la bacteria I=orden en la que fue
descubierta la enzima

FRECUENCIA DE CORTE DE CADA ENZIMA:

Se calcula tomando en cuenta los pares que se encuentran en el DNA. 4 a la 4: 256. cada
256 pares de bases, la EcoRI va a realizar un corte.
Si se sube la energía, se separan las bases, pero si se baja esta, se unen otra vez los
pares de bases. Los enlaces fosfodiéster no se unen solos, por lo que se une el DNA
por la ligasa.

La adn ligasa une los extremos complementarios de la cadena de DNA. Liga los extremos
y lo hace mediante ATP.
Los errores en el corte de las enzimas se producen si se usa la misma enzima de los dos
lados. Cuando se corta a escalerita

Moléculas quiméricas: fosfatasas alcalina= desfosforila extremos de 5´-3´. Se emplea para

impedir la ligadura.

Las enzimas de restricción son de la familia de las nucleasas. La exonucleasa

empieza a degradar de uno de los extremos.
Hay 3 tipos:
1 atp modifican corta Cortan al azar
2 No No corta Cortan específicamente en el sitio de
atp modifican restricción
3 atp modifican corta Cortan en un sitio distante al sitio de
restricción. No al azar.

Un sitio de restricción es un sitio específico donde encuentre pares de bases que

detecta la enzima y ahí corta.
Son polindromes, se leen igual. Ese sitio de restricción hace corte específico,
siempre es el mismo corte.
Generan un sitio cohesivo. Si se corta, se vuelve a pegar la cadena.
Los plásmidos son los DNA que tienen las bacterias. Son secuencias circulares.
Adenovirus 6 causa obesidad.
La división de las células depende de la telomerasa. La telomerasa le da estabilidad
a los extremos de los cromosomas. Con las divisiones, la telomerasa se va
degradando hasta inactivarse, por eso se envejece.
Anticuerpos monoclonales: terapias en cáncer o enfermedades autoinmunes. Se
purifican los anticuerpos y se inyectan. Una línea de anticuerpos los produce el
linfocito b. De un solo linfocito b, salen hacia todos lados del organismo.
Todo lo que termine en MAB son anticuerpos monoclonales. Fueron tratados
genéticamente para tratar algo. Una proteína de un tumor humano, se lo inyectas a una
rata, a esa rata le sacas el LB, ese LB se lo metes a un ratón, ese ratón produce otro LB,
se lo metes a un conejo, le pones un pedazo de anticuerpo humano y el conejo produce
anticuerpos de ratón, de humano que produce un antígeno tumoral. Se usa mucho contra
enfermedades autoinmunes. Actualmente se usa en terapias contra cáncer. Car-T-Cells.
Linfocitos que son modificados. Sacan sangre, se van a laboratorio, analizan las leucemias
y se hace que los LT tengan antígenos en contra de los LT que tengan ese tipo.
Quimioterapia-Radioterapia-Inmunoterapia

VECTORES MOLECULARES
13/marzo/2023

Plásmidos, virus, retrovirus, qué es cada uno, en qué se usa, debilidades, virtudes.

El DNA recombinante es un plásmido que se abre con enzima de restricción, se le pone un

fragmento de DNA a partir del cual queremos obtener una proteína (insulina). También se
insertan fragmentos para poder estudiarlos.
Dentro de toda la secuencia del plásmido, podemos cortar donde queramos.
La clonación molecular se puede ver como dos grandes pasos:
1. Lograr hacer la unión de inserción de un DNA en otro
2. El DNA recombinante se mete en una célula y este va a generar copias de este DNA
que yo le inserte. Generar muchas copias del DNA de interés.
Tipos de vectores:
Clonación:
Bibliotecas genómicas y copias de DNA de interés
Expresión:
Generar proteína de interés
Ya tiene de fábrica un promotor.
Reporteros:
Analizar un promotor de un gen de interés. Pueden identificar funciones de otras proteínas.
Es el gen de la luciferasa. Genes cuyos productos pueden ser fácilmente detectables o
medibles.
La región regulatoria es la de los promotores.
Se inserta el DNA recombinante, se da el proceso de transcripción y se expresa en forma
de DNA mensajero y es el vector reportero. En el ejemplo de la luciferasa, se mide la
bioluminiscencia para ver si se expresó bien.
Ya tienen una secuencia y tenemos que meter un promotor.
Vamos a meter un gen promotor a un gen reportero. El gen da lugar a una proteína que es
fácil de medir. Básicamente el gen reportero que ya trae el plásmido que se va a utilizar va
a dar paso a la enzima LUCIFERASA porque la bioluminiscencia se puede medir. Si el
promotor es capaz de inducir la expresión de la región que está en frente de él, en este
caso la luciferasa, va a hacer bioluminiscencia. Si el promotor no brilla, no puede expresar
bien el gen.

Los promotores que se usan en los vectores reporteros son potenciales o desconocidos.
Hay veces que son promotores parciales que se usan para demostrar cuál es la porción
mínima para expresar un gen.
A partir de muchos RNA mensajeros se pueden derivar muchas proteínas.

Vector reportero vs vector de expresión

Reportero: inserta a un promotor. Extremo 5´del plásmido. Tiene que estar un gen reportero.
Expresión: no se les necesita poner un promotor, se necesita poner algo que se exprese.

Vectores de clonación
VECTOR DE CLONACIÓN VECTOR DE EXPRESIÓN
DEFINICIÓN Es una pieza pequeña de Mete un gen en una célula y va a
DNA, que es usada para expresar una proteína
introducir un gen ajeno en una
célula hospedadora.
ROL Se usa para obtener múltiples Se usa para obtener o analizar el
copias del gen producto de un gen (proteínas o
simplemente el RNA mensajero)
TIPOS Plásmidos, cósmidos, fagos, Plásmidos.
BACs, YACs o MACs
(sistemas más grandes que
un plásmido).
CARACTERÍSTICAS Consiste en la replicación, Tiene promotores, terminaciones
sitios de restricción y de secuencias, sitios de inicio de
reportando genes y sitios de transcripción. Características de
resistencia antibiótica. un vector de replicación.

Plásmidos (los más pequeños), se le pueden insertar hasta 5,000 pares de bases.
YACs: se pueden insertar secuencias de 250 a 400 kilo bases (se pueden llegar a insertar
400,000 pares de bases). Pueden crear bibliotecas genómicas.

Vector: transporta DNA y eso lo puedo manipular e insertar en una célula de interés.
Plásmido PBR322. dentro de la estructura de este plásmido hay una región que es un gen
que va a conferir consistencia a la tetraciclina (antibiótico). Si se mete a estos plásmidos a
una bacteria, este le puede conferir la característica de crecer en un ambiente con
antibiótico, como la tetraciclina.

Clonación molecular:
Introducción del dna (inserto) en una molécula llamada vector.
Vectores de clonación: molécula de dna que contiene doble cadena con capacidad de
albergar una cadena de dna exógeno o inserto.
Se corta un gen

27/MARZO/2023 CLASE
VECTOR MOLECULAR: SE ENCARGA DE TRANSPORTAR INFORMACIÓN GENÉTICA
DE UNA ESPECIE A OTRA
CLONACIÓN: EXPRESAR UN GEN DE UNA ESPECIE, EN OTRA.
SE TRATA DE ENGAÑAR A LA CÉLULA PARA QUE HAGA MUCHAS COPIAS DE LO
QE NOSOTROS QUEREMOS, QUE REPLIQUE LO QUE QUEREMOS.
EN EL SITIO ORI SE PEGUA LA POLIMERASA, ETC.
AL SITIO DEL PROMOTOR SE UNEN LOS FACTORES DE REPLICACION PARA
INICIAR CON LA TRANSCRIPCIÓN
SE TIENEN TRES PARTES:
EL MARCADOR DE SELECCIÓN ES UN ANTIBIÓTICO PARA LOGRAR
TRANSFORMAR A LA BACTERIA. DE UN MILLÓN, 100MIL SON COMPETENTES
Y SOLO 10MIL TOMAN EL VECTOR. SE SIEMBRAN EN UN MEDIO DE CULTIVO
Y LAS QUE NO TOMARON EL VECTOR SE MUEREN AL NO TENER UNA
RESISTENCIA A UN ANTIBIÓTICO.
EL SITIO MÚLTIPLE ES UNA REGIÓN QUE TIENE MUCHAS SECUENCIAS DE
RESTRICCIÓN PARA ESCOGER DÓNDE VOY A CORTAR Y DÓNDE LO VOY A PONER

BACTERIÓFAGOS:
LLEVAN EL CONTENIDO GENÓMICO A TRAVÉS DE LA CABEZA. LA CABEZA, EN EL
CENTRO, NO TIENE MATERIAL GENPETICO IMPORTANTE, POR LO QUE PUEDE
SER REMPLAZADO.
CICLO LÍTICO:
CICLO LISOGÉNICO: SE INSERTA EL MATERIAL GENÉTICO DEL GENOMA AL
INTERIOR DE LA BACTERIA. EL BACTERIÓFAGO ENTRA EN LA BACTERIA Y TOMA
UNA FORMA CIRCULAR.
LOS FACTORES QUE DECIDEN SI LA BACTERIA ENTRA EN CICLO LÍTICO O
LISOGÉNICO ES LA TEMPERATURA, LAS PROTEASAS. CUANDO ESTAS ESTÉN
ALTAS, SE DAN LOS GENES CROS. CUANDO ESTÉN BAJAS SE DERIVAN TRES
EXPRESIONES, ENTRE ESOS, EL CII
EL CROS NO SE EXPRESA.
AL TENER EL MATERIAL GENÉTICO DE MANERA CIRCULAR, SE DERIVAN
PROTEÍNAS DENOMINADAS PROTEÍNAS TEMPRANAS.

LOS VECTORES, DEPENDIENDO DE CUÁL ES, ES LA CAPACIDAD DE LAS BASES

QUE SE PUEDEN INTRODUCIR.
EL VECTOR VIRAL INFECTA BACTERIAS
CÓSMIDO: ES UN PLÁSMIDO QUE TIENE GENES QUE ADEMÁS DE COPIARLO, LO
VA A EMPAQUETAR PARA QUE SEA MÁS FÁCIL SU TRANSMISIÓN. HÍBRIDO
PLÁSMIDO BACTERIÓFAGO.

ACTUALMENTE SE USAN VIRUS COMO VECTORES. POR EJEMPLO, EL

ADENOVIRUS QUE SE USA PARA LA VACUNA ASTRAZENECA. SE DENOMINA
VIRUS DESNUDO PARA NO CAUSAR DAÑO A LA CÉLULA HUÉSPED.
MECANISMOS DE TRANSFORMACIÓN (EN CÉLULAS
PROCARIOTAS) Y TRANSECCIÓN (EN CÉLULAS
EUCARIOTAS)
17/abril/2023
Procariotas
Bacterias: recombinan información genética. Se tienen 3 métodos importantes
Transducción: traspaso de información entre bacterias de la misma especie. Se da a
través de virus.
Virus constituido por ácidos nucleicos. El genoma viral se encuentra en distintas
formas. Hay algunos que tienen doble cadena o cadena simple de dna. Hay virus
que tienen información como arn.

Bacteriófagos importantes para realizar mapeos genéticos, son pequeños, manejabilidad

fácil.
Estructura de bacteriófago
Ciclo lítico: destruye a la bacteria
Ciclo lisogénico: no destruye a la bacteria. No mata a la célula, el material genético se
interna en el cromosoma bacteriano. El dna viral se transmite a sus células hijas. El dna
se replica

Errores:
En lugar de entrar dna a las bacterias, entra dna de la bacteria y se logra un virus
defectivo. Se forma un fago que tiene dna de la bacteria, no del virus

Traducción: transporte de información genética a través de un fago o virus

Transducción generalizada: un fago infecta a una bacteria. La bacteria es infectada por el

fago, empieza la lisis del cromosoma, se forman las cápsides y se autoensambla.
Se da una recombinación homóloga entre el fago y la bacteria.

La mayoría de la información genética en las bacterias se da por transformación:

por medio de pilis, que es como un contacto sexual. Los antibióticos generan
estrés en las bacterias. Es propensa a muchas mutaciones y estas, al azar, pueden
generar resistencia a antibióticos. Ese plásmido lo puede pasar a otro plásmido y
generar más resistencia.
Las bacterias no adquieren resistencia general a exposición.

La transducción especializada se da en el ciclo lisogénico, no en el lítico. Se da en una

porción del cromosoma.
Ej: fago lambda que se integra en una porción de la E.coli y se replica

Recombinación: se están mezclando materiales genéticos.

Transformación en bacterias:
El fin es la recombinación de los genes que se van a producir.
La bacteria y el dna receptor. Debe ser bicatenario, luego se hidroliza una cadena y se
tiene que la recombinación se da con una cadena.
Utilidad: mapear el genoma bacteriano. Lo que se mapea de una célula donante es para
ver la necesidad de nutrientes de la bacteria.

Secuencia del genoma bacteriano:

Los mapas génicos nos dan el contenido y la organización génica.
Mapea bacterias patógenas.
Resistencia a los antibióticos.

Conjugación bacteriana: se transmite información desde una célula donadora a una

receptora. Se da por pilis sexual, encargado de la transferencia.

Formas de transferencia:
Transposones: secuencias de dna que se transmiten a diversas partes del genoma
Integrones:

Conjugación bacteriana empieza cuando el extremo de dna que se separa del círculo

Resistencia a los antibióticos: dada por los plásmidos r. son los mismos microbios que
producen la resistencia hacia estos.

Transfección:
Adn externo en c. procariotas.

Conjunción: se transmite i genética x un virus

Transfección: i. genética a células eucariotas
Transducción: i. genética a procariotas.

Electroforación: crean poros en membrana plasmática para poder meter la información a

la célula.
Biobalística: partículas expedidas de oro o tungsteno. Se añade adn a estos y es
incorporado con calcio. Ingresan a la célula a través de la membrana
Microinyeeción: se incorpora directamente a la célula un material genético

Métodos químicos:
Lipofección: formación de lipososmas por afinidad a la membrana
Fosfatos de calcio: el cloruro de calcio y dna es mezclado y se le añade
directamente a la célula. Se forman agregados.

Adenovirus: infecciones respiratorias. Se le agrega gen de interés.

Retrovirus:

Transfección estable y transitoria

Estable: por lo general se logra cuando el gen de interés se integra al genoma de la
célula. Es heredable.

Transitoria: uso en laboratorios. De manera rápida. No se mete al genoma. Se usa

RNAm porque solamente crea la proteína. Si el RNA se destruye, se deja de crear la
proteína. Uso en antibióticos y hormonas.
TÉCNICAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
24/abril/2023
PARA LOCALIZAR LOS FRAGMENTOS ESPECÍFICOS DE DNA SE UTILIZAN DISTINTOS MÉTODOS.
LA ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NULEICOS:
Técnica analítica de separación de macromoléculas por campo eléctrico en relación carga-
masa.
Los ac. Nucleicos tienen carga negativa
La agarosa es polímero. Se ponen las muestras en estos polímeros y como el DNA está cargado
negativamente por el grupo fosfato, esta muestra se va del lado positivo del agar. Cuando el gel se
expone a luz UV se logra ver el DNA en esta. La posición del DNA depende del peso molecular de
este.

Sondas:
Segmentos de DNA o RNA de cadena sencilla marcados por moléculas reporteras:
Enzimas
Una vez que los segmentos se encuentran marcados, se usan para ver donde un ARNm se expresa
en una célula o tejido.
La especificidad de la síntesis depende del objetivo del estudio.

Después de esto, viene la desnaturalización, la hibridación y después la ubicación del cromosoma.

Las sondas son para utilizar la ventaja de que el DNA busca el espacio complementario. Si echamos
el DNA sintético (SONDA) en DNA natural, se va a pegar a este
El lado a es el agar normal y ahí se pone la muestra de DNA, la imagen B es cómo se
ve la muestra con la luz UV. Entre más abajo llegue la muestra, más chica es, menos
peso tiene
SOUTHERN BLOT
DETECTAMOS DNA
Analiza DNA digerido para ver la mezcla de un gen en DNA.
La desnaturalización y después la hibridación.
Pasos:
Extracción del DNA: preferentemente de linfocitos. Se puede obtener de cultivos
Digestión de DNA: se usan enzimas de restricción
Desnaturalización: por procesos fpisiscos o químicos. Cadenas más pequeñas
Transferencia: a soporte
SOUTHERN BLOT
DETECTAMOS DNA
Analiza DNA digerido para ver la mezcla de un gen en DNA.
La desnaturalización y después la hibridación.
Pasos:
Extracción del DNA: preferentemente de linfocitos. Se puede obtener de cultivos
Digestión de DNA: se usan enzimas de restricción
Desnaturalización: por procesos fpisiscos o químicos. Cadenas más pequeñas
Transferencia: a soporte
Utilización de sondas específicas: tienen moléculas marcadas y esta se pega a cadena
complementaria.
Identifica genes asociados a enfermedades genéticas. Polimorfismos.

NORTHERN BLOT
Contraparte del pasado. Se utiliza RNA en lugar de DNA. No enzimas de restricción.
Pasos:
Estracción
No er
Desnaturalización
Transferencia
Sondas
Estudia variacipnes de especies de RNA en diferentes condiciones experimentales o
comparaciones en condiciones normales o patológicas.
Western blot
Detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. Se una para usar las protes en
inmunohistoquímica.
Pasos:
Preparación:
Lisis química o procedimientos mecánicos. Los detergentes son iónicos, de carga 0 y
los no iónicos que no tienen carga
La elección del detergente se usa depende de la membrana
Los detergentes sirven para desnaturalizar proteínas. Se mete material genético. Lo que
queremos es que todas las proteínas de la célula se separen para que se puedan ir
clasificando por peso molecular.
Nativa: no iónico
Citoplasmático: tris
Mitocondiral: ripa
Lisis química: se solubiliza la membrana para ejar la proteína libre. Se liberan enzimas
proteasas que degradan la membrana. Hay reducción y desnaturalización. Se añade un
tampón tris: ac clorhídrico
El tris lo que hace es mantener el PH para ir a la electroforesis. El diodecil carga a las
cpelulas de manera negativa.
Electroforesis: se debe saber cuánta cantidad de proteína hay. Cuantifican las proteínas para
al momento de ponerla ahí se puede identificar. Se usa el método SDS page.
La electroforesis se ve por colores.
Hay un antígeno que se une a la proteína directamente. El wb identifica a la proteína
Transferencia
Inmunotinción: la membrana es adherente.
HIBRIDACIÓN: MICROARREGLOS, IN SITU , POR FLUORESCENCIA
PCR. TIPOS DE PCR
PCR FINAL: TIPOS DE PCR
Si estamos detectando dna se hace con sondas de dna que se pegue en este material.

Slot Blot
Una vez que se tenga el aislamiento y separación de los ac. Nucleicos, no se realiza la
electroforesis.
Tenemos detecciones cuantitativas mediante la utilización de patrones seriados.

Aplicación clínica:
VIH se usa la prueba ELISA que busca anticuerpos y se confirma con PCR o western Blot.

Utilización de sondas específicas: tienen moléculas marcadas y esta se pega a cadena

complementaria.
Identifica genes asociados a enfermedades genéticas. Polimorfismos.

NORTHERN BLOT
Contraparte del pasado. Se utiliza RNA en lugar de DNA. No enzimas de restricción.
Pasos:
Estracción
No er
Desnaturalización
Transferencia
Sondas
Estudia variacipnes de especies de RNA en diferentes condiciones experimentales o
comparaciones en condiciones normales o patológicas.
Western blot
Detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. Se una para usar las protes en
inmunohistoquímica.
Pasos:
Preparación:
Lisis química o procedimientos mecánicos. Los detergentes son iónicos, de carga 0 y
los no iónicos que no tienen carga
La elección del detergente se usa depende de la membrana
Los detergentes sirven para desnaturalizar proteínas. Se mete material genético. Lo que
queremos es que todas las proteínas de la célula se separen para que se puedan ir
clasificando por peso molecular.
Nativa: no iónico
Citoplasmático: tris
Mitocondiral: ripa
Lisis química: se solubiliza la membrana para ejar la proteína libre. Se liberan enzimas
proteasas que degradan la membrana. Hay reducción y desnaturalización. Se añade un
tampón tris: ac clorhídrico
El tris lo que hace es mantener el PH para ir a la electroforesis. El diodecil carga a las
cpelulas de manera negativa.
Electroforesis: se debe saber cuánta cantidad de proteína hay. Cuantifican las proteínas para
al momento de ponerla ahí se puede identificar. Se usa el método SDS page.
La electroforesis se ve por colores.
 Hay un antígeno que se une a la proteína directamente. El wb identifica a la proteína
Transferencia
Inmunotinción: la membrana es adherente.

HIBRIDACIÓN
28/abril/2023
Es la unión de dos moléculas monocatenarias de dos moléculas de ácidos nucleicos por
la complementariedad de las bases nitrogenadas originada por una cadena bicatenaria.
Hibridación: unión

1972

Técnica muy utilizada por su versatilidad:

Adn-adn
Arn-adn
Arn-arn
Aislar secuencias específicas, medir homología y medir las secuencias

Procesos que se basan en la hibridación de nucleótidos

Replicación y transcripción

Técnicas que se basan en la hibridación de nucleótidos

Southern, Northern, In-Situ, Microarreglos, PCR y secuenciación

Proceso de constrcución de ac nucleicos bicatenarios en el que dos secuencias de

ac.nucleicos se unen mediante el empleo de sondas marcadas.

Secuencia diana: secuencia concreta que se pretende encontrar en la secuencia

problema. Se hace por:
Sonda: cadena de ac nucleicos cuya secuencia de bases nitrogenadas es
complementaria a la secuencia diana.

El proceso de hibridación, secuencia diana y sonda:

Se basa en dos procesos:
Desnaturalización o separación: existencia de acidós nucleicos en adn. En arn se
encuentra una hélice intracatenaria. Intervienen factores como Ph y temperatura. Se
separan las dos cadenas.
Aumento de temperatura o ph (alcalino)-facilita el reconocimiento de la diana y la
sonda.

ZONA A: sin pendiente. Absorbancia a 260nm es constante. Corresponde a la

concentración de DNA en la temperatura. Desnaturalización al 0%

ZONA B: absorbancia aumenta cuando aumenta la temperatura. Alcanza el nivel de

absorbancia máxima. Aquí se desnaturaliza la molécula. Las dos cadenas se
separan. El aumento de absorbamcia mientras se desnauturaliza se conoce como
efecto hipercrómico.
 ZONA C: recta de pendiente nula. Absorbancia en valor máximo aunque aumente
temperatura. ADN desnaturalizado al 10%

A mayor concentración de guanina-citosina, mayor temperatura se requiere por la

cantidad de puentes de hidrógeno entre ellas.
La temperatura de fusión es la temperatura de desnaturalización bicatenaria es al
50%

Renaturalización de las moléculas bicatenarias: proceso por el cual dos cadenas de

DNA completamente separadas, se vuelven a asociar. 260nm
Si se aumenta la temperatura se separan, si se baja, se vuelven a juntar.
Para que dos cadenas complementarias se asocien, tiene que surgir un shock entre
ellas. A mayor concentración número de cadenas en la solución, mayor probabilidad
de que se encuentren cadenas complementarias-mayor velocidad de
renaturalización.
PCR
08/mayo/2023
El principio del pcr es porque a fuerza debe haber una plantilla
Los primers se pegan al dna por cierta fuerza, 2grados por cada guanina y citosina
y por cada adenina y timina se usan 4 grados
La temperatura de desnaturalización: se desbobla dna a 95 grados, rompimiento
genómico. Se mantiene por 5 miutos al inicio
2. Ciclo de amplificación:
a. Destruye doble cadena de dna
b. Extensión: a 72 grados
3. Amplificación final: 72 grados por 5 minutos. Se termina la extensión de los
productos
4. Almacenamiento temporal
La reacción en cadena de polimerasa se repite en muchas ocasiones.
Desnaturalización: se desnaturaliza a 95 grados centigrados. Deja expuestos a los
nucleótidos. Es una solución en caos. Hay dna de doble cadena
Si no hay temperatura correcta, puede dar falsos positivos.
Se sube a más de 95 grados, se desnaturaliza la polimerasa.
SECUENCIACIÓN DE DNA
26/mayo/2023
MAXAM-GILLBERT
Se basa en 4 pasos.
1. Marcaje en el extremo 5´de la hebra de DNA
2. Modificación de la base heterocíclica
3. Separación de la base modificada del azúcar
4. Escisión de la región abásica
Se identifica la secuencia de DNA a secuenciar. Enzimas de restricción que realizan el corte de la
cadena de DNA.
El marcaje se da por una alfa fostatasa alcalina que separa del extremo 5´de la cadena de DNA del
grupo fosfato
Desnaturalización de la cadena de DNA por aumento de la temperatura.
La modificación química de las bases es para obtener muchos fragmentos de DNA.

Electroforesis: marca al dna, los diferencia

SANGER
Dideoxynucleotido. Solo estos están marcados y detienen la cadena
Electroforesis estándar: se hacen 4 reacciones. Es una pcr normal pero se le agregan los
didoxynucleótidos. En estos, el extremo 3´ está oxidado y no se puede poner en gran cantidad. Se
ponen 90% de nucleótidos normales y 10% de los dideoxynucleótido.