Colegio El Valle Departamento de Biología

TEMA 16. EL ADN Y LA INGENIERÍA GENÉTICA.

DE LA BIOTECNOLOGÍA A LA INGENIERÍA GENÉTICA

Ingeniería genética: conjunto de métodos y técnicas que permiten el acceso y la manipulació n del
ADN.
Biotecnología: ciencia que utiliza a los organismos vivos o sus componentes en la obtenció n de
productos ú tiles para las personas.

1. OBTENCIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN.

1.1. Tecnología del ADN recombinante.

Técnica que permite cortar la molécula de ADN de un organismo en mú ltiples trozos y aislar
alguno de los fragmentos obtenidos para, mediante un vector, introducirlo en otro organismo.
Se desarrolló a partir del descubrimiento de las enzimas de restricción o endonucleasas de
restricció n, que reconocen pequeñ as bases secuenciadas, llamadas sitios de restricción, para
luego cortar las dos cadenas de nucleó tidos dentro de ese sitio, la mayoría de los cuales son
simétricos (secuencias palindró micas).
Las enzimas de restricció n se dividen dejando extremos lisos o extremos cohesivos o pegajosos,
que pueden unirse por puentes de hidró geno con una secuencia complementaria). Estas uniones
se pueden hacer permanentes en presencia de la enzima ligasa, dando lugar al ADN
recombinante o trasgén.

1.2. Formación de un ADN complementario por hibridación.

 Se desnaturaliza la hebra de ADN (pH > 13; Tª > 100°C).
 Se renaturalizan dos hebras manteniendolas a 65ºC. Las hebras pueden tener orígenes
distintos, siempre que exista una secuencia complementaria. Cuanto má s relacionados estén
los ADN, ,á s recombinació n se producirá .
Esta técnica se utiliza para detectar cadenas complementarias, localizar genes relacionados
en distintas poblaciones o diagnosticar enfermedades genéticas debidas a la alteració n de la
secuencia del ADN.

1.3. Síntesis de un ADNc utilizando como molde el ARNm.

Los ADN de eucariotas presentan intrones y exones, y el ARN que se transcribe es sometido a un
proceso de maduració n para eliminar los intrones. Esto no puede ocurrir en procariotas. Por ello,
a partir de un molde de ARN maduro se sintetiza un ADN de cadena sencilla, llamada ADN
complementario (ADNc). Se consigue gracias a la transcriptasa inversa. Este ADNc servirá
como molde para la síntesis de otro ADNc de doble cadena, sin intrones, y por lo tanto puede ser
traducido por bacterias.
 Se aisla un fragmento de ARNm maduro y se le añ ade un corto oligonucleó tido de timina que
hibrida con las adeninas de la cola poliA, y actú a como cebador de la transcriptasa inversa.
El ARNm actú a como molde para la síntesis de ADNc de cadena sencilla.
 Se sintetiza el ADN complementario, al que se añ ade una disolució n de NaOH que hidroliza el
ARNm. Se forma una horquilla en el ADNc, la cual sevirá como cebador para que la ADN
polimerasa I sintetice la segunda hebra de ADN.
 Se elimina la horquilla de replicació n con la nucleasa S1, que só lo actú a en zonas de cadena
sencilla. Finalmente se obtiene un ADNc de doble cadena.

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2. Clonación del ADN.

-‐ Permite la producció n de mú ltiples copias de un gen específico o de un fragmento de ADN en el
interior de un organismo que hace las veces de hospedador, el cual presenta las siguientes
características:
 Tener un crecimiento rá pido. Se obtienen muchas generaciones en poco tiempo.
 No ser pató geno, para que no produzca infecciones.
 Favorecer la entrada del trasgén en su interior e incorporar el gen de interés en su genoma.
 Ser un organismo ampliamente conocido y fá cilmente manipulable, como la bacteria
Escherichia coli.
-‐ Para incorporar el gen de interés en el hospedador se emplean vectores de clonación, que son
moléculas de ADN que transportan ADN extrañ o y se replican en el interior del hospedador. Todos
ellos deben tener su propio origen de replicació n y deben portar unos genes marcadores que sirvan
para ser identíficados fá cil y rá pidamente.
Los vectores má s utilizados son:
 Plásmidos.
 Virus bacteriófagos. Infectan bacterias, y transportan genes bacterianos de una célula a
otra, de forma que algú n gen de la bacteria huésped puede incorporarse al genoma del
bacterió fago, y al infectar a otra bacteria puede transferirle los genes de la primera. El má s
empleado es el bacterió fago lambda (), que puede llevar mayor cantidad de ADN que un
plá smido.
 Cósmicos. Son vectores híbridos entre el fago  y un plá smido, de manera que se ADN puede
replicarse en una célula como un plá smido, o puede empaquetarse como un fago. Tienen un
origen de replicació n plasmídico, genes marcadores que le dan resistencia a algunos
antibió ticos y sitios de restricció n donde puede insertarse el ADN forá neo. La ventaja de los
có smidos frente a los plá smidos es que la porció n de ADN forá neo que llevan puede ser
mucho mayor.
Clonación de un gen humano en un plásmido bacteriano.
A. Se inserta uno o má s genes marcadores en el plá smido que se utiliza como vector. Por
ejemplo, el gen amp (que da resistencia a la bacteria al antibió tico ampicilina) y el gen lacZ
(codifica la enzima -‐galactosidasa, que hidroliza lactosa y un compuesto llamado X-‐gal,
el cual sintetiza un compuesto de color azul).
B. Se aísla el ADN humano y el plá smido y se cortan con las mismas enzimas de restricció n. El
ADN humano se rompe en muchos fragmentos y el plá smido só lo en el gen lacZ, donde se
encuentra el sitio de restricció n.
C. Se mezclan los fragmentos de ADN humano con los plá smidos cortados. Como han sido
cortados con la misma enzima de restricció n, existen extremos cohesivos que hacen que se
unan por complementariedad de bases, dando lugar a los plá smidos recombinantes y muchos
otros no recombinantes.
D. Se mezclan los plá smidos con bacterias que portan una mutació n en el gen lacZ que les
impide hidrolizar la lactosa. Habrá bacterias que incorporen plá smidos recombinantes que
lleven el gen de interés. Otras incorporan plá smidos sin recombinar. Otras incorporan
plá smidos recombinantes con un ADN sin interés.
E. Se siembran las bacterias sobre una placa Petri con ampicilina y se incuban las bacterias
hasta hacerse visibles. Se apreciará n tres tipos de bacterias:
 Bacterias sin el plá smido recombinante. Mueren, ya que son sensibles a la ampicilina.
 Bacterias transformadas con plá smidos no recombinante. Crecerá n, ya que son
resistentes a la ampicilina. Ademá s sus colonias son azules debido a que presentan
actividad galactosidasa, y transforman la sustancia X-‐Gal en un compuesto de
color azul.
 Bacterias transformadas con plá smidos recombinantes. Crecen, puesto que son
resistentes a la ampicilina. Sus colonias son de color blanco, ya que no tienen actividad -‐
galactosidasa, ya que el gen lacZ está desactivado.

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-Almacenamiento de los genes clonados.

Genotecas: lugares donde se almacenan miles de clones que portan el gen de interés, mezclados con
otros miles que no lo llevan.

3. Identificación de clones mediante sondas.

Para localizar el ADN recombinante que lleva el gen de interés en una genoteca se utilizan sondas de
ADN. Las sondas son pequeñ os oligonucleó tidos de cadena sencilla, formados por unos 20
nucleó tidos que se hibridará n con cualquier ADN recombinante que tenga una secuencia de bases
complementaria.
-Selección de clones con una sonda de ácidos nucleicos.
1. Se transfieren las bacterias con los plá smidos recombinantes a una placa Petri para que
formen colonias visibles.
2. Se presiona la muestra con un filtro absorbente y las bacterias que forman los distintos
clones se transfieren a éste, obteniendo una imagen especular de las colonias, que a
continuació n será n numeradas.
3. Se trata el filtro de nitrocelulosa con un detergente para romper las membranas celulares y
que las células liberen su contenido, las moléculas de ADN se desnaturalicen y se unan
fuertemente a la nitrocelulosa.
4. El filtro se incuba con una sonda de ADN preparada específicamente para que se hibride
ú nicamente con los ADN recombinantes que hayan incorporado el gen de interés. El resto se
eliminan mediante lavado.
5. Se coloca el filtro debajo de una película fotográ fica que luego se revela. Quedará ennegrecida
en los lugares donde se ha producido la hibridació n.
6. Se compara la película revelada con la placa original, para así localizar las colonias
portadoras del gen de interés.

4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Técnica in vitro que permite obtener de forma rá pida un elevado nú mero de copias de un fragmento
pequeñ o de ADN.
Materiales necesarios:
 Muestra de ADN.
 Secuencia de nucleó tidos (cebador).
 Fuente de calor.
 ADN polimerasa resistente al calor.
 Nucleó tidos.
El proceso se desarrolla por ciclos:
1. Desnaturalizació n por calor de la doble cadena de ADN para separarla en dos hebras. Cada
hebra servirá de molde para formar una nueva cadena complementaria.
2. Hibridació n. Se enfría la muestra para permitir que los cebadores se unan mediante puentes
de hidró geno a cada uno de los extremos de las dos hebras de ADN.
3. Extensió n. Gracias a la ADN polimerasa se van agregando nucleó tidos en el extremo 3´ del
cebador y se forman las dos hebras nuevas.
- Aplicaciones de la PCR
 Fragmentos de ADN antiguos. Se ha amplificado el ADN de un mamut lanudo congelado que
vivió hace 40.000 añ os, para compararlos con genes semejantes de organismos actuales y
hecer estudios evolutivos. Otro ejemplo son las momias de antiguas civilizaciones, para
estudiar, por ejemplo, enfermedades genéticas.
 ADN obtenido en la escena de un crimen. Se recoge en pequeñ as cantidades de sangre,
tejidos, pelo o semen. Se aplica en medicina forense para identificar al autor de un delito.
 ADN de células embrionarias. Para diagnó sticos prenatales de trastornos genéticos.
 ADN de genes virales. Por ejemplo, el VIH.

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5. Secuenciación del ADN.

Técnica que permite conocer el orden de los nucleó tidos que forman parte, no só lo de un gen
concreto, sino también de los que forman el genoma completo de un organismo.
-Método didesoxi de Sanger.
Emplea didesoxirribonucleó tidos, que son nucleó tidos modificados que han perdido el grupo -‐OH
situado en el carbono 3´. Esto implica que la síntesis de ADN se detiene en ese nucleó tido concreto,
ya que la ADN polimerasa no puede añ adir otro debido a la ausencia del extremo 3´.
Materiales necesarios:
 Fragmento de ADN a secuenciar.
 Cebador o primer, formado por pocos nucleó tidos complementarios a los situados en el
extremo 3´de la cadena de ADN.
 ADN-‐polimerasa.
 Los cuatro desoxirribonucleó tidos
 Los cuatro didesoxirribonucleó tidos marcados con una molécula fluorescente, específica para
cada uno de ellos.
Proceso:
1. Aumentar la cantidad de ADN que queremos estudiar.
2. Desnaturalizar el ADN para separarla en dos cadenas simples que se incubanen tubos de
ensayo con el resto de componentes.
3. Se mezclan todos los componentes de la reacció n, formá ndose nuevas cadenas de ADN. La
síntesis comienza en el extremo 3´ del cebador. Se obtienen varias cadenas de ADN de
longitud variada que llevan en su extremo 5´ alguno de los nucleó tidos marcados con la
molécula fluorescente.
4. Se separan las cadenas marcadas al hacer pasar la muestra por un gel de poliacrilanina, de
manera que las má s cortas se mueven con mayor rapidez. Gracias a un detector de
fluorescencia se registra el color de cada marca fluorescente. El color de la marca indica qué
nucleó tido ocupa el extremo de la cadena de ADN.
5. Se obtiene un espectograma con una impresora, que al leerlo desde abajo hacia arriba nos
dará las bases complementarias de la cadena molde.

Este método de secuenciació n es ú til para secuenciar fragmentos de ADN de hasta 800 pares de
bases. Es un método muy rá pido que permite secuenciar unas 450 bases por hora.
Para secuenciar todo el genoma humano se necesitaron técnologías má s rá pidas.

GENÓMICA Y PROTEÓMICA.
 Genómica: conocimiento del genoma completo y las interacciones de sus genes.
- Identificació n de genes que codifican proteínas. Hay genes que no sé sabe que proteínas
codifican, denominados genes dudosos o genes candidaos. Para identificarlos se usan programas
de ordenador que rastrean señ ales de inicio y detenció n de transcripció n y traducció n, así como
lugares de corte y empalme en el ARN.
- Genes que interactú an entre sí. Para evaluar la expresió n de un genoma se utilizan los ensayos
de micromatrices de ADN, chips de ADN o microarray. Permite conocer mejor enfermedades
y elaborar técnicas de diagnó stico y terapia. Ejemplo: comparar tumores y tejidos no cancerosos.
1. Se aísla el ARNm de una muestra de tejido de un organismo.
2. Se sintetiza ADNc por transcripció n inversa con nucleó tidos marcados con fluorescente.
3. Se mezcla de ADNc con fragmentos de ADN procedentes del organismo en una micromatriz
para que se hibriden por complementariedad de bases.
4. Se elimina el ADN por lavado. Cada punto con fluorescencia representa un gen expresado de
la muestra de tejido.
- Comparació n entre genomas de diferentes especies. Permite establecer relaciones evolutivas

 Proteómica: disciplina que realiza un estudio sistemá tico del conjunto completo de proteínas
codificadas por el genoma de un organismo.
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INGENIERÍA GENÉTICA Y MEDICINA

A. Obtención de productos farmacéuticos.

La insulina, el interferó n, la hormona del crecimiento o el factor VIII de coagulació n son
proteínas que se producen en cantidades muy pequñ as, y actualmete se pueden fabricar
mediante ingeniería genéttica.
La insulina está formada por el polipéptido A y el B, y para producirlas hubo que
sintetizar, en primer lugar, los genes que expresan estas dos cadenas de polipéptidos A y
B. Los genes sinté ticos se insertan por separado y junto al gen que codifica la
-‐ galactosidasa, en plá smidos de E.coli, obteniéndose plá smidos recombinantes. Estos
plá smidos se insertan en distintas cepas de E.coli, donde se expresan y se forma una proteína
de fusió n muy estable, llamada -‐gal-‐insulina. Estas proteínas de fusió n se procesan
químicamente para separar los polipéptidos A y B, y tras una posterior renaturalizació n y
oxidació n de las cisteínas, se unen para obtener insulina activa.

B. Medicina forense.
Los humanos só lo diferimos en un 0,1%, y estas diferencias no se distribuyen al azar, sino
que se localizan en regiones cromosó micas concretas, pudiendo ser usadas como
marcadores genéticos. La identificació n de estas regiones hace que estas diferencias
actú en como huella genética que se utiliza en medicina forense y en pruebas de
paternidad.
Uno de los marcadores má s utilizados son las repeticiones cortas en tandem, que son
secuencias cortas de bases nitrogenadas que se repiten consecutivamente. Lo que
diferencia a las personas es el nú mero de repeticiones que hay en cada uno.
Para elaborar una huella genética se emplea un método denominado Southern blot, en el
que se comparan fragmentos de restricció n obtenidos a partir de muestras distintas de
ADN.
1. Si la muestra de ADN es pequeñ a, se amplifica con una PCR. Se corta con enzimas
de restricció n y se somete a una electroforesis en gelnpara separar los fragmentos
resultantes de la restricció n. Se va a obtener un patró n de bandas característico
que aú n no es visible.
2. Se aplica una solució n alcalina para desnaturalizar el ADN y transferir los
fragmentos de restricció n a una lá mina de papel de nitrocelulosa llamada blot.
3. El blot se introduce en una bolsa de plá stico sellada y se expone a sondas
radiactivas de ADN específicas para determinados marcadores genéticos. La
sonda se hibrida con los fragmentos de restricció n que lleven los marcadores, y
posteriormente se aplica sobre el blot una película fotográ fica en la que la
radiactividad de las sondas de ADN dejará una imagen que refleja las bandas
formadas por el ADN apareado con la sonda.

C. Diagnóstico de enfermedades.
Se pueden detectar los genes responsables de enfermedades genéticas como la anemia
falciforme, la hemofilia, la fibrosis quística o la enfermedad de Huntington. Para ello, se
clona el gen mediante PCR, se secuencia el producto amplificado y se determina la
mutació n causante de la enfermedad.
Las personas afectadas se pueden identificar incluso antes de nacer, e incluso se pueden
detectar los individuos portadores que no desarrollan la enfermedad.

D. Terapia génica.
Es una técnica terapéuticamediante la cual se inserta un gen funcional en las células de un
paciente humano para corregir un defecto genético o para dotar a las células de una
nueva funció n.

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Se emplea para curar enfermedades hereditarias y adquiridas, y en ambos casos deben

ser provocadas por un gen recesivo, descartando las que está n determinadas por muchos
genes o las producidas por alteraciones cromosó micas.
La terapia génica se puede aplicar a células germinales (se transmiten a la descendencia)
o a células somá ticas (no se transmiten a la descendencia). En el caso de la línea germinal,
está prohibida en la mayoría de países, ya que se plantean problemas éticos relacionados
con la modificació n del acervo génico de la especie humana y con la eugenesia, al
seleccionar artificialmente genes que confieran características especiales a sus
portadores.
La terapia génica en células somá ticaspuede realizarse de varias maneras:
 Ex vivo. Se extraen células del paciente, se corrige el defecto genético en el
laboratorio y se reintegran al organismo.
 In vivo. Los genes terapéuticos se transfieren directamente al paciente mediante
un vector, por ejemplo, mediante una inyecció n intravenosa.
 In situ. Se realiza directamente en las células del paciente, introduciendo los
genes funcionales edn el ó rgano afectado. Se usa en casos donde las células son
difíciles de extraer y de implantar posteriormente.
La terapia génica se empleó por primera vez con los niños burbuja, que está n afectados
por el síndrome de inmunodeficiencia combinada severa. Se debe a la deficiencia de una
enzima, la adenosín desaminasa, implicada en el metabolismo de laspurinas en células
madre de médula ó sea.

INGENIERÍA GENÉTICA Y AGRICULTURA

Desde siempre, el hombre ha intentado mejorar el rendimiento de los cultivos de distintas maneras,
como or ejemplo, seleccionando para la reproducció n, aquelloas plantas má s ú tiles, o aquellas que se
adaptan mejor a determinadas condiciones.
 Resistencia a herbicidas. El glifosato es un herbicida no selectivo que mata las plantas
debido a que inactiva una enzima implicada en el metabolismo de los aminoá cidos. El gen de
la resistencia al glifosato se obtuvo de cepas de E.coli resistentes, se clonó y se introdujo en
plantas, las cuales só lo sufrirían dañ os con concentraciones muy grandes de herbicida.
 Mejora del producto. Se puede mejorar el valor nutritivo de algunas plantas empleadas en la
alimentació n humana. Un ejemplo es el arroz transgénico, que produce granos amarillos
debido a que lleva beta-‐caroteno, que nuestro organismo utiliza para sintetizar vitamina
A. Este arroz podría ayudar a paliar el défict de vitamina A de muchas poblaciones que se
alimentan bá sicamente de arroz.
 Plantas farmacéuticas. Se usan para producir proteínas humanas para uso médico,
proteínas virales como vacunas o anticuerpos (planticuerpos). Resultan una ventaja frente
al cultivo de microorganismos, ya que es má s econó mico y ademá s las plantas tienen los
mecanismos adecuados para la fase postraduccional.

Obtención de plantas transgénicas

El vector de clonació n má s utilizado es el plá smido Ti, procedente de una bacteria del suelo,
Agrobacterium tumefaciens. Este plá smido posee un segmento llamado T-‐ADN que se integra en
el genoma del hospedador. Ambos son cortado por la misma enzima de restricció n, formá ndose
posteriormente plá smidos recombinantes, algunos de ellos con el gen de interés, que será n
introducidos en céluas vegetales, originando plantas transgénicas.

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INGENIERÍA GENÉTICA Y AMBIENTE

 Biorremediación. Algunas bacterias degradan la materia orgá nica. Mediante ingeniería

genética pueden ser modificadas para mejorar su rendimiento. Se utilizan en la limpieza de
vertidos de hidrocarburos.
 Bioadsorción. Bacterias genéticamente modificadas pueden adsorber (fijar en la superficie
celular) ciertos metales pesados que contaminan el suelo.

INGENIERÍA GENÉTICA Y GANADERÍA

Pretende crear ovejas que den má s lana o mejor calidad, animales que crezcan rá pidamente, que den
carne menos grasa, má s leche, etc.
También se obtienen sustancias de interés médico, como medicamentos y vacunas.
Se ha conseguido expresar el gen de interés junto a otro que promueve la síntesis de una proteína de
la leche. El producto ú nicamente se forma en las glá ndulas mamarias y se secreta a través de la leche,
de donde se extrae y purifica.
Ejemplo: Activador tisular del plasminó geno, el cual disuelve los trombos sanguíneos producidos en
los infartos de miocardio.
Ejemplo: Factor VIII de coagulació n, que se obtiene de células ová ricas del hamster chino y se emplea
para combatir la hemofilia.

Obtención de un animal transgénico portador de un gen de interés.

 Se extraen ó vulos de una hembra y se fertilizan in vitro.
 Se clona el gen de interés forá neo y posteriormente se inserta el ADN clonado directamente
en el nú cleo de los ó vulos fertilizados. Algunos ó vulos insertan el transgen en su genoma y
pueden expresarlo.
 Se implantan los embriones manipulados genéticamente en el ú tero de una madre sustituta
que parirá animales transgénicos que llevan en su dotació n genética un gen forá neo, incluso
de una especie distinta.
 Se obtiene leche de estos descendientes que contiene la proteína de interés.
 Se fraccionan y purifican las proteínas de la leche, obteniéndose entre ellas la proteína de
interés.

CLONACIÓN TERAPÉUTICA Y REPRODUCTIVA EN ANIMALES

 La clonación terapéutica consiste en la creacció n de embriones, por clonació n, para
utilizarlos como materia prima en distintas terapias.
 La clonación reproductiva consigue nimales genéticamente idénticos a partir de una célula
adulta. El método má s utilizado es la transferencia nuclear.

Clonación d animales por transferencia nuclear

 Se obtiene una célula somá tica del individuo que se quiere clonar.
 Se extrae un ó vulo de una hembra donante y se elimina el nú cleo.
 Se reemplaza este nú cleo por el de la célula somá tica.
 Se desarrolla la célula creada hasta formar un embrió n.
 Se implanta en el ú tero de una hembra de la misma especie, donde culmina su desarrollo.

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PROYECTO GENOMA HUMANO.

1. Situar genes y marcadores moleculares en mapas genéticos de alta resolució n de cada
cromosoma. Este tipo de mapas permite el ordenamiento relativo de genes u otro tipo de
secuencia identificable en el ADN.
2. Caracterizar y localizar físicamente fragmentos de ADN clonados para crear así mapas físicos
de cada cromosoma, que se elaboran cortando el ADN en fragmentos de restricció n para
luego determinar su orden en el ADN cromosó mico.
3. Secuenciar los pequeñ os fragmentos en los que se ha cortado el ADN para luego ensamblarlos
y obtener la secuencia genó mica completa, generando un mapa completo de secuencias de
cada cromosoma.

Las características principales del proyecto son:

 El ser humano posee de 20.000 a 25.000 genescodificadores de proteínas. Má s del 40% de los
genes no tiene funció n conocida.
 Los seres humanos son idénticos en un 99,9% de los genes.
 La mayor parte de estas diferencias se localizan en los polimorfismos de un único
nucleótido, que son variaciones que só lo afectan a un par de basaes nitrogenadas.
 El ADN no codificante, que es la mayor parte del genoma, se llama ADN basura, porque se
creyó que no tenía ninguna funció n. Actualmente se cree que regula la expresió n diferencial
de los genes, como la capacidad de agarrar y manipular objetos.