2.2.

2 Vectores plasmídicos
Los plásmidos son moléculas de ADN bicatenarias, extracromosómicas,
autorreplicantes, que a menudo se encuentran en bacterias y algunos eucariotas
inferiores. La mayoría son circulares, pero hay algunas lineales. No son esenciales para
el crecimiento, pero confieren algunas propiedades inusuales a las células que las
albergan. Los plásmidos que confieren propiedades inusuales son grandes (peso
molecular promedio, 65 × 106) y generalmente existen en una o dos copias por
cromosoma bacteriano en la célula. La purificación de tales plásmidos grandes es difícil
y los rendimientos son generalmente pobres. Estas moléculas son transmisibles; es
decir, tienen la capacidad de transferirse durante la conjugación (por ejemplo, el factor
F y el factor R discutidos anteriormente).
Otros plásmidos inusuales son los plásmidos tol en Pseudomonas sp., Y los plásmidos
nod en Rhizobium, donde degradan el tolueno, y las bacterias Rhizobium, donde fijan el
nitrógeno y forman asociaciones simbióticas con las plantas leguminosas. Sin embargo,
también existen pequeños plásmidos de muchos otros tipos (<10 kb); No suelen ser
transmisibles, pero confieren un fenotipo simple a la bacteria huésped. Tales plásmidos
con frecuencia existen en más de 10 copias (generalmente 20 40) por cromosoma
bacteriano y pueden purificarse fácilmente. Un requisito previo esencial para una
aplicación práctica exitosa de la manipulación génica es la disponibilidad de un vector
adecuado, que garantice la replicación y el mantenimiento tanto del ADN del vector
como del ADN extraño integrado.
Un vector útil para la clonación debe tener (i) un origen de replicación en el plásmido
(es decir, una secuencia de nucleótidos que dirige y regula la replicación para que cada
célula contenga un número razonablemente consistente de copias de plásmido), (ii)
marcadores auxotróficos o fenotípicos seleccionables para facilitar la identificación de
insertos aparte de los genes de resistencia a antibióticos clásicos, (iii) genes marcadores
con sitios de restricción únicos para una o más endonucleasas de restricción diferentes,
y (iv) plásmidos de menor peso molecular posible, porque el bajo peso molecular
normalmente está acompañado por un alto número de copias, y debido a que esta
propiedad ayuda al material a evitar daños por fuerzas de corte durante la preparación.
Los vectores de clonación sirven principalmente para amplificar ADN extraño en la
célula huésped, es decir, para inducir un gran aumento en la relación de plásmido a
ADN cromosómico. Con ciertos plásmidos, el número de copias por célula puede
incrementarse mediante el crecimiento en presencia de antibióticos, que inhiben la
replicación del genoma del huésped sin afectar la replicación del plásmido. De esta
manera, los plásmidos recombinantes a menudo se pueden producir en hasta 1000
copias por célula. Se han desarrollado dos clases diferentes de vectores plásmidos y
bacteriófagos para clonar ADN, especialmente en E. coli. El vector de clonación más
conocido es probablemente el plásmido bacteriano pBR322, que fue creado
artificialmente mediante el uso de diferentes partes de ciertos plásmidos naturales. El
plásmido pBR322 se construyó usando el plásmido Col EI (que mata otras cepas de E.
coli pero es resistente a Colicin EI) uniendo dos fragmentos de ADN que confieren
resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina, respectivamente. El nuevo
plásmido pBR322 (4.3 kb) es fácil de usar porque al incluir cualquiera de los
antibióticos en los medios de crecimiento, solo pueden crecer las bacterias que
contienen pBR322. El plásmido pBR322 tiene otra característica importante. Contiene
dentro de los genes para sitios únicos de resistencia a antibióticos reconocidos por las
enzimas de restricción HindIII, BamHI, PstI y SalI. Por lo tanto, la inserción de un
fragmento de ADN en cualquiera de estos sitios interrumpirá la secuencia de
codificación, dando como resultado la inactivación del gen.
El principio de clonación génica utilizando el plásmido pBR322 de E. coli se describe
en la figura 2.10. Por ejemplo, la inserción de un fragmento en el sitio BamHI inactiva
la resistencia a la tetraciclina e induce sensibilidad a la tetraciclina; Sin embargo, las
bacterias transformadas por dicho plásmido todavía se pueden detectar porque son
resistentes a la ampicilina. Por lo tanto, las colonias que tienen plásmidos con insertos
de ADN pueden detectarse mediante pruebas de resistencia a la ampicilina (ApR) y
sensibilidad a la tetraciclina (TcS), respectivamente. Las inserciones de longitud
variable, hasta un límite superior de pares de 15 kb, pueden clonarse en pBR322 y
vectores plasmídicos relacionados.
Los nuevos vectores modificados tales como los vectores pUC (pUC18 y pUC19)
tienen los genes para la resistencia a la ampicilina y para la β galactosidasa (lacZ) de E.
coli (figura 2.11). El gen lacZ tiene una serie de sitios de restricción únicos diseñados en
el plásmido para que el plásmido pueda cortarse solo dentro del gen lacZ. Si estos
plásmidos se transforman en una cepa lacZ-de E. coli, se convertirán en lac +. Si estas
colonias se cultivan en placas X-gal (X-gal es el sustrato histoquímico 5-bromo-4-cloro-
3-indolil-β-D-galactopiranosido), las colonias aparecerán azules como resultado de la
hidrólisis de X -galón.
Cualquier plásmido que tenga un fragmento de ADN insertado carecerá de un gen lacZ
funcional, produciendo colonias blancas en las placas X-gal. Estas colonias blancas que
contienen un inserto de ADN clonado pueden identificarse a partir de un fondo de
colonias azules. El ADN clonado en un vector puede purificarse y analizarse mediante
electroforesis en gel de agarosa.
El bacteriófago lambda se ha desarrollado ampliamente como un vector de clonación.
Los cósmidos son plásmidos que contienen la región Cos del fago, lo que hace posible
que el plásmido sea empaquetado dentro de partículas bacteriófagas y, por lo tanto,
transferido por infección a E. coli. Los cósmidos son una excelente herramienta para
clonar un gran fragmento de ADN (32–47 kb), del tamaño normalmente requerido para
el establecimiento de las llamadas bibliotecas genómicas. El colífago M13, que tiene
una organización del genoma y un ciclo de vida completamente diferentes, se ha
desarrollado como un vehículo de clonación. M13 es un bacteriófago en forma de barra
que contiene un genoma de ADN monocatenario dentro de una capa de proteína viral.
Cuando M13 infecta una célula susceptible, el ADN viral (o cadena) de cadena sencilla
se convierte en una forma de replicación de cadena doble, que amplifica hasta 300
copias por célula. M13 ha sido muy útil, particularmente para la secuenciación del ADN
y la mutagénesis dirigida al sitio para caracterizar los ADN clonados.
Los vectores de expresión contienen no solo el gen extraño sino también secuencias
promotoras, operadoras y terminadoras, que permiten la transcripción eficiente del gen
en ARNm. Los vectores de expresión también contienen el sitio de unión al ribosoma,
que es necesario para una traducción eficiente. Para replicarse en la célula huésped, un
vector debe contener el origen apropiado del sitio de replicación (ori). Los vectores que
contienen ori de dos sistemas huésped separados capaces de replicarse en ambos
vectores se denominan vectores lanzadera. Se conocen ejemplos de E. coli y B. subtilis,
así como de Saccharomyces cerevisiae. Estos vectores pueden clonar un fragmento de
ADN deseado en bacterias y luego, después de la purificación, transformarse en las
células eucariotas apropiadas. Algunos ejemplos de diferentes vectores y sus
propiedades se dan en la Tabla 2.3
Los cósmidos, que son vectores construidos con características de plásmidos y fagos,
incluyen (i) una secuencia de E. coli ori, (ii) un marcador seleccionable como ampR,
(iii) sitios de restricción convenientes y (iv) un sitio de fagos cos, permitiendo que el
ADN se empaquete en una cabeza de fago para su introducción en E. coli. Hay
disponibles cósmidos tan pequeños como 5 kb, y se pueden insertar 32–47 kb de ADN
en ellos. Los cósmidos recombinantes <37 kb o> 52 kb no se pueden empaquetar y no
entran en E. coli, y por lo tanto no se replican. Un vector de clonación capaz de
replicarse en dos o más tipos de organismos (por ejemplo, E. coli y levadura o E. coli y
bacterias de ácido láctico) se denomina vector lanzadera. Los vectores lanzadera pueden
replicarse de forma autónoma en ambos hosts, o integrarse en el genoma del huésped.
Los vectores de cromosomas artificiales de levadura (YAC) funcionan como
cromosomas artificiales en levadura. Sus características incluyen (i) estructura lineal
con un telómero de levadura (TEL) en cada extremo, (ii) una secuencia de centrómero
de levadura (CEN), (iii) un gen marcador en cada brazo que se puede seleccionar en
levadura (por ejemplo, TRP1 y URA3 ), (iv) un origen de replicación de levadura
conocido como secuencia de replicación autónoma (ARS), y (v) sitios de restricción
únicos para insertar ADN extraño. Varios cientos de kb de ADN inserto se pueden
clonar en un YAC. Los clones YAC se hacen (i) generando brazos YAC mediante
digestión de restricción, (ii) ligando con fragmentos de inserto de hasta 500 kb de
longitud, (iii) transformando en levadura y (iv) seleccionando marcadores (por ejemplo,
TRP1 y URA3). Los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) también se usan para
clonar fragmentos de hasta aproximadamente 200 kb en E. coli. Los vectores BAC
contienen (i) el ori de un plásmido de E. coli llamado factor F, (ii) múltiples sitios de
clonación, (iii) un marcador seleccionable y (iv) otras características, "campanas y
silbatos". BAC puede manejarse como plásmidos bacterianos normales, pero el factor F
ori mantiene el número de copias en una molécula de BAC por célula.

Resumen
Los plásmidos son moléculas de ADN bicatenarias, extracromosómicas,
autorreplicantes, que se encuentran en bacterias y eucariotas , confieren propiedades
inusuales a las células que los contienen, por lo general estos plásmidos son de tamaños
grandes y su purificación es difícil, pero también existen pequeños plásmidos que
confieren un fenotipo simple a la bacteria huésped y pueden purificarse fácilmente.
Para garantizar una eficacia en la manipulación génica se debe disponer de un vector
adecuado, por lo cual debe cumplir con las siguientes características :un origen de
replicación en el plásmido (contener series de nucleótidos que granicen la replicación) ,
marcadores auxotróficos o fenotípicos seleccionables para facilitar la identificación de
insertos aparte de los genes de resistencia a antibióticos clásicos, genes marcadores con
sitios de restricción únicos para una o más endonucleasas de restricción diferentes, y
plásmidos de menor peso molecular posible, ya que estos están acompañados de un alto
número de copias, por lo que esta propiedad ayuda al material a evitar daños por
fuerzas de corte durante la preparación.
Se han desarrollado dos clases diferentes de vectores plásmidos y bacteriófagos para
clonar ADN, en E. coli .El vector de clonación es el plásmido bacteriano pBR322, se
construyó usando el plásmido Col EI uniendo dos fragmentos de ADN que confieren
resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina, respectivamente. El nuevo
plásmido pBR322 (4.3 kb) es fácil de usar porque al incluir cualquiera de los
antibióticos en los medios de crecimiento, solo pueden crecer las bacterias que
contienen pBR322, además este plásmido contiene dentro de los genes sitios únicos de
resistencia a antibióticos reconocidos por las enzimas de restricción HindIII, BamHI,
PstI y SalI. Por lo tanto, la inserción de un fragmento de ADN en cualquiera de estos
sitios interrumpirá la secuencia de codificación, dando como resultado la inactivación
del gen. Existen nuevos vectores modificados como los vectores pUC (pUC18 y
pUC19) los cuales tienen los genes para la resistencia a la ampicilina y para la β
galactosidasa (lacZ) de E. coli.
El bacteriófago lambda se ha desarrollado ampliamente como un vector de clonación.
Los cósmidos son una excelente herramienta para clonar un gran fragmento de ADN
(32–47 kb).El colífago M13, que tiene una organización del genoma y un ciclo de vida
completamente diferentes, se ha desarrollado como un vehículo de clonación, ha sido
muy útil, particularmente para la secuenciación del ADN y la mutagénesis dirigida al
sitio para caracterizar los ADN clonados.
Los vectores de expresión contienen no solo el gen extraño sino también secuencias
promotoras, operadoras y terminadoras, que permiten la transcripción eficiente del gen
en ARNm, además contienen el sitio de unión al ribosoma, que es necesario para una
traducción eficiente. Para replicarse en la célula huésped, un vector debe contener el
origen apropiado del sitio de replicación (ori). Estos vectores pueden clonar un
fragmento de ADN deseado en bacterias y luego, después de la purificación,
transformarse en las células eucariotas apropiadas. Un vector de clonación capaz de
replicarse en dos o más tipos de organismos se denomina vector lanzadera. ). Los
cromosomas artificiales bacterianos (BAC) también se usan para clonar fragmentos de
hasta aproximadamente 200 kb.