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Aplicaciones de las tcnicas del ADN recombinante

1. Biotecnologa
Produccin de protenas recombinantes para estudios de investigacin bsica y
para su aplicacin en diversos campos (hormonas, anticuerpos, antivirales,
vacunas, enzimas hidrolticas, polmeros)
Obtencin de organismos transgnicos (transformados) con propiedades
particulares
2. Medicina. Diagnstico de enfermedades infecciosas y genticas. Terapia gnica.
Medicina forense.
4. Ecologa microbiana. Determinacin de la biodiversidad. Deteccin de
microorganismos no cultivables. Estudio composicin y funcin de comunidades
(metagenmica)
5. Evolucin. Estudio de las relaciones filogenticas entre organismos (comparacin
de secuencias nt de genes universalmente conservados. Ej. ARNr 16S y 18S.
Anlisis de genomas.

Las tcnicas de ADN recombinante permiten desplazarse experimentalmente


desde el gen a la protena y desde la protena al gen

Clonado de genes

Aislamiento y amplificacin de un gen de inters para su posterior manipulacin


gentica
Pasos:
1. Aislamiento y fragmentacin de la fuente de ADN: ADN genmico, ADN copia,
producto de PCR.
2. Insercin en vector de clonado
3. Introduccin y amplificacin en organismo husped
4. Identificacin del gen de inters

Enzimas de restriccin (ER)


Son enzimas (endonucleasas) de origen bacteriano que reconocen y cortan secuencias
especficas (4-8 pb) en el ADN doble cadena.
Pueden dejar extremos romos (blunt ends) o con cohesivos con extremos 3 o 5 de cadena
simple (overhangs)

Vectores de clonado
Deben contener ori (replicacin autnoma) y
marcador de seleccin (ej. resistencia a un
antibitico).
Los plsmidos son muy usados
Poseen secuencia con sitios de reconocimiento
para varias ER (sitio mltiple de clonado o
polylinker)
Permiten amplificar un fragmento de ADN
exgeno (inserto).

Ligacin de un fragmento de ADN


(inserto) a un vector

Tratamiento del vector con fosfatasa alcalina para evitar religacin del vector

Se puede clonar un gen especfico a partir de :

- Amplificacin por PCR, cuando se conocen las secuencias genmicas


del organismo.
- Una genoteca

Obtencin de clones
genmicos o de ADNc
por PCR

Genotecas
Coleccin de secuencias de ADN individuales que representan todo o parte del
genoma de un organismo.
- Genotecas de ADN copia (ADNc)
Incluye los genes expresados en un organismo.
No posee intrones.
Se generan a partir de ARN total.

- Genotecas de ADN genmico (ADNg)


Generadas a partir de ADNg de un organismo.
Posee intrones (eucariotas) y secuencias regulatorias

Construccin de una
genoteca a partir de
ADN genmico.

Colonias de bacterias
recombinantes

Bacterifagos: Fago

Los vectores construdos a partir del fago


son ms eficientes que los plsmidos para
clonar grandes cantidades de fragmentos
de ADN y de mayor tamao (~hasta 25
kpb). Se usan para construir genotecas.

Construccin y anlisis de una genoteca de cADN

Diseo de una sonda para detectar el gen de una protena conocida por
hibridacin

Las genotecas pueden analizarse mediante hibridizacin con sondas de


oligonucletidos

Manipulacin del gen clonado para:


1. Producir grandes cantidades de la protena para estudios bioqumicos
y/o estructurales

2. Modificacin del gen (mutagnesis) e introduccin en clulas u


organismos para estudiar la funcin

Expresin heterloga de protenas recombinantes


En bacterias. E. coli
Ventajas:
- Fisiologa y gentica muy conocida
- Fcil manipulacin en laboratorio
- Relativo bajo costo

Desventajas:
- No produce muchas de las
modificaciones post-traduccionales
requeridas para la expresin de
protenas de eucariotas.
- La protena puede resultar txica
- La protena mal plegada puede
formar cuerpos de inclusin
insolubles.

Elementos tpicos de un vector de expresin bacteriano


Deben tener:
-Un promotor fuerte (alto nivel
expresin del ARNm), generalmente
regulable (la protena expresada
puede resultar txica para la
bacteria)
- Un terminador transcripcional
- Un sitio de unin al ribosoma
cercano al AUG iniciador

Anlisis de la expresin de una protena recombinante producida en E. coli


SDS-PAGE y tincin con azul de Coomassie de las protenas celulares (C) y del medio
de cultivo (M) de E. coli recombinante conteniendo el plsmido pET-nepHis6

Vector de expresin que contiene 6 codones para His


(poli His6) en el extremo 5permite generar una protena
de fusin (X-His6) clonando el inserto en el mismo
marco de lectura. Facilita la purificacin e identificacin
de la protena recombinante, ya que se puede purificar
en columnas de afinidad con Ni 2+ y detectar en Western
blots con anticuerpos anti-His.
EK: sitio de clivaje para proteasa libera His6 de X-His6
MCS: sitio mltiple de clonado

Protenas recombinantes usadas en Medicina

Expresin de protenas heterlogas en clulas eucariotas


Pasos:
1. Clonar el gen de inters en E. coli usando vectores verstiles o lanzadera
-shuttle vectors- (capaces de replicarse en dos huspedes diferentes).
2. Transferir el plsmido a la clula eucariota de eleccin (levaduras, clulas
animales, clulas de plantas)

Transfeccin. Amplificacin de genes clonados en clulas animales

Vectores plasmdicos usados en clulas animales

Transfeccin transitoria
Durante la divisin celular los plsmidos no son segregados correctamente en las clulas
hijas y con el tiempo algunas pierden el plsmido.

Para clulas de mamfero, el vector


lleva:
- ori replicacin viral
- Promotor fuerte
- ADNc clonado adyacente al promotor

Transfeccin estable (transformacin)


El vector se integra al genoma de la clula husped en forma permanente, se dice que la clula
est transformada.
El vector lleva gen marcador para diferenciar clulas que han integrado el vector (neor)

Aplicacin de las tcnicas del ADN recombinante en las plantas


Hace posible alterar el perfil nutricional, rendimientos de la cosecha, resistencia a
estreses ambientales
Introduccin de genes en plantas mediante infeccin con Agrobacterium tumefaciens
A. tumefaciens es una bacteria patgena de plantas dicotiledneas que transfiere ADN
(ADN-T) a partir del plsmido Ti (tumor inducing) a las plantas, causando la formacin de
tumores.

vir: genes de virulencia


25 bp repeats: necesarias para la integracin de TADN

Estrategia con dos plsmidos para crear


plantas recombinantes (transgnicas)
a. Se saca el ADN-T del plsmido Ti, se dejan los
genes vir necesarios para la transferencia de ADN
desde la bacteria a la planta.
b. En otro plsmido se clona el gen de inters
dowstream del promotor del T-DNA (promotor
fuerte) y un gen de seleccin (Kanr), flanqueados
por los 25 pb del ADN-T, importantes para la
transferencia del ADN. Posee ori para replicacin
en la bacteria.

Plantas de tomate modificadas resistentes a


larvas de insectos (expresan gen de toxina de
Bacillus turingensis)

Clonado en clulas animales


Se realiza sobre cultivos de clulas. La transformacin generalmente requiere la integracin
del ADN en el cromosoma del husped.
Mtodos de transformacin:
- Electroporacin
- Microinyeccin. Inyeccin de ADN en el ncleo de clulas con una aguja fina
- Liposomas
- Vectores virales (retrovirus, adenovirus). Se integran en el cromosoma del husped

Se introdujo el gen de la hormona de crecimiento humana


en el genoma del ratn bajo el control de un promotor
regulable. Cuando se aliment con dieta + inductor los
ratones transgnicos crecieron a un tamao inusual.

Creacin de ratones transgnicos

Terapia gnica
Es una tcnica para reemplazar un gen
deficiente por uno normal en individuos
con enfermedades genticas
Surge de la investigacin con animales
transgnicos.

Protocolo para TG ex vivo en


humanos

Algunas aplicaciones de la tcnica de PCR

Deteccin de la presencia de un genoma viral en una muestra de


sangre por PCR

Muy alta sensibilidad para detectar patgenos (virus, bacterias) en


muestras humanas

La tcnica de PCR se utiliza en la ciencia forense


A. Las secuencias de ADN
usadas son repeticiones
cortas en tandem (short
tandem repeats, STR)
ej. CACACAo
GTGTGT, que estn
en varias posiciones
(loci) en el genoma
humano. El n de
repeticiones en cada
STR es variable en la
poblacin. Dos
individuos no
relacionados no suelen
contener el mismo par
de secuencias.
B. Obtencin de Huella
gentica amplificando
por PCR varios STR ( a
partir de muestra de
sangre, pelo). Sirve
para identificar
individuos
potencialmente
sospechosos de
cometer delito o de
paternidad.