TEMA 5.

MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: TECNOLOGÍAS PARA EL

ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA Y EXPRESIÓN DE GENES Y GENOMAS

1.Genómica

La genómica es el estudio integral de genomas completos.

Genómica estructural: contenido y organización de la información de genomas completos.

Genómica funcional: función de los genes y de su regulación a través de la caracterización del

conjunto completo de los transcritos (transcriptoma), proteínas cifradas del genoma
(proteoma), etc.

2. TÉCNICAS PARA ANALIZAR LA ESTRUCTURA DE GENES Y GENOMAS

2.1. Análisis de genes concretos: PCR

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) es una técnica que permite generar múltiples
copias de una secuencia específica de nucleótidos.

Se va a utilizar un DNA molde que puede ser todo lo grande que queramos, y esta técnica nos
permite obtener una ampliación, muchas copias de un fragmento pequeñito concreto. Esta
reacción está basada en la polimerización del DNA, es decir, en la replicación (in vitro) del DNA.

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2.1.1. Componentes de la reacción de PCR

Requiere añadir al tubo todos los siguientes componentes:

- DNA molde
- Cebadores (2 cebadores que van a marcar el fragmento de DNA que va a ser
amplificado): oligonucleótidos
- Polimerasa de DNA termoestable (ej. Taq). La polimerasa humana no es termoestable,
se desnaturaliza a temperaturas altas (95 ºC). La termoestable a 95ºC no va a funcionar
(temperatura óptima 70 ºC) pero no se va a desnaturalizar irreversiblemente.
- Desoxinucleótidos trifosfato (dTTP, dATP, dCTP y dGTP)
- Sustancias tamponadoras (incl. Iones Mg2+)

2.1.2. Pasos en cada ciclo de la reacción PCR

Los tres pasos de cada ciclo son:

1. Desnaturalización. Aumento mucho la temperatura y el DNA se va a desnaturalizar

quedando en forma de cadena sencilla.
2. Bajo la temperatura a una óptima para la hibridación de los cebadores (de cadena
sencilla), es decir, que estos encuentres secuencias homólogas y se unan.
3. La taq. Polimerasa tiene ahora todo lo que necesita para polimerizar, tiene un extremo
3’-OH, un molde, y cebadores, por lo que la polimerasa va a ir polimerizando las cadenas
hasta el sitio donde ha hibridado el otro cebador. Estos dos cebadores tienen que unirse
cada uno de ellos a una de las dos hebras de ADN (el verde a una y el morado a otra),
de tal forma que los extremos 3’ estén enfrentados. Esto es lo que va a hacer que cuando
el primer cebador se extienda llegue hasta el otro y lo mismo con el segundo.

Este ciclo de 3 pasos lo voy a repetir de forma continua hasta aprox unas 30 veces, aunque puede
variar con el experimento.

Esto se realiza en un termociclador, donde se ponen los tubos con los componentes y programo
los 30 ciclos (que haga 95ºC, 60, 72…y así cada vez).

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2.1.3. Amplificación de DNA in vitro: PCR

En el primer ciclo se separan las hebras, se unen los cebadores y se alarga. En un segundo ciclo
las cadenas que se acaba de sintetizar en el primero se vuelven a desnaturalizar y vuelve a ocurrir
lo mismo. Las cadenas que se están sintetizando en un ciclo sirven como molde para el ciclo
siguiente.

Al cabo del ciclo 35 tengo 235 moléculas = 34.359.738.368

2.2. Análisis de genes concretos: clonación

Cuando quiero hacer una amplificación de DNA puedo hacerlo in vitro (PCR) o in vivo, para que
el organismo produzca en grandes cantidades la molécula de DNA que me interesa.

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Necesito tener el DNA en un tamaño adecuado, empleando o bien una enzima de restricción
que corte el DNA o mediante una PCR.

Para conseguir una buena amplificación necesito utilizar un vector, que suelen ser plásmidos
(aunque también se pueden utilizar bacteriófagos). A continuación, hay que introducir la
construcción en células hospedadoras (E. coli).

2.2.1. Enzimas de restricción (restrictasas)

Las enzimas de restricción son enzimas capaces de hacer un corte en la doble cadena de DNA
cuando reconocen una secuencia específica o secuencia diana.

Son herramientas esenciales en ingeniería genética.

Cuando la enzima corta la doble cadena no siempre realiza el corte exactamente en frente en
las dos hebras.Esto genera extremos que pueden ser:

- Extremos protuberantes 5’
- Extremos protuberantes 3’
- Extremos romos

Secuencias palindrómicas: cuando se pueden leer igual en la cadena 5’->3’ que en 3’->5’

2.2.2. Plásmidos como vectores de clonación

PLÁSMIDOS: moléculas de DNA “extracromosómico”, bicatenario y circular, con autonomía

replicativa.

Para que un plásmido pueda ser utilizado como vector de clonación tiene que tener:

- Origen de replicación (que sea reconocido por las células de E.coli)

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 - Marcador seleccionable: permite distinguir entre células que tienen el plásmido y entre
células que no lo tienen. Como marcador se suele utilizar un gen que confiere para
resistencia a un antibiótico concreto.
- Sitio de clonación múltiple (o polylinker): pequeño fragmento de DNA (parte del vector)
que contiene sitios de corte únicos para varias enzimas de restricción.

Experimento: consiste en tener un vector y un inserto (DNA) que los voy a digerir a cada uno con
la misma enzima de restricción (para que los extremos obtenidos sean compatibles) y, a
continuación, los voy a poner en contacto uno con el otro con la enzima DNA ligasa, obteniendo
un plásmido recombinado que contiene el inserto.

La molécula de DNA recombinante obtenida, si la quiero amplificar, tengo que introducirla en

las células hospedadoras (células de E.coli).

Estas células de E. coli son capaces de incorporar un DNA que está en el medio. Cada célula tiene
que incorporar un solo plásmido (es muy muy poco frecuente que se metan 2 plásmidos en la
misma célula). Una vez incorporado este plásmido va a comenzar a replicarse y cada vez que
esta célula se divida sus células hijas van a presentar este plásmido.

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2.2.3. Marcador seleccionable / origen de replicación

La incorporación del plásmido dentro de la célula es un suceso muy poco frecuente. Para
eliminar aquellas células que no han incorporado plásmido utilizo el marcador seleccionable,
pues estas no van a poder crecer en presencia del antibiótico.

2.2.4. Plásmidos como vectores de clonación

Los experimentos de clonación se pueden realizar con 1 o con 2 enzimas de restricción:

Con 1: cuando el vector lo digiero con la enzima convierto una molécula circular en lineal
(plásmido) con los extremos cohesivos para el inserto y el inserto con los extremos cohesivos
para el DNA. Pero estos extremos cohesivos del vector se pueden unir entre ellos mismos dando
lugar a un vector autoligado. Además, cuando el inserto se une al vector lo puede hacer en dos
orientaciones distintas.

Con 2: el vector no se puede autoligar porque sus extremos no son cohesivos entre ellos y,
además, solo tengo una posibilidad de inserción del inserto en el plásmido.

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Para poder distinguir entre un vector “autoligado” y un plásmido recombinante:

El polylinker se encuentra dentro del lacZ, interrumpiéndolo, es decir, que si un vector autoliga
el gen lacZ queda intacto, pero si el inserto ha entrado correctamente en el polylinker, la
inserción conlleva que el gen lacZ quede interrumpido y la proteína que se sintetiza a partir de
ese momento no tenga actividad beta galactosidasa.

Una vez que he realizado todo el experimento siembro en una placa Petri que contiene X-gal,
que como sustrato no aporta ningún color, pero en presencia de la actividad de la beta-
galactosidasa da un intenso color azul. Por lo tanto, las colonias con vector autoligado serán
blancas y las colonias con plásmido químerico serán azules.

Todos los plásmidos de cada colonia (miles de millones de células) deben ser genéticamente
idénticos.

Con estos experimentos de clonación hemos conseguido:

- La amplificación

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 - La purificación: en cada colonia tengo una de las moléculas que había en mi mezcla
original.

2.3. Construcción de genotecas genómicas

Son colecciones representativas de fragmentos de DNA genómico clonados en el vector

apropiado: el conjunto de los clones representa el genoma completo

Cada colonia lleva representado un fragmento del genoma. Si analizo el número suficiente de
colonias puedo tener representado el genoma completo del organismo.

Los plásmidos solo permiten clonar fragmentos de DNA de máximo 20 kb. Los fagos 25 kb.

Para evitar tener que analizar millones de colonias de plásmidos, se recurre a BACs (cromosoma
artificial bacteriano) (300kb) y YACs (cromosoma artificial de levadura) (1000kb) que permiten
clonar fragmentos más grande de ADN.

2.3.1. Construcción de genotecas cDNA

También puedo hacer genotecas de cDNA, que consistiría en aislar el mensajero, generar el
cDNA, los clonaría en un vector y tendría una colección representativa de colonias.

Estas genotecas solo son representativas de los genes que se estuvieran expresando en el
momento que yo realizo el experimento (ya que proviene del mRNA), a diferencia de las
genotecas genómicas en las que se representa todo el organismo.

2.4. Análisis de genes concretos: detección específica - Southern

Southern analiza DNA, Northern analiza mensajero y Western analiza proteínas.

Southern permite determinar que tamaño tiene un fragmento específico de la enorme colección
de fragmentos.

El primer paso es digerir el DNA de la muestra inicial con una enzima de restricción, a
continuación, separar en un gel de agarosa (conforme a su tamaño) los fragmentos obtenidos.

Una vez que tengo el gel con los fragmentos separados, se transfiere ese DNA que tengo en el
gel a un soporte de papel con capilaridad. Lo que tendría sería un filtro, un trozo de papel, con
los fragmentos de DNA que se han separado en la misma posición, una imagen especular de las
posiciones en las que han migrado los fragmentos en el gel.

De un fragmento de un gen que yo quiero determinar donde esta: cojo mi gen a partir de él
construyo una sonda marcada y la pongo en contacto con el filtro donde tengo todos los
fragmentos, y previamente hago un tratamiento para que el DNA inmovilizado en el filtro se
desnaturalice y se abra la doble cadena, y se va a producir la hibridación de la sonda con aquellos
lugares donde haya DNA homólogo a la sonda. Podría saber perfectamente cual es el tamaño
de los fragmentos del genoma humano que hibridan con la sonda que a mí me interesa.

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Para pasar al filtro se hace un “sándwich”, se pone un recipiente con un tampón, poner encima
una especie de esponja, sobre la esponja poner el gel, sobre el gel poner el filtro y sobre el filtro
varias servilletas de papel. En el paso de líquido de abajo hacia arriba arrastra el DNA del gel al
filtro.

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Imagen: aspecto de un Southern

El tamaño que veo en el resultado es el

tamaño del fragmento original con el cual
hibrida la sonda, es totalmente
independiente del tamaño de la sonda.

2.5. Secuenciación: principios

Otra forma en la que se puede estudiar la

estructura de un genoma es mediante el
proceso de secuenciación.

En la secuenciación se determina la
secuencia de nucleótidos que hay en un
fragmento de ADN.

Los primeros experimentos de secuenciación se

basaron en la utilización de terminadores:
nucleótidos exactamente igual que los
deoxirribonucleotido que se adicionan al ADN, pero
que es un dideoxirribonucleotido que en vez de
tener en una posición -OH tiene -H. Si se añade este,
como carece del extremo 3’-OH (el que prima la
replicación) el ADN no se puede seguir alargando.

2.5.1. Secuenciación: método de Sanger

Se necesita un DNA molde (del que queremos su

secuencia), un cebador que aporte un extremo 3’-OH para comenzar la polimerización (un
cebador radiactivo en este caso, marcado en el 5’), una polimerasa, 4 dNTPs
(deoxirribonicleotidos) y una pequeña cantidad de dideoxiATP.

A partir del cebador se van a ir añadiendo nucleótidos. En el momento que se tiene que
incorporar adenina tenemos dos posibilidades: la deoxiadenina o dideoxiadenina, si se incorpora
la dideoxiadenina la cadena terminará ahí, mientras que si se incorpora la deoxiadenina la
cadena seguirá elongandose normal.

El tamaño de estas moléculas son un indicativo de los sitios donde en la cadena se ha

incorporado adenina.

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Simultáneamente en otro tubo tengo ddTTP (timina), en otro ddCTP (citosina) y en otro ddGTP
(guanina), obteniendo cuatro calles en las que tendré fragmentos de distinto tamaño, que me
permite saber exactamente qué nucleótido hay en cada posición.

Si leo el gel desde abajo hacia arriba estoy leyendo desde el extremo 5’ al 3’, obteniendo la
secuencia de nucleótidos.

En un gel los fragmentos pequeños están abajo y los grandes arriba.

Imagen de abajo: secuenciación manual (autorradiografía de un gel)

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2.5.2. Secuenciación automática

Se desarrolló un sistema que mejoró condiciones:

- Se pasó de un marcaje radiactivo a un marcaje fluorescente.

- Ya no se marca el cebador, sino los dideoxinucleótidos, por lo que puedo marcar cada
dideoxinucleótido con un fluorocromo distinto y verlo de diferentes colores, por lo que
puedo hacer las 4 reacciones en un solo tubo.
- Ya no se usan geles, sino que todo el sistema se automatiza y se usan capilares con la
acrilamida por dentro, y la muestra se incorporaba arriba, y durante la electroforesis
había un detector que me detecta la longitud de onda y en el monitor veía el
cromatograma con los diferentes colores.

2.5.3. Evolución/revolución de la secuenciación del DNA

• En 1990 se podían leer miles de bases por día

• En 2000: millones de bases/día (1ª generación)
• En 2007: miles de millones de bases/día (2ª generación)
• En 2010: 3ª generación

Esta evolución ha llevado a una reducción brutal en el coste de la secuenciación de genomas.

2.5.4. Secuenciación por los métodos de 2ª generación: fundamentos

Las 2 cuestiones críticas que han supuesto una evolución en la secuenciación son:

- Reacciones en volúmenes muy pequeños

- Secuenciación paralela de millones de clones de fragmentos de DNA

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Se utiliza una especie de porta con unos canales en los que se pegan las moléculas a partir de
las cuales voy a obtener la secuencia, e in situ en ese canal se hace una especie de PCR,
generándose a lo largo de los canales pequeños agrupamientos (cluster) que son puntitos en los
que tengo miles de secuencias iguales dentro del mismo cluster, pero distintas secuencias entre
diferentes cluster. Un cluster es un sitio donde cayó inicialmente una molécula y por la
amplificación (PCR) se genera la agrupación que es a partir de la cual obtengo la secuencia de
nucleótidos.

Ha permitido también hacer análisis de la variación genética en las poblaciones.

“Profundidad de lectura”: cada secuencia (aunque sean fragmentos cortos) se obtiene varias
veces en clones distintos. Estudiar la profundidad de lectura es estudiar la cantidad de veces que
se ha secuenciado el genoma. Si estamos estudiando el genoma humano lo normal es encontrar
la misma profundidad de lectura en todo el genoma. Si tú en una determinada región lees
muchas veces será portador de una duplicación, mientras que si no se lee en una determinada
región será portador de una deleción en homocigosis.

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El genoma del cáncer

Es muy posible que en las células cancerosas encontremos una serie de mutaciones (que suelen
ser específicas de los tumores) que no encontramos en el tejido normal.

2.5.5. Secuenciación por los métodos de 3ª generación

Después aparecieron los métodos de 3º generación que se engloban en SMRT.

Se consigue leer la secuencia de moléculas completas con un solo DNA con una sola polimerasa,
consiguiendo leer secuencias de varios kb. Se realiza en un espacio corto y con unos equipos
muy manejables.

2.6. Micromatrices (microarrays/microchips) de DNA

¿Cómo podemos hacer estudios de estructura de genomas con la tecnología de mciromatrices

(microarrays)?

Una micromatriz consiste en un soporte al que están unidas, de forma ordenada, muchas
moléculas de DNA de cadena
sencilla (sondas) que
representan una colección
de genes conocidos, o
incluso un genoma humano
completo, etc.

Tengo muchas celdillas

(500.000) y en cada una hay
un oligonucleótido diferente
fijado al soporte.

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Dentro de cada celdilla tengo millones de moléculas de DNA idénticas, y distintas de las de las
celdillas de al lado, además de una sonda fijada en la plataforma de cada celdilla. El tamaño de
cada molécula fijada al soporte es entre 25-60 nucleótidos (la nomenclatura sería: sesentámero,
treintámero…(60-mer))

2.6.1. Hibridación y detección

A esta micromatriz le vamos a añadir una serie de muestras de DNA marcadas con fluorescencia.
Si la sonda que yo he marcado hibrida con alguna de las celdillas tendré fluorescencia en dicha
celdilla, mientras que si no hibrida no habrá fluorescencia.

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2.6.2. Hibridación genómica comparativa (CGH)

La hibridación genómica comparativa sirve para detectar variantes en el número de copias

(CNV), es decir, una región del genoma en la que hay secuencias que están repetidas o
secuencias que faltan.

Para hacer esto: tomamos DNA del paciente, lo fragmentamos y lo marcamos con un fluoróforo
verde, y también cogemos DNA de un paciente control sano, lo fragmentamos y lo marcamos
con fluorescencia roja. Tomamos ambas muestras y simultáneamente añadimos las muestras
marcadas a la micromatriz. En la mayor parte de las regiones genómicas el paciente y el control
van a ser iguales, por lo que en una celdilla concreta van a poder hibridar tanto las sondas
marcadas del paciente como las sondas marcadas del control, y como detecto las dos a la vez no
me da color verde ni rojo, sino color amarillo. Si me encuentro una celdilla en la que solo veo
color rojo es porque está como debe estar en el sano, pero en el paciente (verde) tiene una
pérdida, tiene una deleción. Si por el contrario veo más color verde que rojo es porque tengo
una multiplicación.

La mayoría de las celdas son de color amarillo.

Si el DNA del paciente no tuviese ninguna CNV se vería amarillo en todas las celdillas.

En la línea horizontal que representa la hibridación en las distintas celdillas se ve que la

hibridación es similar para los dos colores. En el momento que se vea una desviación de la línea
cero, es porque tendríamos una microdeleción o una microduplicación.

Otra forma para encontrar variantes en el número de copias:

- Mediante el cariotipo (FISH). A veces una microdeleción con tinción de Giemsa no se

puede detectar.
- Por secuenciación por la profundidad de lectura.

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Un ejemplo concreto de lo anterior: Síndrome de Koolen-De Vries (microdeleciones asociadas a
retrasos de desarrollo). Se hizo el experimento de hibridación genómica comparativa con cuatro
individuos no emparentados que presentaban este síndrome. Se puede observar cómo las
deleciones son distintas unas de otras, pero con esta técnica se puede determinar que presentan
microdeleciones, y viendo la zona de solapamiento de las deleciones (cuadro azul) puedo ver la
región del genoma humano que está afectada en los 4 casos y saber qué genes se afectan.

3.TÉCNICAS PARA ANALIZAR LA EXPRESIÓN GÉNICA

Tanto para genes individuales como para genomas completos, que nos van a permitir estudiar
la expresión génica y patologías que tienen que ver con esta.

3.1. Expresión de genes concretos: Northern

La técnica de Northern permite identificar moléculas de RNAm específicas en una mezcla

compleja de moléculas.

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Es un experimento que a nivel técnico es muy similar al Southern, pero en Southern en el gel
estamos cargando un montón de ADN digerido por enzimas de restricción, mientras que en el
Northern lo que cargo en el gel son muestras de RNA (sin digerir ni nada) obtenidas a partir de
un tejido. Lo que estoy añadiendo al gel es el conjunto de todos los RNAs de la célula (mezcla
compleja), y con la sonda específica obtendré el que me interesa.

En el papel solo voy a poder detectar señal si el gen correspondiente a mi sonda marcada se está
expresando en la muestra. En el caso de que se exprese voy a obtener el tamaño del mRNA
maduro.

En las distintas calles cargo

muestras obtenidas de diferentes
tejidos. Hago la electroforesis,
transfiero al filtro e hibrido con
una sonda.

Si el gen se está expresando, la

sonda hibridará y observaré una
sonda de tamaño específico.

Ejemplo de abajo a la derecha: el

gen de expresa en todos los tejidos menos en el músculo esquelético.

Ejemplo de abajo a la izquierda: el gen solo se expresa en retina.

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3.2. Expresión de genes concretos: Western

Consiste en detectar proteínas concretas a partir de una mezcla compleja de proteínas.

Obtenemos una muestra de proteínas, las separamos en un gel de agarosa, transferimos a una
membrana y, al contrario que en Southern y Northern que usábamos sondas, aquí usamos un
anticuerpo específico (anticuerpo primario) que reacciona de manera muy específica con la
proteína que nos interesa. Utilizamos un segundo anticuerpo que reacciona contra el anticuerpo
primario y que está conjugado con una enzima, que realizará una reacción enzimática dando
lugar a un sustrato que es el que se detectará.

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3.3. Expresión de genes concretos: PCR cuantitativa (RT – qPCR)

Otra forma de estudiar la expresión de genes concretos: PCR cuantitativa.

Se basa en lo siguiente: comenzamos con nuestra muestra, y aislamos su RNA. Inmediatamente

después de conseguir el RNA total de la célula, como la mayoría de este RNA es ribosómico y el
que nos interesa es el mensajero, aislamos el mensajero utilizando su cola de poliA, pasamos el
RNA por columnas en las que estas colas quedan retenidas. A continuación, comienzo una
reacción de retrotranscripción (con un oligodT) que me va a generar copias en forma de DNA de
doble cadena de todos los mensajeros. A partir de los primeros cDNA que se sintetizan hago una
PCR, donde voy a ir observando la reacción de PCR a tiempo real. Esto consiste en que este PCR
la voy a hacer con un marcador fluorescente, una molécula que se va a poder ir incorporando
en las moléculas que se vayan generando en la PCR. Si se produce un aumento de fluorescencia
es porque se produce la amplificación por PCR.

Se puede cuantificar el aumento de fluorescencia, y hay una relación directa entre la cantidad
de DNA y este aumento de fluorescencia.

El investigador establece un nivel umbral. Si tengo una muestra con un montón de copias y otra
con muchas menos, el tiempo que se tarda en alcanzar ese nivel umbral de fluorescencia va a
ser menor cuanto mayor sea el número de copias, y va a ser mayor si tengo menos copias.

Puedo hacer una curva estándar que me relacione la cantidad de copias que tengo y el ciclo
(tiempo) de la PCR en el que se alcanza el umbral de fluorescencia. Así puedo cuantificar cuantas
moléculas de cDNA tengo en mi muestra.

El número inicial de copias que tenga depende de la transcripción. SI yo tengo un gen que se
expresa mucho, parto de un mayor número de copias y el umbral se alcanzará antes.

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3.4. Expresión de genes concretos: uso de genes chivatos

Quiero estudiar si una región

concreta del genoma contiene un
promotor y todas las regiones
reguladoras necesarias.

Gen chivato: codifica una proteína

que tiene alguna actividad que
puedo analizar y cuantificar de
una manera fácil. Es por ejemplo
el gen de la luciferasa, ya que esta
proteína cuando actúa sobre su
sustrato que es la luciferina
produce emisión de luz, que se
puede cuantificar fácilmente.

3.4.1. Vectores chivato para medir actividad de promotores

Contamos con un montón de plásmidos que ya llevan el gen chivato sin el promotor, de manera
que la zona que quieres estudiar la clonas aguas arriba del gen chivato y se introduce en las
células.

En caso de que sea un promotor se va a producir luciferasa y se va a producir luz.

En la imagen: aguas arriba de la luciferasa lo que se hizo fue clonar fragmentos grandes.

Vemos que si meto solo el vector no tengo actividad luciferasa. Si meto regiones grandes sí que
tengo la actividad, pero vemos que a partir de la cuarta línea se deja de tener la actividad, por

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que la región que hemos quitado tendrá una serie de nucleótidos que son esenciales para que
se dé la actividad (elemento funcional del promotor).

Hibridación in situ de tejidos ¿Qué proteínas puedo usar de chivatas?, por ejemplo para la
identificación de regiones reguladoras de la transcripción.

Luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP) o gen LacZ (se puede usar en embriones de ratón).

3.5. Análisis transcriptómicos: micromatrices de DNA

Se han desarrollado técnicas que nos permiten estudiar de forma simultánea la expresión de
todos los genes de un genoma.

Utilización de los chips para estudiar la expresión génica: partimos de una condición “A”.
Extraigo y purifico los mensajeros y a continuación los paso por una retrotranscripsión a cDNA,
y en este paso aprovecho para marcar con fluorescencia estos cDNA, que posteriormente los
pongo en contacto con la micromatriz. Si no obtengo ninguna señal fluorescente en una celdilla
significa que el DNA correspondiente a esa celdilla no se está transcribiendo. Si hay un gen que
se está expresando,
seguro que en
alguna celdilla va a
encontrar una seña
de hibridación y en
esa celdilla voy a
tener
fluorescencia.

Actualmente se
puede cuantificar la
luz. Si veo celeste
es una señal de
hibridación débil, y
el rojo mostraría
una hibridación
fuerte.

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Pero la mayoría de veces que utilizamos chips en expresión génica es para comparar dos
condiciones.

Extraigo RNA de una condición experimental A y de una condición experimental B. Los cDNA de
la condición A lo marco en rojo y en la condición B lo marco de verde. Mezclo todo esto y lo
pongo en contacto con la micromatriz. De la misma manera, si un gen no se ha expresado ni en
la condición A ni en la B no veo fluorescencia, si se expresa de la misma manera en las dos
condiciones veo amarillo, si el gen se expresa más en A que en B veo mayoritariamente rojo y si
en B se expresa más que en A, predomina el verde.

Esto se puede aplicar a células cancerosas (situación A) y células normales (situación B).

3.6. “Agrupación jerárquica” in silico de los datos obtenidos

La utilización de chip nos permite también trabajar in silico (por ordenador), pues se toman los
datos y se digitalizan, y a partir de aquí se
trabaja con píxeles que pueden ser verdes,
rojos o negros.

Izquierda: cada columna sería el resultado

de haber digitalizado los resultados de un
individuo con un tumor concreto. En cada
columna los genes son los mismos. Tengo 6
columnas que corresponden a 6
experimentos distintos.

Puedo tratar de buscar patrones de

expresión que sean similares y agruparlos
(imagen de la derecha).

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Imagen de abajo: mapa de expresión en el que observo que estos pacientes pueden tener
similitud en la expresión de unos genes pero muchas diferencias en la expresión de otros genes.

Imagen de 142 experimentos distintos y 1800 genes en cada experimento realizados con chips
de DNA. Rojo cuando se expresa más en el tumor, verde cuando se expresa más en el control.
Puedo observar que todos los que tienen el mismo tumor se parecen entre sí, tienen patrones
de expresión similares. Puedo tomar una muestra que no sepa el origen del tumor y compararlo
para saber de qué tumor se trata porque los patrones se parecen.

Análisis prognóstico del cáncer de mama

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Este tipo de análisis han sido muy útiles, en el caso del cáncer de mama, para hacer análisis de
prognóstico, es decir, prognosticar para dentro de mucho tiempo como va a evolucionar su
cáncer.

En las columnas tenemos muchos genes distintos, y en las filas muestras de tumor de distintos
pacientes. Con este análisis realizado durante mucho tiempo, y viendo lo que ha pasado 5 años
después, se sabe que hay mapas de expresión distintos en función de si 5 años después tuvo
metástasis o no. Las mujeres que tuvieron el mapa de expresión de arriba tuvieron su cáncer de
mama pero no tuvieron metástais Por lo tanto, con el mapa de expresión actualmente podemos
saber si su cáncer de mama es susceptible de hacer metástasis o no, y sabiendo esto, se puede
adaptar mejor el tratamiento para hacerlo más agresivo o no.

3.7. Análisis transcriptómicos: RNA-SEQ

El RNA en estos experimentos no se

secuencia directamente, lo que estamos
secuenciando es DNA, pero este DNA se ha
obtenido por una retrotranscripción.

Se coge DNA, se purifica mRNA,

fragmentamos trozos pequeños de mRNA y
nos ponemos a secuenciar al meterlos en los
canales actuales. Así se puede contar el
número de lecturas correspondientes a cada
gen.

Así consigo de una forma barata y rápida

saber qué genes se están expresando y,
además, lo puedo cuantificar.

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El gen A: ¿cuántas veces lo he leído en la muestra 1 y cuántas en la muestra 2?. Veo en este
ejemplo que en la muestra 1 se está expresando 3 veces más que en la muestra 2. Esto es lo que
se denomina “fold change”. Un fold change de 20 significa que se está expresando 20 veces más
en una muestra que en otra.

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