PLÁSMIDOS.

Los plásmidos son elementos genéticos extracromosomales que se replican

se forma autónoma, y se heredan establemente. Estos contribuyen significativamente a la
diversidad genética y plasticidad bacteriana al codificar funciones que pueden no estar
especificadas dentro del cromosoma, como resistencia a antibióticos. La mayoría existen
como moléculas circulares de DNA doble hebra, aunque también existen plásmidos
lineales. Estos últimos requieren un mecanismo especializado para replicar sus extremos
por lo que tienden a existir en bacterias con cromosomas lineales. Volviendo a los
circulares, si ambas hebras son círculos intactos de DNA las moléculas se describen como
círculos cerrados covalentemente o DNA CCC, pero si solo una hebra está intacta, son
círculos abiertos o DNA OC. Los plásmidos circulares pueden tener más de una topología
determinada por la acción opuesta de las DNA girasas y topoisomerasas. El DNA es
principalmente mantenido en una forma circular cerrada covalentemente y superenrollada.
Estos varían en sus propiedades física: pueden ser menores a 2 kbp (solamente capaces
de replicar) o tener muchos cientos de kbp. También varían en el número de copias por
equivalente cromosómico: algunos tienen una o pocas copias mientras que otros están en
10 o incluso cientos de copias por cromosoma (principalmente los pequeños), esto se
determina por los circuitos de control de replicación. Otra clasificación posible es si son
conjugativos o no, dependiendo de la presencia o no de ciertos genes de transferencia que
promueven la conjugación.
Los plásmidos contribuyen significativamente a la diversidad genética bacteriana y a la
plasticidad al codificar funciones que pueden no estar especificadas por el cromosoma.
Generalmente codifican solo unas pocas proteínas requeridas para su propia replicación y
en muchos casos codifican solo una de ellas. Todas las otras proteínas requeridas para la
replicación que se usan son las del hospedador.
Muchos plásmidos especifican características que le permiten al host persistir en
ambientes que de otra forma hubieran sido letales o al menos restrictivos para el
crecimiento. La relativa facilidad con la que los plásmidos se diseminan entre bacterias,
significa que las resistencias a antibióticos pueden pasarse rápidamente y esto ha
contribuido a la falla clínica de muchos antibióticos en los últimos años. Otras
características que pueden codificar los plásmidos son: resistencia a iones metálicos,
producción de factores de virulencia y funciones metabólicas que permiten utilizar
diferentes nutrientes.
Los plásmidos pueden ser categorizados en dos grandes tipos: conjugativos o no-
conjugativos, dependiendo de si llevan o no un set de genes de transferencia, genes tra,
que promueven la conjugación bacteriana. Los plásmidos también pueden ser
categorizados en base a si se mantienen como múltiples copias por célula (plásmidos
relajados) o como un número limitado de copias por célula (plásmidos estrictos).
Diferentes plásmidos tienen diferentes números de copias por equivalente cromosomal.
Algunos tienen un número de copias estable de una o pocas copias, mientras que otros
(principalmente pequeños) están presentes en decenas o incluso cientos de copias por
cromosoma. El número de copias del plásmido está determinado por los circuitos de
control de la replicación.
Sistemas de anti-restricción codificados por plásmidos pueden proteger el DNA plasmídico
de la degradación por las enzimas de restricción del hospedador cuando recién entra a una
célula nueva.
Los elementos (estructurales/funcionales) constituyentes de los plásmidos son: 1. Módulos
de replicación (esencial). 2. Módulo de segregación (partición y estabilidad). 3. Módulo de
transferencia conjugativa. 4. Información génica asociada (genes de resistencia,
catabólicos, biosintéticos, otros). Los módulos 1, 2 y 3 son de sostén estructural y el 4
posee contenido informacional comunitario. “

MÓDULO DE REPLICACIÓN: los plásmidos se replican durante el ciclo celular de la

bacteria para que las nuevas células puedan tener al menos una copia de cada plásmido
en la división celular, la mayoría utiliza la maquinaria de polimerización del host para
algunas etapas de la síntesis del DNA, así minimizando la cantidad de información que
debe ser codificada por el plásmido para la replicación. Del ori depende el rango de
huésped, los que derivan del ColE1 tienen rango restringido, mientras que plásmidos
promiscuos tienen un amplio rango de huésped. Estos últimos codifican la mayoría o todas
las proteínas que se requieren para la replicación (y deben ser capaces de expresar estos
genes).
El número de copias de un plásmido es determinado (y controlado) al regular la iniciación
de la replicación del plásmido. Dos grandes mecanismos de control de la iniciación han
sido reconocidos: la regulación por RNA antisense y la regulación por unir proteínas
esenciales a los iterones.
La incompatibilidad plasmídica es la inhabilidad de dos plásmidos diferentes de coexistir en
la misma célula en la ausencia de presión de selección. Los plásmidos serán incompatibles
si tienen el mismo mecanismo de control de la replicación (se excluyen mutuamente
porque compiten por la maquinaria de replicación).
Si hay que poner dos plásmidos dentro de una misma bacteria, se eligen módulos de
replicación diferentes, ya que si no van a ser incompatibles.

Iterones: lo que está en negro es

el gen que codifica para una
proteína llamada replicasa, que se
une a una secuencia repetida,
chica, de unos 20pb, señaladas
por unos triangulitos de color
blanco, que se llaman iterones.
Tienen afinidad por esos iterones.
El espaciado de esa secuencia es
regular, significa que la secuencia que la proteína “ve” está sobre una cara del DNA.
También, se une al operador de la replicasa (triángulos negros), por lo tanto, se puede
decir que la replicasa reprime su propia transcripción. Esto sirve para controlar el número
de copias. La replicasa se necesita para que se replique, pero cuando hay mucha, ella
misma reprime su propia transcripción, de tal manera que el número de copias no crezca
indefinidamente.
Entonces, la unión de la replicasa a sus zonas de unión de los iterones y la unión de la
proteína DNAa a la zona de unión de la DNA (óvalos grises grandes unidos a las barras
negras), esa doble unión de las proteínas, sumado a que entre medio de ambos sitios de
unión hay una zona rica en AT (la temperatura de melting es relativamente baja), genera
una apertura de la zona de unión y después replica de manera bidireccional (similar al
cromosoma).
En este sistema de replicación, la replicasa se une a los iterones pero, además, une dos
plásmidos diferentes y forma un complejo que no es activo para replicarse. Queda como
“secuestrado” y no progresa el inicio de la transcripción.
Resumiendo: este replicón consiste en un número de elementos, incluyendo un gen para
una proteína especifica de plásmido para la iniciación de la replicación (Rep), una serie de
secuencias directamente repetidas (iterones), cajas de DnaA, y una región adyacente rica
en AT. Rep, que usualmente auto-regula su propia expresión, se une a los iterones. La
DnaA es una proteína requerida para la iniciación de la replicación del cromosoma
bacteriano. La replicación de plásmidos es un proceso rigurosamente controlado en parte
porque la sobre-replicación del plásmido cargaría la capacidad metabólica de la célula
hospedadora y pondría a la hospedadora del plásmido en desventaja comparada a otra sin
plásmido.
En el plásmido pSC101 y en muchos de los plásmidos de gran rango de hospedador, la
región ori contiene de 3 a 7 copias de una secuencia de iteron. Cerca de la región ori hay
un gen llamado repA, que codifica una proteína llamada RepA, que se une a los iterones e
inicia la síntesis de DNA. La proteína RepA reprime su propia síntesis al unirse a la región
de su propio promotor y bloqueando la transcripción de su propio gen. Si el número de
copias es alto, la síntesis de RepA va a estar reprimida. Después de la división celular, el
número de copias y la concentración de la proteína RepA va a caer y la replicación va a
iniciar. Segundo, la proteína RepA puede unir a dos plásmidos al unirse a su secuencia de
iterones, así previniendo que inicien la replicación. Por este mecanismo, conocido como
handcuffing, la replicación de los plásmidos de iterón va a depender de la concentración de
la proteína Rep A y de la concentración del propio plásmido.

RNAs antisense: no requiere síntesis de proteínas, pero requiere la presencia de un RNA

que hace un cebado del inicio de la replicación (RNA II, flecha larga gris, se transcribe de
izquierda a derecha, como está en el gráfico), pero también, superpuesto con él, se
transcribe un RNA I, que es más chico, y que se solapa en el extremo 5’ del RNA II. A la
derecha, la flecha blanca representa un gen para una proteína rop.
El RNA II hibrida como el ori de inicio de
la replicación (hay desplazamiento de
las cadenas e hibridación del
RNA con una de las hebras).
Esto se corta por la RNasa
H y el 3’-OH libre actúa
como primer (RNA I) para
la síntesis. Para que
ocurra la replicación tiene
que ser hibridado y luego
cortado, sino no va a
pasar.
El número de copias se
regula con el RNA I, que
tiene una parte
complementaria al RNA
II: la interacción entre
ambos resulta en una
configuración del RNA II
que no permite la
elongación del transcripto
ya que la RNasa H no
puede cortar (no hay inicio
de la replicación).
La proteína Rop estabiliza la
unión RNA I – RNA II; mantiene
bajo el número de copias (lo que
permite que se forme el dúplex entre ambos a
concentraciones relativamente bajas del RNA I). Como el RNA I es
codificado por el plásmido, va a haber más cuando el número de copias de este sea alto,
por lo que se detendrá la replicación; cuando la célula crezca y se divida, la concentración
del RNA I bajará y el plásmido será capaz de replicar de nuevo.
Resumiendo: la mayoría de los vectores de clonado que se usan tienen una región ori
derivada del plásmido Col E1 y el control del número de copias es mediado por RNA
antisense. La replicación de ColE1 procede sin una proteína de iniciación de la replicación
codificada por plásmido, y en cambio usa una especie de RNA en la iniciación e
interacciones RNA-RNA para lograr el control del número de copias. ColE1 usa un primer
RNA extenso para la síntesis de la hebra líder. El pre-primer RNA II es transcripto del
promotor RNAII por la RNA polimerasa del hospedador. RNAII forma un persistente hibrido
RNA-DNA en el origen de replicación del plásmido, este es clivado por la RNasa H (debe
ocurrir sí o sí) y el grupo 3’-OH resultante en el RNAII clivado actúa como un primer para la
síntesis continua de la hebra líder catalizado por la DNA polimerasa I del hospedador.
ColE1 regula su número de copias con un RNA corto, el RNAI. Esta especie se expresa
constitutivamente por el fuerte promotor de la RNAI, no es traducida, y es completamente
complementaria a una parte del RNAII. Al ser complementarios, pueden hibridarse para
formar una hélice doble hebra de RNA. La formación de este dúplex interfiere con el
procesamiento de RNA II por la RNasa H y por lo tanto la replicación no ocurre. Como el
RNA I es codificado por el plásmido, más de este va a ser sintetizado cuando el número de
copias del plásmido sea alto. Cuando la célula hospedadora crece y se divide, las
concentraciones de RNA I caen y el plásmido empieza a replicarse de nuevo. Además de
RNA I, una proteína codificada por el plásmido llamada Rop ayuda a mantener el número
de copias. Esta proteína, que forma un dímero, mejora el emparejamiento entre RNA I y
RNA II por lo que el procesamiento del primer puede ser inhibido a concentraciones
relativamente bajas de RNA I. La deleción del gen ROP o mutaciones en el RNA I resultan
en un número incrementado de copias.

Circulo rodante: muchos plásmidos

pequeños de bacterias Gram positivas se
replican mediante el mecanismo del
circulo rodante, que es distinto a la
replicación que contiene iterones o a la
de ColE1. En este mecanismo, la unión
de una proteína de replicación codificada
por plásmido al origen de la hebra líder
distorsiona el DNA en esta región y
expone una región de simple hebra en un
cruciforme extruido. En este sitio se
introduce un Nick por la proteína de la
replicación y esto expone un grupo 3’-OH
a partir del que se sintetiza la hebra líder
por la DNA polimerasa III. Mientras esta
está siendo sintetizada, la hebra no
molde del viejo plásmido es desplazada delante de la burbuja de replicación, hasta que
llegado un punto se remueve por completo. El intermediario simple hebra resultante es
característico de este mecanismo. El origen de la simple hebra se expone en el
intermediario y comienza la iniciación usando factores de replicación del hospedador. Los
plásmidos grandes pueden tener más de un módulo de replicación.

Incompatibilidad de plásmidos. La incompatibilidad de plásmidos es la inhabilidad de

dos plásmidos diferentes para coexistir en la misma célula en ausencia de una presión de
selección. El término incompatibilidad puede ser usado cuando es seguro que la entrada
del segundo plásmido ha ocurrido y que la restricción de DNA no está involucrada. Grupos
de plásmido que son incompatibles mutuamente son considerados en el mismo grupo de
incompatibilidad (Inc). Los plásmidos serán incompatibles si tienen el mismo mecanismo
de control de replicación.

MÓDULO DE SEGREGACIÓN: los plásmidos deben asegurarse de ser distribuidos a

ambas células hijas durante la división celular bacteriana. Si el número de copias es lo
suficientemente alto, es fácil de ver como la difusión pasiva de estas copias puede ser
capaz de asegurar que cada célula hija adquiera al menos una copia de plásmido cuando
la célula se divida. Si los plásmidos tienen pocas copias hay estrategias para garantizar su
correcta herencia.
Sistemas de partición activa: un casete que consiste de un operón autorregulado que
contiene los genes parA y parB y una secuencia cis-acting, parS. Las proteínas ParA y
ParB y una proteína del host forman un complejo en parS que interactúa con aparato de
partición del host. Este complejo guía a las copias del plásmido a determinadas posiciones
de la célula.
Recombinación específica de sitio: como las copias de los plásmidos son idénticas, la
recombinación homóloga puede convertir monómeros en dímeros. La dimerización de la
población va a reducir el número de plásmidos disponibles y va a contribuir a la
inestabilidad segregacional. El mecanismo que controla el número de copias asegura un
número fijo de orígenes del plásmido por bacteria, entonces como los dímeros tienen dos
orígenes de replicación, pueden ser más favorecidos para replicarse que los monómeros.
Las células con plásmidos multiméricos tienen el mismo número de orígenes, pero menos
moléculas, lo que lleva a la inestabilidad segregacional si no tienen la función de partición.
Este problema suele solucionarse usando recombinación específica de sitio para resolver
dímeros a monómeros, para esto se usas recombinasas codificadas por la mayoría de los
cromosomas bacterianos como XerC y XerD.
Sistema toxina-antitoxina: involucra hacer que crezcan deficientemente o matar células
que no son capaces de adquirir una copia del plásmido. Este mecanismo involucra una
proteína toxina y antitoxina codificada por el plásmido. La antitoxina neutraliza la toxina al
unirse a ella o al inhibir su traducción. La antitoxina es más susceptible a ser degradada
por las enzimas del hospedador, por lo que el reabastecimiento de los niveles de antitoxina
gracias a la presencia del plásmido es requerido para evitar la acción de la toxina. Cuando
crece un derivado sin plásmido, la toxina es liberada para interactuar con un blanco
intracelular y causa la muerte o una desventaja en el crecimiento de la célula.
La transferencia conjugativa del DNA es el mecanismo más común por el que los
plásmidos se diseminan en las poblaciones bacterianas. Esta es mediada por contacto
célula-célula entre el donor y el receptor, el DNA se transfiere a través del pilus. Como un
gran número de genes puede ser requerido para el proceso de conjugación y estos genes
residen en el plásmido conjugativo (tienen Dtr: contiene el ori t, la relaxasa y proteínas
accesorias + mpf: permite la formación del poro), la mayoría de los plásmidos pequeños no
son self-transmisibles. Plásmidos pequeños que codifican para las enzimas relaxasas,
pueden movilizarse de forma conjugativa si otras funciones conjugativas son provistas in
trans por un plásmido helper dentro de la célula (solo tienen Dtr).
Un vehículo ideal de clonado tiene bajo PM, la habilidad de conferir características
fenotípicas seleccionables en la célula host, y sitios únicos para un gran número de RE.
Esto permitirá que sean más fáciles de manear, los plásmidos con bajo PM suelen ser de
múltiples copias, y con un bajo PM es menos probable que el vector vaya a tener muchos
sitios para alguna RE.
Moviloma: son los elementos genéticos móviles (fagos + plásmidos + transposones),
portan y son vehículos de toda la información que se comparte de manera horizontal en
una población o comunidad microbiana.

Inestabilidad segregacional. La pérdida de plásmidos debido a la partición defectuosa se

llama inestabilidad segregacional. Los plásmidos se mantienen establemente porque
contienen una función de partición, par, que asegura que son mantenidos establemente en
cada división celular. Estas regiones par son esenciales para la estabilidad de plásmidos
de bajo número de copias. La inestabilidad de plásmidos también puede aumentar debido
a la formación de formas multiméricas de estos. El mecanismo que controla el número de
copias de un plásmido asegura un determinado número de orígenes de plásmido por
bacteria. Las células que contienen plásmidos multiméricos tienen el mismo número de
orígenes de plásmido, pero menos moléculas de plásmido, lo que lleva a inestabilidad
segregativa si no tienen la función de partición.
MÓDULO DE TRANSFERENCIA CONJUGATIVA: el material genético de puede introducir
a la célula por medio del mecanismo de conjugación. Tiene dos grandes módulos
genéticos, uno es el Dtr: adentro tiene la zona del DNA del plásmido que se necesita para
iniciar el corte de la cadena de DNA que va a ser transferida por conjugación (oriT – zona
corta, que es reconocida por la enzima relaxasa). Se corta una hebra del DNA y el extremo
5’-P se une covalentemente a una T de la enzima relaxasa. Por otro lado, aparece una
zona genética muy grande, Mpf, que forma el poro en la membrana por donde va a pasar
la hebra simple comenzando por la relaxasa que es la que tiene unida a la cadena de DNA
que se acaba de cortar. Cuando se hace conjugación, lo que se transfiere es una hebra
simple unida a la enzima. Además, está la proteína acopladora que, de alguna manera,
reconoce a la enzima unida al DNA y la hace entrar al poro, acoplando el DNA cortado con
el poro. Los plásmidos tienen que ser conjugativos y movilizables

DISEMINACIÓN DE PLÁSMIDOS EN POBLACIONES BACTERIANAS

Algunas especies bacterianas pueden alcanzar un estado de competencia natural para
tomar ADN plasmídico desnudo (transformación) o pueden adquirir DNA que ha sido
empacado en un fago y es inyectado al hospedador (transducción). En cambio, la
transferencia conjugativa de DNA entre la célula donora y la receptora es el mecanismo
más común por el que los plásmidos se diseminan en poblaciones bacterianas.
La conjugación es mediada por el contacto célula-célula entre la donora y la receptora. El
DNA plasmídico suele transferirse a través de una estructura tipo tubo llamada pilus, que
se extiende desde el donor y conecta físicamente a la célula receptora. Como un gran
número de genes puede ser requerido para el proceso de conjugación y estos genes
residen en el plásmido conjugativo, los pequeños plásmidos suelen no ser transmisibles
por sí mismos.

PARA CLONAR
Un vehículo de clonado ideal tiene las siguientes tres propiedades: bajo peso molecular,
la habilidad de conferir fenotipos fácilmente seleccionables a la célula hospedadora
(tamaño máximo de inserto), sitios únicos para un gran número de ER. La primera
propiedad implica que el plásmido será más fácil de manejar, es más resistente al daño por
cortes, usualmente está presente como múltiples copias, hay menos chances de que tenga
múltiples sitios para cualquier ER.
¿Qué debe analizarse en un vector de clonado? Destino de uso, tamaño máximo de
inserto, estabilidad, número de copias – rendimiento de las preparaciones del DNA
clonado, simplicidad de uso, costo.
Los cósmidos son plásmidos que tienen un sitio cos del fago λ (zona del fago que se
necesita para que sea empaquetado). Se le puede insertar el DNA deseado siempre y
cuando no exceda los 45 kb: empaquetándolo en λ e inyectándolo en E coli. Es muy
eficiente.
Los fósmidos son muy similares a los cósmidos, pero tienen como diferencia que los 50 kb
clonados se van a mantener estables porque el origen es de F y tenés los genes de
partición.
Un PAC es similar a un cósmido pero en vez de estar hecho en base al fago λ, está hecho
en base al fago P. Clonás, empaquetás y como es más grande, sirve para clonar 100 kb.

Es similar a un plásmido F, con origen F y sitios de partición de E. No se puede

empaquetar, hay que transformar.
CLONADO TOPO. No se usan ni ERs ni ligasa. El
fragmento deseado tiene A saliente porque se usa la
Taq polimerasa para amplificar vía PCR, la T
complementaria viene del plásmido con
topoisomerasa. Entonces: creamos el producto de
PCR con la Taq polimerasa, mezclamos el producto
con el vector TOPO, incubamos, transformamos en
células competentes, seleccionamos y analizamos 10
colonias blancas; para confirmar la presencia del inserto hacemos PCR, digestión con ER,
o secuenciamiento. Tip: no agregar 5’-fosfatos a los primers de PCR, se necesita el
oxhidrilo libre. Puede agregarse tiempo extra para la extensión luego del último ciclo de
PCR para asegurarse que se agregue la “A” a todos los fragmentos de PCR.

CLONADO GATEWAY. Es una versión in vitro de las reacciones de integración y

recombinación de escisión que ocurren en las bacterias infectadas por un fago lambda. Los
vectores contienen versiones modificadas de los sitios att para clonar fácilmente el DNA
deseado. La reacción BP ocurre entre sitios attB flanqueando el inserto y sitios attP del
vector donor, la reacción se cataliza con el mix enzimático BP clonasa y genera un clon de
entrada que contiene el DNA de interés flanqueado por sitios attL. (El vector donor tenía
ccdB, que luego de esta reacción se escinde). Luego sigue la reacción LR, que ocurre
entre los sitios attL del clon de entrada generado y los sitios attR del vector de destino,
reacción catalizada por el mix enzimático LR clonasa. Se genera un clon de expresión con
el DNA de interés flanqueado por los sitios attB (el vector de destino también tenía un gen
ccdB, que se libera en esta reacción). Para elegir los clones positivos luego de haber
transformado, podemos jugar con las resistencias a antibióticos que tienen los distintos
vectores, además de tener que usar una cepa de coli que sea sensible a ccdB. Se puede
usar para insertar múltiples fragmentos de DNA en muchos vectores de una en un solo
tubo.

Los vectores Gateway contienen versiones modificadas de los sitios att para que se pueda
clonar fácilmente en las secuencias de DNA deseadas.
La reacción BP tiene lugar entre los sitios attB que flanquean el inserto y los sitios attP del
vector donor. Esta reacción es catalizada por mix de enzimas BP clonasa y genera el clon
de entrada que contiene el DNA de interés flanqueado por sitios attL. Como producto
secundario de la reacción, el gen ccdB es escindido del vector donor.
La reacción LR tiene lugar entre los sitios attL del generado clon de entrada y los sitios attR
del vector de destino. Esta reacción es catalizada por el mix enzimático LR clonasa. Como
resultado, un clon de expresión con el DNA de interés flanqueado por sitios attB es
generado. Un fragmento de DNA que contiene el gen ccdB es escindido del vector de
destino.
Una vez que las reacciones son llevadas a cabo, el próximo paso es transformar células
competentes de E. coli y seleccionar los clones positivos. El clon de entrada y el vector de
destino tienen distintos marcadores de resistencia a antibiótico, permitiendo seleccionar el
clon de expresión fácilmente. Hay que usar una cepa sensible a CcdB, este gen está
presente en los vectores donor y de destino previo a la recombinación, y es intercambiado
con el gen de interés durante la reacción BP o LR. Como la proteína CcdB inhibe el
crecimiento de cepas sensibles a CcdB, la mayoría de las colonias debería contener la
construcción recombinada deseada.
Para generar el clon de entrada: hay dos métodos, el primero es al recombinar un producto
de PCR-attB o un plásmido con un vector donor attP (usamos la PCR para agregar sitios
attB a cualquiera de los extremos de la secuencia codificante del gen), otra forma es hacer
TOPO clonado del inserto deseado en un vector TOPO attL de entrada, puede hacerse
también por clonado de restricción de un fragmento de ER conteniendo el DNA de interés y
un vector de entrada attL.
Una ventaja de este método es la compatibilidad y flexibilidad: una vez generado el clon de
entrada con la secuencia de DNA de interés, se puede mover ese fragmento de DNA a
través de cualquier sistema de expresión en un único paso de recombinación. También es
muy rápido: este sistema permite la generación de la construcción de expresión en solo 1
día (no se requieren ni restricción, ni ligación, ni purificación en gel).
Se puede usar este clonado para insertar múltiples fragmentos de DNA en muchos
vectores de una en un único tubo. Se pueden clonar hasta 4 fragmentos de DNA, en un
orden y orientación específicos, en un tubo, en un vector Gateway para producir el clon de
expresión deseado. Esto es posible gracias al diseño del vector Gateway: tienen versiones
modificadas de los sitios attB, P, L and R que recombinan muy específicamente y
direccionalmente, sitios attB1 con sitios attP1, attB2 solo con attP2, attL1 solo con attR1;
attL2 solo con attR2, y así.
Cuando se mueve un fragmento de DNA de un vector Gateway a otro, el DNA insertado se
mantiene en fase. Los marcadores de selección positivo (ATB) y negativo (CcdB)
aumentan la eficiencia de clonado a >99%.
Cualquier tipo de fragmento de DNA puede ser clonado: fragmentos de PCR, c DNA, o
DNA genómico, y está disponible para cualquier organismo.
CLONADO GOLDEN GATE. Se usan ER del tipo IIs, que clivan por fuera de la secuencia
de reconocimiento creando extremos salientes de 4 bases. Cuando se diseña
correctamente, los sitios de reconocimiento no aparecen en la construcción final,
permitiendo un clonado sin cicatrices. Se diseña el gen de interés con sitios de tipo IIs que
se ubican por fuera del sitio de clivado (se eliminan por digestión/ligación), el vector de
destino contiene sitios con extremos salientes complementarios. La digestión y ligación
pueden hacerse juntas, el vector y el inserto se ponen en un único tubo con la ER y la
ligasa. Se pueden religar, pero como se genera el sitio funcional de la ER se va a cortar,
mientras que si se forma la construcción deseada es irreversible porque no se regeneran
los sitios. Pueden ensamblarse múltiples fragmentos, el sitio de reconocimiento de la ER
no puede estar en los fragmentos que se desean ensamblar.

El gen de interés se diseña con sitios de tipo IIS que están por fuera del sitio de clivaje.
Estos sitios se eliminan por digestión/ligación y no aparecen en la construcción final. El
vecros de destino contiene sitios con extremos salientes complementarios que
directamente se unen al producto final de ligación. Los extremos salientes de DNA pueden
estar presentes en el plásmido (1) o pueden agregarse usando amplificación por PCR.
Es uno de los métodos de clonado más sencillos en términos de mano de obra, porque la
digestión y ligación pueden hacerse en una sola reacción de 30 minutos. El vector de
destino y el de entrada son ubicados en un único tubo conteniendo la enzima de tipo IIS y
la ligasa. A pesar de que el vector de destino original y el inserto pueden ligarse
espontáneamente, esta construcción mantendrá sitios funcionales para la enzima de tipo
IIS y volverá a digerirse. En cambio, la formación del producto de ligación deseado es
irreversible porque esta construcción no mantiene los sitios mencionados. Como resultado,
el proceso de ligación es 100% eficiente. Solo 4 bases salientes pueden usarse para
ensamblar múltiples fragmentos, además especifican el orden deseado de los mismos, y la
pérdida de los sitios de reconocimiento de la ER luego de la ligación favorece la formación
de la construcción de interés. A pesar de que la eficiencia puede bajar con un mayor
número de fragmentos, o la ligación de fragmentos muy pequeños/muy largos, estos
problemas pueden superarse al mirar un mayor número de clones potenciales. Por último,
este método es más barato que otros métodos de clonado comerciales.

Este tipo de clonado no es 100% independiente de secuencia: para evadir digestiones no

deseadas, el sitio tipo IIS usado no debe estar presente dentro de los fragmentos que se
busca ensamblar. Si esto pasa, puede usarse la amplificación por PCR para crear
mutaciones silenciosas de una base en los sitios de reconocimiento interno así
eliminándolos del gen de interés. Los productos de PCR son entonces digeridos con la
enzima tipo IIS, y la mezcla es ligada después de un paso de inactivación por calor. Si el
gen de interés o el vector de destino tienen múltiples sitios de restricción internos que
pueden no ser abiertos a la domesticados, es mejor usar otro método como Gateway o
Gibson.

ENSAMBLAJE GIBSON. Permite ensamblar múltiples fragmentos lineales de DNA. Los

fragmentos deben tener regiones de homología en sus puntas, que suelen generarse por
PCR. Luego se incuban juntos con un mix enzimático master que tiene: una exonucleasa
(T5) que genera extremos salientes (“come” los extremos 5’) que permiten que las regiones
simple hebra con homología puedan hibridar, una polimerasa y una DNA ligasa. Puede
usarse para ensamblar hasta 6 fragmentos en un solo paso, resultando en un ensamblado
sin cicatriz que no requiere de la presencia de sitios de restricción específicos. La
homología requerida entre los fragmentos vecinos puede ser creada por amplificación vía
PCR con primers que contengan las secuencias homologas apropiadas, se recomienda un
overlap de 15-40 bp. El proceso funciona mejor con fragmentos de más de 200
nucleótidos, porque la exonucleasa T5 puede comer a lo largo del fragmento entero antes
de que llegue a ocurrir la hibridación y polimerización. Tampoco funciona bien si el final de
los fragmentos tiene estructuras secundarias de simple hebra.
La homología requerida entre fragmentos vecinos puede ser creada vía amplificación por
PCR con primers que contengan las secuencias homologas apropiadas.
Al usar este método, se pueden insertar las secuencias del gen de interés y de un tag en el
vector en un solo paso y sin cicatrices. Se necesita diseñar los primers para amplificar los
dos fragmentos mientras además se incluyen las regiones de homología al vector o al
fragmento vecino. Luego se amplifican los fragmentos y el vector por PCR. Finalmente, se
incuban los tres fragmentos juntos con la master mix por una hora, y luego se transforma
en células competentes.
Una desventaja del método es que el proceso funciona mejor con fragmentos de más de
200 nucleótidos, y no funciona bien si los extremos del fragmento tienen una estructura
secundaria del DNA se simple hebra estable, como una horquilla o un stem loop.

-Blue-White screening: lacZ codifica para la β-galactosidasa, que puede romper X-gal en
galactosa y un pigmento azul cuando se expresa correctamente. Al eliminar una sección
del lacZ se genera una β-galactosidasa no funcional, pero si se complementa en trans el
péptido α ambos se complementan y la enzima para a ser funcional  α complementación.
Cuando la reacción de clonado va como se desea (el DNA se clona en el MCS), el péptido
α se interrumpe y no hay complementación, entonces vemos la colonia blanca. Cuando
esto no ocurre, el péptido α queda intacto, la célula tiene a la β-galactosidasa funcional y
vemos la célula azul. Como control hay que transformar el plásmido sin inserto, viendo
todas las colonias azules.
-Clonado de restricción: usamos una ER para abrir el plásmido e insertar un fragmento
lineal de DNA que ha sido cortado con una RE compatible, luego se usa la DNA ligasa
para que una covalentemente el plásmido y el fragmento. (Si el clonado se hace en un
vector de expresión debemos asegurarnos de poner el comienzo del gen justo downstream
del promotor del vector). Si vamos a usar una sola enzima o enzimas con extremos
salientes compatibles o sin extremos salientes, hay que usar una fosfatasa para prevenir la
re-circularización del vector previo al paso de ligación (entre plásmido e inserto quedaría
un Nick que se reparan in vivo). Luego de la ligación hay que hacer una transformación
control que sea solo plásmido y una que sea plásmido con inserto. La DNA ligasa une los
fragmentos a expensas de ATP, es crítico crear un control negativo sin inserto agregado, lo
que permitirá determinar cuántas colonias hay que esperar como resultado de la re-
circularización y de plásmido sin cortar (contaminación).
-BioBrick: agrego un fragmento en DNA entre sitios BamHI y XhoI del vector, el inserto
tiene BglII y XhoI, entre medio pongo un BamHI. De esta forma ingresa el inserto, y puedo
volver a agregar otro porque volví a dejar los mismos sitios que antes.
BIBLIOTECAS
Una biblioteca es una colección de clones representativa de una población completa, que
se logra dividiendo el DNA en fragmentos manejables y clonando todo.
Como la construcción de una biblioteca suele involucrar muchas rondas de preparación de
DNA, elección del tamaño, ligación y transformación, con la optimización de cada paso es
importante obtener grandes cantidades de DNA inicialmente para poder repetir la
preparación de DNA cuanto sea necesario. Las bibliotecas genómicas tradicionales no
pueden ser preparadas desde cantidades pequeñas de material de comienzo, en estos
casos se usa la PCR. Esto se logra usando primers random.
Cualquier procedimiento de clonado basado en células tiene cuatro partes esenciales: un
método para generar el fragmento de DNA para el clonado, una reacción que inserte ese
fragmento en el vector de clonado de elección, una forma para introducir ese vector
recombinante en una célula huésped donde sea replicada, y un método para seleccionar
las células receptoras que han adquirido el recombinante.
Los cDNAs no tienen intrones y otras secuencias no codificantes presentes en el DNA
genómico correspondiente. Una biblioteca de cDNA se prepara por transcripción reversa
de una población de mRNAs y luego se buscan clones particulares. La biblioteca de cDNA
es representativa de una población de RNA de la cual deriva. Las bibliotecas genómicas
son iguales sin importar el tipo celular o el estadio de desarrollo del cual se aisló el DNA,
mientras que el contenido de una biblioteca de cDNA sí depende de estos parámetros.