TP Nº13

INGENIERÍA GENÉTICA: TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

La Ingeniería genética utiliza la tecnología del ADN recombinante para fusionar genes con
vectores y a continuación introducirlos en células hospedadoras. Este proceso permite sintetizar
grandes cantidades de genes o fragmentos de ADN aislados y también de productos génicos como
RNAs y proteínas. La producción de moléculas de ADN recombinantes utiliza la propiedad de
las enzimas de restricción de cortar el ADN en sitios específicos y de las ligasas para la unión de
fragmentos de extremos complementarios. Los plásmidos, los cósmidos, los bacteriófagos y los
cromosomas artificiales (procariotas y/o eucariotas) se utilizan como vectores.

Enzimas de restricción
Son endonucleasas que clivan el ADN en regiones internas reconociendo una secuencia de ADN
entre 4-8 bp. El sitio de reconocimiento se llama sitio de restricción, y la enzima rompe un enlace
fosfodiéster en la hebra de arriba (sens) y otro enlace fosfodiéster en la hebra complementaria
(antisens). Son extraídas de bacterias, donde actúan como mecanismo de defensa para degradar
material genético extraño que entre en la célula.
Diferentes tipos de enzimas de restricción:
 Tipo I: Reconoce secuencias específicas y cortan el ADN en sitios no específicos > de
1,000 pb.
 Tipo II: Reconoce secuencias palindrómicas y cortan dentro de la secuencia.
 Tipo III: Reconocen secuencias específicas de 5-7 pb y cortan de 24-27 pb “down stream”
del sitio.
Las tipo II son las más utlizadas ya que reconocen y cortan dentro de las secuencias específicas.
El valor de estas enzimas yace en su especificidad. Cada enzima reconoce una secuencia
específica de bases en el ADN. Las secuencias reconocidas por las enzimas tipo II son simétricas,
es decir, que se leen igual en ambas direcciones, por eso se las llama palindrómicas. Este tipo de
endonucleasas puede dejar dos tipos de extremos, romos o cohesivos.

Dado que hay 4 bases en el ADN y asumiendo su distribución al azar, la frecuencia esperada
de cualquier secuencia en particular puede ser calculada como 4n donde n es la longitud del
palíndrome.

ADN ligasa
Estos extremos de ADN se pueden unir por medio de otra enzima, la ADN ligasa. Los extremos
de corte cohesivo permiten realizar uniones de ADN con mayor especificidad que los extremos
romos.
El uso en la digestión / restricción del ADN seguido por unión covalente de extremos cohesivos
de diferentes fragmentos de ADN forma la base de la enzimología del ADN recombinante.
Plásmidos
Los plásmidos son pequeñas moléculas de ADN (de 5.000 pb aproximadamente) que se replican
en forma autónoma en células bacterianas (debido a que contienen una secuencia de iniciación).
Son círculos covalentemente cerrados de ADN de doble cadena.
Los plásmidos son capaces de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia origen de
replicación (ori). Esto les permite replicarse de manera independiente del ADN genómico. Debido
a su tamaño relativamente pequeño, los plásmidos contienen sólo algunos únicos sitios de clivaje
de enzimas de restricción (Polilinker o MCS).
Se puede crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido. Este proceso consta de
las siguientes etapas:
 Se corta el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, paragenerar extremos
cohesivos.
 Se corta el ADN que se quiere multiplicar. Asegurándose que los extremos del plásmido
y los del ADN a insertar sean complementarios y puedan unirse.
 Se une el gen que se desea introducir (inserto) por medio de la enzima ADN-ligasa y
luego se introduce el plásmido con el inserto en las bacterias.
 Por último, se seleccionan las bacterias que hayan introducido el plásmido con la ayuda
de antibióticos. Dado que los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al
exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el plásmido (y con
él la resistencia) sobrevivirán, mientras que las que no lo tengan morirán.

Debido a que todas las copias del gen provienen de una sola molécula multiplicada a partir
de una única bacteria que dio origen a la colonia, esta técnica lleva el nombre de clonación.

Existen métodos físicos y químicos para introducir material genético en el interior de la célula.
Muchos métodos químicos de transformación en bacterias se basan en tratarlas con una solución
de CaCl2 y luego calentarlas (shock térmico). Así pueden ser transformadas con ADN extraño
(ej. plasmídico). Aparentemente, este tratamiento induce un estado de "competencia" en la
bacteria receptora durante el cual son capaces de tomar ADN proveniente de diferentes fuentes.
Un método físico para la transformación de bacterias es la electroporación. En este
procedimiento, una mezcla de ADN y de células receptoras son sometidas a una diferencia de
potencial muy alta (2500 Volts) por un período de tiempo muy corto (milisegundos). En el
momento que ocurre el pulso eléctrico, las células se hacen "competentes" para la entrada de los
plásmidos.
Aquellas células bacterianas que fueron transformadas con un plásmido son fácilmente
detectadas, ya que la mezcla de transformación es sembrada en placas de medio sólido que
contienen un antibiótico de selección para el cual el plásmido porta un gen de resistencia. En estos
medios selectivos sólo se duplicarán aquellas células bacterianas que portan plásmido en su
interior (bacterias que han sido transformadas).
Existen diferentes métodos para identificar las colonias que contienen plásmidos recombinantes.
Método de selección por alfa-complementación. La selección por alfa-complementación o por
colonias blancas y azules, se basa en la actividad Beta-galactosidasa (lacZ) de E. coli y en la
regulación del operón lac. La enzima Beta-galactosidasa está formada por dos dominios, uno N-
terminal (péptido alfa) y otro C-terminal (fragmento omega). Estos dos dominios por separado no
presentan actividad enzimática, pero al unirse, se restablece la actividad de la enzima, y este
fenómeno se denomina alfa-complementación.
Se han construido plásmidos que permiten la búsqueda rápida de clones recombinantes. Estos
vectores portan ADN que codifica para la subunidad alfa de la Beta-galactosidasa. Cuando células
de E. coli que portan el gen mutado en la región de la subunidad alfa son transformadas con estos
plásmidos, se restablece la actividad Beta-galactosidasa.
Métodos de selección por réplica de placas: La réplica en placa (Fig. 4) es una técnica usada
para la selección negativa de colonias. Es decir, comparar las colonias presentes en la placa
primaria con las colonias presentes en las placas secundarias creadas que poseen medios
selectivos, la presencia o no de estas colonias nos indicará si una colonia en particular posee un
genotipo tolerante a ese medio.
Plásmidos para clonación de productos de PCR: Existen plásmidos optimizados para clonación
de productos de PCR, cuyo propósito es facilitar la clonación de productos de PCR por poseer
una A sobresaliente en sus extremos 3’, típico en la mayoría de las reacciones de PCR. Estos
plásmidos están linearizados y estabilizados con un T terminal 3’ que facilitan el ligamiento entre
un producto de PCR y el plásmido mediado por una enzima ligasa T4.
Plásmido de expresión: Los plásmidos de expresión son utilizados para producir polipéptidos o
proteínas específicas en una célula hospedadora. El mismo debe contener un promotor
constitutivamente activo, por ejemplo el promotor de citomegalovirus (CMV). La proteína que se
quiere expresar de manera exógena puede muchas veces ser marcada con una “etiqueta” o tag,
como se le denomina en inglés, que se une de forma covalente a dicha proteína a fin de facilitar
su detección o purificación por medio de algún método apropiado. En el caso de que se quiera
visualizar la proteína pueden utilizarse etiquetas fluorescentes.
También existen plásmidos específicos que se pueden utilizar para el estudio de la actividad del
promotor de un gen (reporter plasmids). Para ello se utilizan plásmidos que poseen múltiples sitios
de enzimas de restricción (multiple cloning site) río arriba de la proteína Luciferasa seguido de
una cola polyA (para que pueda ser traducida la luciferasa). Una vez clonado el promotor en el
plásmido se puede estudiar el control de la expresión génica de dicho promotor que será evaluado
según la determinación de la expresión de luciferasa (que confiere fluorescencia).
Bases de datos comunes de información de secuencias:
 Addgene (https://www.addgene.org/)
 National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nih.gov/)
 DNA Data Bank of Japan (DDBJ, http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-e.html)
 European Bioinformatics Institute (EBI, http://www.ebi.ac.uk/)
 Instituto de Genómica de la Universidad de California Santa Cruz
(https://genome.ucsc.edu/)