Tecnología del AND

Aplicaciones
Crecimiento,
elongación ó
polimerización de
la cadena en
dirección 5´ a 3´
H2

3´
 PCR. Aplicaciones
Litigios por filiación: prueba de maternidad/paternidad
Identificación de especies: banco de genes o secuencias
Medicina forense: Manchas de sangre, Colillas, Chicles, Cabello o pelos arrancados con raíz
Esperma, Saliva, Pañuelos con mucosidades nasales, Bastoncillos para la limpieza de las orejas, Residuos
de maquina de afeitar eléctrica, Dientes, Huesos, Fluidos corporales.

Medicina clínica:
Diagnóstico HIV cuando aún no hubo respuesta de Ac.
Diagnóstico de enfermedades infecciosas.
(< tiempo respecto a cultivos bacteriológicos)
Diagnóstico de cánceres (control crecimiento).
Diagnóstico de leucemia (reorganización)
PCR. Aplicaciones
 A tener en cuenta…
La identificación con ADN o “huella genética” se basa en el estudio de
una serie de fragmentos de ADN presentes en todos los individuos
pero que poseen la característica de ser altamente variables o
polimórficos entre los mismos.

El análisis de un determinado número de estas secuencias o

fragmentos de ADN permite identificar a un individuo con una
probabilidad muy cercana al 100% (99,999%).

Además de ser muy polimórfico, el ADN que se utiliza para la

identificación en genética forense o para filiación es un ADN no
codificante o no expresivo, por lo que no revela características
fenotípicas de los individuos; este hecho es de gran importancia a la
hora de considerar la creación de las bases de datos genéticas.
 Polimorfismo

El polimorfismo genético hace referencia a la existencia en una

población de múltiples alelos de un gen. Es decir, un polimorfismo es una
variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN entre los
individuos de una población.

Aquellos polimorfismos que afectan a la secuencia codificante o reguladora

y que producen cambios importantes en la estructura de la proteína o en el
mecanismo de regulación de la expresión, pueden traducirse en diferentes
fenotipos (por ejemplo, el color de los ojos).

Un polimorfismo puede consistir en la sustitución de una simple base

nitrogenada (por ejemplo, la sustitución de una A (adenina) por una C
(citosina) o la modificación puede ser más extensa.
 RAPD
Random Amplification of Polymorphic DNA

La amplificación aleatoria de ADN polimórfico es un tipo de marcador

molecular basado en la PCR.

Los fragmentos de ADN obtenidos por medio de esta técnica se amplifican en

regiones aleatorias del genoma ya que los iniciadores o cebadores de la
reacción son secuencias arbitrarias de ADN sintético.

El ADN molde no necesita estar muy puro, no presupone conocimientos

previos sobre la secuencia y se pueden distinguir rápida y simultáneamente
muchos organismos.
 RAPD
Random Amplification of Polymorphic DNA
Individuo 1

Individuo 2
 Electroforesis
Individuo 1 Individuo 2
 Electroforesis
Individuo 1 Individuo 2
 RAPD
Random Amplification of Polymorphic DNA

Estudios de diversidad
 Criminalística

Ejemplo de un caso de criminalística

resuelto utilizando electroforesis en gel
vertical de acrilamida. Si se observan los
patrones bandas podrá comprobarse
como los perfiles obtenidos en las
manchas de sangre encontradas en el
sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del
sospechoso (S) coinciden con el perfil
genético de la víctima (V)
Criminalística

A cual sospechoso
corresponde la
mancha de sangre?
 Test de filiación o paternidad

La prueba de paternidad genética se basa en comparar el ADN nuclear del

presunto padre e hijo.

El ser humano al tener reproducción sexual hereda un alelo de la madre y

otro del padre. Un hijo debe tener para cada locus un alelo que provenga del
padre.

Esta comparación se realiza comparando entre 13-19 locus del genoma del
hijo, del presunto padre y opcionalmente de la madre, en regiones que son
muy variables para cada individuo llamadas STR (Short Tandem Repeat).
Test de filiación o paternidad

Perfil de ADN de un niño (C), su madre (M) y su

padre (F). El niño heredó una banda de su
madre y otra de su padre.
Tecnología del ADN recombinante

Expresión de un gen de interés de un

microorganismo bajo la maquinaria de
transcripción y traducción de otro
(hospedador).
 Plásmido
Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico circular
e independientes de éste en su replicación. Están presentes
normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en
organismos eucariotas. Su tamaño varía desde 1 a 250 kb. El
número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo,
desde una sola copia hasta algunos cientos por célula.

Las moléculas de ADN plasmídico, adoptan una conformación

tipo doble hélice al igual que el ADN de los cromosomas, aunque,
por definición, se encuentran fuera de los mismos.

No codifica propiedades vitales para la célula (sino producción

de exopolisacáridos, resistencia a antibióticos, producción de
proteínas tóxicas, virulencia).
Tecnología del ADN recombinante
Tecnología del ADN recombinante
Tecnología del ADN recombinante. Vectores

Plásmidos

 Bacteriofagos
Tecnología del ADN recombinante. Vectores

Plásmido pBR322

BamHI
+ Ligasa
Tecnología del ADN recombinante. Vectores

Transformación: incorporación de plásmido

Shock
eléctrico
Tecnología del ADN recombinante

Primer paso para seleccionar clones

Sembrar las células en un medio

de cultivo con ampicilina

Segundo paso para seleccionar clones

Transferir colonias a
una placa que tenga
tetraciclina
 El fragmento del gen a clonar se inserta en el gen de la β-gal !!!

El X-gal es un β-galactósido degradado por la

β-galactosidasa. Uno de los productos de
degradación del X-gal forma un precipitado de
color azul sobre las colonias bacterianas con
función β-galactosidasa.

1. Las bacterias no transformadas (carecen de

plásmido pUC19 de cualquier tipo) no crecerán
en nuestra placa dado que son sensibles al
antibiótico ampicilina

2. Las bacterias transformadas con plásmido

no recombinante (sin inserto de ADN de la
especie que estamos estudiando) crecerán
formando colonias de color azul (dado que son
resistentes a ampicilina y dado que tienen
actividad β-galactosidasa

3. Las bacterias transformadas con plásmido

recombinante (con inserto de ADN de la
especie que estamos estudiando) crecerán
formando colonias de color blanco (dado que
son resistentes a ampicilina y dado que no
tienen actividad β-galactosidasa)
Tecnología del ADN recombinante. Vectores

 Bacteriofagos: fago Lambda

Ciclo lítico
Ciclo lisogénico

46 Kb, 23 kb sin información esencial para el fago λ

Tecnología del ADN recombinante. Vectores

Ciclo lítico
Tecnología del ADN recombinante. Vectores
Tecnología del ADN recombinante. Vectores

 Bacteriofagos: fago M13

Útil para secuenciar ADN
No mata al hospedador
Gran cantidad de fagos en un cultivo
Posee región multiadaptadora
Inestable para > 1000 bp
Expresión de genes de eucariotas en
procariotas

Intrón: secuencia de ADN de

eucariota no codificante. Un intrón
es una región del DNA que debe
ser eliminada del transcripto
primario de RNA. Los intrones son
comunes en todos los tipos de
RNA eucariotas, especialmente en
los RNA mensajeros (mRNA),

Las células
procariotas no tienen
la maquinaria para
eliminar intrones !!!
Manipulación de genes de eucariotas

La transcriptasa inversa, transcriptasa reversa o

retrotranscriptasa es una enzima de tipo ADN-polimerasa, que
tiene como función sintetizar ADN de doble cadena utilizando
como molde ARN monocatenario, es decir, catalizar la
retrotranscripción o transcripción inversa. Esta enzima se
encuentra presente en los retrovirus.
Manipulación de genes de eucariotas
 RT-PCR (Real Time-PCR)
La PCR cuantitativa (en inglés, quantitative polymerase chain reaction;
qPCR o Q-PCR) o PCR en tiempo real (en inglés real time PCR) es una
variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para
amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto
del ADN. Para ello emplea, al igual que la PCR convencional, un molde
de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón
de reacción adecuado y la Taq polimerasa. A dicha mezcla se le
adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que permita medir la
tasa de generación de uno o más productos específicos en un
termociclador provisto de sensores de fluorescencia, tras excitar el
fluoróforo a la longitud de onda apropiada. Dicha medición se realiza
tras cada ciclo de amplificación, y es por esto que se le denomina PCR
en tiempo real.
Estudio de expresión génica. Microarray chips
Estudio de expresión génica. Microarray chips
Estudio de expresión génica. Microarray chips
Tecnologías “NGS”