UNIVERSIDAD AUTÓNOMA CHAPINGO

Posgrado en Biotecnología Agrícola

Ingeniería Genética de Plantas

LAS BASES DE LA CLONACIÓN MOLECULAR

Dr. Oscar Mascorro Gallardo

Chapingo, México, 2016
PRINCIPIOS DE CLONACIÓN MOLECULAR
TEMAS

1) Enzimas para manipular el ADN (enzimas de

de restricción y ligasas)
2) Caracterización y desarrollo de vehículos
moleculares (plásmidos y fagos modificados)
3) Desarrollo de métodos para introducir el ADN
en las bacterias (transformación, transducción y
conjugación).
4) Desarrollo de métodos de identificación de las
quimeras moleculares (southern blot, northern
blot y western blot)
5) Desarrollo de genotecas genómicas y de ADNc
y rastreo de las mismas
6) Desarrollo de métodos de secuenciación del
ADN (Sanger) y de última generación.
7) Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y
RT-PCR y PCR en tiempo real.
La biblia del ADN recombinante del lab
TECNOLOGÍA
DEL ADN
RECOMBINANTE
Cronología de la Genética
(y la ingeniería genética)
Laboratorio de
nivel P4
de seguridad
utilizado en los
albores de la
ingeniería
genética.

BIOSEGURIDAD
 BIOSEGURIDAD

Al igual que en la actualidad hay

polémica sobre los cultivos
transgénicos y sobre el uso de
células madre y la clonación de
animales, en los albores del ADN
recombinante hubo temores y
dudas sobre los alcances y riesgos
de esta naciente tecnología .

Consultas públicas en Cambridge,

Mass. para discutir la aprobación
para hacer experimentos de ADN
recombinante
 Maxine Singer, Norton Zinder, Sidney Brenner y Paul
Berg. James Watson y Sidney Brenner en la Conferencia
de Asilomar en California en febrero 1975.
En esta reunión se aprobaron las primeras directivas y
normas para hacer experimentos de ingeniería genética.

Summary statment of the Asilomar Conference on recombinant

DNA molecules. 1975 P. Berg, D. Baltimore, S. Brenner, R.O,
Roblin III and M. Singer. PNAS USA vol. 72 (6), pp 1981-1984
1981

Francisco Bolívar Zapata
(IBT-UNAM)
Contribuciones principales:
• Uno de los autores del pBR322
(1976-1977)
**Primera modificación bacteriana
(1978-1981) con H. Boyer
Premio Príncipe de Asturias en
Ciencia y Tecnología (1991)
Luis Herrera Estrella
(CINVESTAV-IPN)
Contribuciones principales:
Uno de los inventores de la modificación
genética de las plantas (1983-84)
Miembro de la Academia Nacional de
Ciencias de Estados Unidos (2006).
La ingeniería genética surge debido a los siguientes
avances (60s y 70s del siglo XX):

1) Enzimas para manipular el ADN (enzimas de

de restricción y ligasas)
2) Caracterización y desarrollo de vehículos
moleculares (plásmidos y fagos modificados)
3) Desarrollo de métodos para introducir el ADN
en las bacterias (transformación, transducción y
conjugación).
4) Desarrollo de métodos de identificación de las
quimeras moleculares (Southern blot, Northern
blot y western blot)
5) Desarrollo de métodos de secuenciación como
el método de Sanger de los dideoxinucleótidos
Clonación molecular-proceso básico en bacterias
 1
5
3

2 4

La modificación genética en plantas incluye las etapas siguientes:

1) Aislamiento del ADN (de cualquier fuente)

2) Clonación del ADN (en la bacteria E. coli)
3) Diseño de la construcción (vector, promotor, gen de selección)
4) Transformación de la planta (cultivo tejidos, agroinfección o biobalística)
5) Retrocruzas a líneas comerciales, producción de híbridos.
La clonación molecular puede ser de todo el ADN de un
organismo, en vectores derivados de plásmidos o de
fagos lambda, esto se lleva a cabo para hacer genotecas
o bancos de genes
CLONACIÓN DE ADN ADN pasajero
Célula huésped
Procarionte Eucarionte Vector o vehículo (replicón)

E. coli S. cerevisiae Plásmido Fago otros

B. subtilis Animal cósmidos
Vegetal pBR322 λgt10 fásmidos
pUC9 λgt11 YACs
BACs
Introducción del vector (replicón) De clonación o expresión
Transformación ó Transfección
(Microinyección, Electroporación
Biobalística)

Amplificación y/o expresión

del gen o el ADN
Fagos, bacterias y enzimas de restricción
Fenómeno de modificación y restricción
Restricción-modificación (metilación) en bacterias
 ¿Porqué se vuelven resistentes a la infección
las bacterias?

Por el sistema de modificación que protege a su

propio ADN de ser degradado por las enzimas
de restricción que produce la misma bacteria.
La modificación consiste en la metilación del
ADN, lo cual lo vuelve resistente al ataque por
estas enzimas
 Enzimas de restricción

Enzimas de restricción tipo I: Estas enzimas se mueven entre

1000-5000 nucleótidos antes de cortar degradando unos
75 nuclótidos de la molécula de ADN. Son inespecíficas.

Enzimas de restricción tipo II: Cortan en secuencias específicas

(de tipo palindrómico) de ADN. Son útiles porque el corte que
realizan siempre es en el mismo sitio. Alta especificidad.
 Enzimas de restricción

Endonucleasas que cortan el ADN internamente, en secuencias

específicas de tipo palindrómico (Ana; Madam, I´m Adam,etc.).

Generan extremos romos:

SmaI 5´-CCC GGG-3´

Serratia marscecens 3´-GGG CCC-5´

Generan extremos 5´cohesivos:

EcoRI 5´-G A ATTC-3´

Escherichia coli R 3´-CTTA A G-5´

Generan extremos 3´cohesivos:

KpnI 5´-GGTAC C-3´

Klebsiella pneumoniae 3´-C CATGG-5´
Para cortar y pegar ADN se utlizan las enzimas
de restricción y la enzima ligasa de ADN,
comúnmente la polinucleótido ligasa T4,
proveniente del fago T4 par. La ligasa une
covalentemente extremos cohesivos de ADN
ó extremos romos.

5´ 3´ 5´ 3´
3´ 5´ 3´ 5´

Ligasa T4 (dependiente de ATP)

5´ 3´
3´ 5´
El episoma F se integra en el cromosoma bacteriano
y promueva la conjugación entre bacterias
 Diferencia entre plásmido y episoma

Plásmido: elemento extra cromosómico que se

replica independiente del cromosoma

Episoma: plásmido que puede multiplicarse de

manera independiente o integrado al cromosoma
bacteriano.
Funciones escenciales de un plásmido presentes
en el bloque de replicación:

1) Origen de replicación.
2) El iniciador
3) Determinación del no. de copias
4) Reparto durante la división celular
Los plásmidos poseen un tipo de replicación theta
Los plásmidos se agrupan en distintos grupos de
incompatibilidad

•Plásmidos del mismo grupo de incompatibilidad

no pueden coexistir en el mismo hospedante
pues tarde o temprano uno de ellos elimina al
otro.
•Plásmidos de diferente grupo de incompatibilidad
sí pueden coexistir en el mismo hospedante.
•Cada tipo de plásmido tiene definido su rango de
hospedantes, el cual puede ser restringido o
amplio.
•Se han definido unos 30 grupos de incompatiblidad
Los plásmidos se denominan de manera genérica
según el fenotipo que confieren al hospedante:

Tipo R: Confiere resistencia a antibióticos

Tipo Sym: De Rhizobium, permite que la bacteria

sea simbiótica.

Tipo Ti: De Agrobacterium, produce tumores en

las plantas infectadas por la bacteria.
 Enzimas de la célula
huésped

activador Burbuja de replicación

represor

ARN polimerasa

cop rep
ori

Bucles intercatenarios promotor

Origen de replicación de un plásmido. La proteína

cop define el número de copias y rep es un activador
de la replicación
Los plásmidos son de replicación restringida o relajada

La replicación restringida, requiere de la síntesis de

proteínas para que se lleve a cabo y produce pocas
copias del plásmido.

La replicación relajada, no requiere de la síntesis de

proteínas y produce muchas copias del plásmido, y
esta se incrementa al bloquear la síntesis de proteínas
con cloranfenicol, que no mata a la bacteria, pero le
impide dividirse, no así al plásmido, el cual puede
acumularse en un gran número de copias, pudiendo
constituir hasta un 50% del ADN bacteriano.
 Plásmido:
5 % del ADN total

Cloranfenicol: antibiótico que inhibe

la síntesis de proteínas y la duplicación
bacteriana, pero no la del plásmido

Plásmido:
50 % del ADN total

Plásmido de replicación relajada

Actualmente ya no se usa clorenfenicol, pues en vez de eso, con mutaciones
en cop se pude incrementar el número de copias del plásmido
¿Que propiedades deseables debe tener un vector
derivado de plásmido?

1. Ser de tamaño pequeño (unas 5 kb, máximo).

2. Poseer un origen de replicación funcional
3. Tener al menos un gen de selección.
4. Tener un polylinker o MCS (sitios únicos de corte)
5. Que sea de replicación relajada (muchas copias)
6. Que sea no conjugativo, pero si movilizable.
7. Que se conozca toda su secuencia.
Genealogía del
vector pBR322
Mapa genético y de restricción del vector pBR322
rep-origen de replicación del plásmido pMB1
rop-gen que codifica rop, que controla el num de copias
bla- gen de la beta lactamasa que da resistencia a ampicilina
tet- gen que confiere resistencia a tetraciclina
bamH1- sitio de restricción utilizado para clonar ADN
VECTORES
O VEHÍCULOS
MOLECULARES
Vectores derivados del fago lambda
Mapa genético del
fago λ
Los fagos producen placas de lisis. Cada placa es la
progenie de un fago, o una clona amplificada, si se
trata de un vector para hacer bancos de ADN
Vector de clonación tipo fago lambda
Para hacer bancos genómicos
Se replica en E. coli.
Construcción de un banco de ADN en el fago lambda
 Vectores híbridos

Se pueden intercambiar elementos de

distintos plásmidos o entre plásmidos
y fagos (origenes de replicación,
promotores, sitios de integración, etc.)
para producir vectores más versátiles,
capaces de establecerse y multiplicarse
en distintas especies bacterianas o en
bacterias y levaduras
Fagémido (Phagemid). Es un vector quimérico que
contiene un origen de replicación como f1 o M13, en
círculo rodante de ADNss, que también pueden replicarse
como plásmido en E. coli.
Los fagémidos como pBLUESCRIPT, se utilizan para
hacer genotecas de ADNc, y una vez identificada una
clona de interés al rastrear las placas de lisis, se induce
la escisión (zapping) y replicación como plásmido para
posteriores manipulaciones (subclonaciones).
Sistema de clonación basado en el fagémido pBluescript
Plásmido del vector pBluescript II
VECTOR LANZADERA (SHUTTLE) DE CLONACIÓN

Replicación en E. coli y en Saccharomyces cerevisiae

pYep24
Vector lanzadera de expresión para levadura
Promotor inducible hasta 2000 veces con galactosa
Se replica en E. coli y en Saccharomyces cerevisiae
Vector binario para transformar plantas
Se replica en E. coli y en Agrobacterium tumefaciens
Transfiere el ADN-T a células vegetales.
Vector binario para transformar plantas.
Se replica en E. coli y en A. tumefaciens
Transfiere el ADN-T a células vegetales

Expresión del gen GUS en hojas

y flores de Arabidopsis thaliana
 Los vectores lanzadera se pueden movilizar por
conjugación de E. coli a Agrobacterium o Rhizobium
Los vectores lanzadera se han diseñado porque
el ADN recombinante se hace solamente en
E. coli. Las levaduras, Agrobacterium o
Rhizobium no producen suficiente ADN ni de
la calidad adecuada para hacer las manipulaciones
in vitro del ADN. Entonces es necesario hacer
esto en E. coli y cuando se tiene la construcción,
entonces se transfiere al hospedante final.
La amplificación de ADN del vector para cualquier
análisis in vitro, se hace en E. coli.
Es como hacer un vehículo en la fabrica de montaje,
pero este se va a terminar utilizando en otra parte.
CLONACIÓN DE ADN
Electroforesis de ADN
El grado de enrollamiento está
determinado por la actividad
de la ADN toposiomerasa II
de E. coli. El estado nativo es
superenerollado y es el que
posee mayor eficiencia de
transformación
Plásmido visto con
microscopio electrónico
de transmisión. Con
diferentes grados de
enrollamiento
TRANSFORMACIÓN: El ADN de plásmido se introduce
en E. coli por transformación química o por electroporación.
Mecanismos de Resistencia…
1. Modificación química del antibiótico...
Mecanismos de Resistencia…
1. Modificación química del antibiótico...
b. Inactivación de Cloramfenicol (50S)

NH CO CHCl2
Cloranfenicol Acetil O2N CH CH CH2
Transferasa (CAT) OH OH
AcCoA

NH CO CHCl2
Cloranfenicol Acetilado no se une al
O2N CH CH CH2
ribosoma...
OH O CO CH3
AcCoA

NH CO CHCl2
Existen muchas CAT distintas, O2N CH CH CH2
probablemente de origen O O CO CH3
independiente… CO CH3
Algunos mecanismos de acción y resistencia a
antibióticos en bacterias
Mecanismos de acción de algunos antibióticos y resistencia bacteriana
Clonación de ADN
 PCR

Hay diferentes estrategias de clonación

 Se cuenta con un arsenal
de enzimas para manipular
el ADN y el ARN

5’ 3’
3’ 5’
ADN con extremos romos
(corte con SmaI, EcoRV, PvuII)

5’ 3’
3’ 5’
ADN con extremos 3’ salientes
(corte con KpnI, PstI, PvuI)

5’ 3’
3’ 5’
ADN con extremos 5’ salientes
(corte con EcoRI, BAmHI, HindIII)
Clonación mediante linkers
Clonación no direccionada
Clonación direccionada
La defosforilación
reduce las
uniones
intramoleculares
de los extremos
del vector.
Uso de la fosfatasa alcalina (BAP)
Ligación con adaptadores
Vectores de la serie
pUC, con el sistema
de selección de
α-complementación
de lac Z.
Operón lac de Escherichia coli
Vectoes pUC:
β-galactosidasa (Lac Z) convierte lactosa a galactosa + glucosa

¿Como buscar clonas recombinantes con este vector?

• Uso de medio sintético con X-gal
• β-galactosidase rompe X-gal en galactosa + color azul
Reacción de X-gal con β-galactosidasa
 Identificación de transformantes

pUC Vector

Blue white
Ampicillin + X-Gal media

En un solo paso en una placa petri

Medio con ampicilina
con Ap y X-gal, se seleccionan
transformantes recombinantes.
Selección de colonias blancas en medio LB +
(AmpR) y X-gal (LacZ-)