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Canseco Jessica

Crdenas Monje Missael


Cruz Serrano Edith
Gonzlez Vzquez Jocelyn Nicole
Guzmn Gonzlez Hctor Eduardo
Clonar significa hacer copias idnticas.

La clonacin del DNA implica la separacin de un
gen especifico o de un fragmento de DNA de un
cromosoma y su unin a una pequea molcula
de DNA portador.
1.- Cortar el DNA en sitios precisos:
Participacin de las
endonucleasas de restriccin.
2.- Unin covalente de dos
fragmentos del DNA:
Participacin de la DNA ligasa.
3.- Seleccin de una pequea molcula de
DNA capaz de autorreplicarse: Los
segmentos del DNA que deben ser
clonados deben unirse a plsmidos o a
DNA vricos (vectores de clonacin: que es
un agente de entrega).
As las molculas procedentes de DNA,
compuestos de segmentos de DNA unidos
covalentemente procedentes de dos o
mas fuentes se denominan DNA
recombinantes.

4.- Traslado del DNA del tubo de ensayo a
una clula husped que proporciona la
maquinaria enzimtica necesaria para la
replicacin del DNA
5.- seleccin o identificacin de las clulas husped
con DNA recombinante.

Los mtodos para llevar a cabo todas estas tareas
se denomina tecnologa del DNA recombinante
tambin llamado ingeniera gentica.


ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCIN DE TIPO II
Cortan DNA en secuencias especficas,
generando fragmentos ms pequeos .
TIPOS
I Y II : Son grandes complejos formados por
mltiples subunidades que contienen
actividad de endonucleasa y metilasa.
I: Cortan al azar
III: Cortan el DNA a 25 pb de la secuencia de
reconocimiento. Necesitan ATP.
II: Cortan el DNA en la secuencia de
reconocimiento. No necesita ATP.
CORTES
EXTREMOS COHESIVOS : Cortes indentados , dejan de dos a
cuatro nucletidos desapareados en cada extremo
EXTREMOS ROMOS: Cortan los enlaces fosfodiester opuestos, no
dejan bases desapareadas
Une un vector de clonacin a un
fragmento de DNA que ser clonado.
DNA LIGASA
VECTORES DE CLONACIN
MS UTILIZADOS CON E. COLI
Plsmidos
Bacterifagos
Cromosomas bacterianos
artificiales
Vectores de clonacin
Molcula pequea de ADN que
puede replicarse de manera
autnoma en un husped


Plsmidos
Molculas circulares de ADN de
doble cadena que se replican con
independencia del cromosoma
husped

Son opcionales : La clula puede
vivir sin ellos pero proporcionan
rasgos tiles.
Portan genes tiles
a la bacteria, por
ejemplo:
produciendo
RESISTENCIA A
ANTIBIOTICOS.
Se pueden introducir en las
clulas bacterianas en un
proceso llamado
TRANSFORMACION O POR
MEDIO DE LA
ELECTROPORACION.

No todo es malo,
son muy tiles
para sintetizar
protenas.

Son considerados
como VECTORES.
El plsmido PBR322 es
un buen ejemplo de
vector de clonacin
de caractersticas
tiles.
Fago
Qu es un bacterifago?

Son virus bacterianos.
La mayora de los
bacterifagos que se
han estudiado
infectan a Escherichia
coli.
BACTERIFAGO LAMBDA
INFECCIN LTICA
SE REPLICAN HASTA UN
NMERO ELEVADO QUE
OCASIONA LA LISIS DE LA
CLULA
ESTADO LISOGNICO
SE INTEGRAN EN EL
GENMA DEL ANFITRIN
SIN PRODUCIR MUERTE
BACTERIFAGO
BACTERIFAGO LAMBDA
Es un
bacterifago
atemperado que
infecta a
Escherichia coli.
Tiene una cola
flexible que esta
implicada en la
penetracin del
cido nucleico en el
hospedador.
En el extremo 5de cada una de las
bandas hay una cola de cadena
sencilla de 12 nucletidos de longitud.
Estas terminaciones monocatenarias
son complementarias (extremos DNA
cohesivos.
El genoma de lamba
consiste en una molcula de
DNA bicatenario.
Cuando los dos extremos del
DNA se encuentran libres en la
clula hospedadora, se asocian
y el genoma adopta la forma de
un crculo bicatenario.
Infeccin de Lambda
Fijacin
El virin de Lambda se fija a una
protena de la pared celular de
Escherichia Coli
Inyeccin
Introduce
su DNA a
la clula
DNA se
circulariza
El DNA se circulariza
instantneamente
Ciclo ltico
Produccin de
RNA
Utiliza RNA polimerasa del hospedador
Comienza en sitios promotores (P
l
, P
R
)
Se producen
transcritos cortos
Son traducidos y dan las protenas N y Cro

Protena Cro y
Protena N
Proteina Cro: seleccin entre ciclo ltico y
lisognico
Proteina N: proteina antiterminadora
Proteina Q
Es una proteina antiterminadora
En una concentracin alta permite
sintetizar el transcrito R2.
Transcrito
R2
Origina las protenas tardas y las
necesarias para la lisis celular.
Proteina
Cro
Bloquea la transcripcin a partir de
P
l
y P
R
unindose a los operadores.
Mecanismo de accin de la proteina Cro
Despus del bloqueo se sintetizan
concatmeros de DNA lineal.
Los concatmeros son cortados en
fragmentos por una DNAasa, se cortan de
manera escalonada separadas por 12
nucletidos.
Las molculas de DNA se empaquetan en
las cabezas del fago y se les adiciona una
cola.
Finalmente la clula se lisa.
FASE LISOGNICA
Para prevenir la sntesis de
protenas tardas (aquellas
que conformaran al virin),
debe sintetizarse el producto
del gen cI, que es la protena
represora de lambda.
El promotor que puede
producir el mRNA del gen
cI durante la infeccin se
llama P
E
(promotor del
establecimiento de la
lisogenia).

Sin embargo, P
E
tiene que
ser activado.
Producto del gen cII
Promotor P
E

Protena cIII
Estabiliza (protege
de las proteasas)
activa
Se reprimir la sntesis de todas
las protenas codificadas por
lambda.
Se establece el
ciclo lisognico
El represor de lambda se une a O
L
y O
R
; y dentro de
estos operadores, se une al sitio 1 para inactivar a P
R

y P
L
. Gracias a esto, las protenas tardas no se
sintetizan y no se puede entrar al ciclo ltico.


Mantenimiento del estado lisognico


El promotor P
M
se activa cuando el represor se une al sitio 1.
Integracin
El represor de lambda slo se
produce tras la integracin del DNA
de lambda en el cromosma de E.
coli.
La expresin del gen int, que
codifica para la integrasa es
necesario para establecer la
lisogenia.
La integrasa es una
topoisomerasa, que cataliza
la recombinacin entre el
fago y el cromosoma
bacteriano.
Durante la replicacin del
DNA del hospedador, el DNA
de lambda se replica junto
con el resto del genoma
celular y se transmite a la
clulas de la progenie.
VECTOR DE CLONACIN
Un vector de clonacin es una molcula pequea
de ADN que puede replicarse de manera
autnoma en un husped.
Los vectores se utilizan para clonacin porque
pueden seguir su desarrollo normal a pesar de que
secuencias adicionales de ADN sean incorporadas
en su material gentico.
Fago
Lambda
como
vector de
clonacin
1/3 del DNA
puede ser
remplazado
por DNA
exgeno
Se aslan los brazos
y se ligan a un
segmento de DNA
de inters (con
una DNA ligasa)
Fago Lambda es cortado
con un enzima de
restriccin
(produce un brazo
izquierdo uno derecho y
una regin central)
Los vectores
entran en
clulas husped
y comienzan la
sntesis de
profagos.
LOS VECTORES DEL
BACTERIFAGO LAMBDA
PERMITEN LA CLONACIN DE
FRAGMENTOS DE DNA DE HASTA
23.000 PARES DE BASES.
Bibliografa
Michael T. Madigan. Biologia de los microorganismo.
10 edicin. Pearson.
Nelson, D.L. y Cox, M.M. (2005). Lehninger Principios
de Bioqumica. 4 edicin. Ed. Omega.