TEMA 10_ INGIENERÍA GENÉTICA

Definición: conjunto de técnicas de biología molecular que permiten el aislamiento, la amplificación, la

manipulación de fragmentos específicos de ADN y la generación de moléculas de ADN recombinante.
ADN recombinante: moléculas de ADN formadas por ADN procedentes de dos o más fuentes diferentes
1. REVISIÓN DE TÉCNICAS BÁSICAS
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las enzimas de restricción son producidas por las bacterias como un mecanismo de defensa contra las
infecciones víricas. Las enzimas de restricción reconocen secuencias de nucleótidos específicas en el ADN y
se unen a ellas, denominándose a ese lugar de unión sitio de restricción
La utilidad de las enzimas de restricción de cara a
la clonación se deriva de su capacidad de cortar el
ADN genómico en fragmentos de forma precisa y
reproducible.
La mayoría de las secuencias de reconocimiento
exhiben un tipo de simetría denominada
palíndromo: la secuencia nucleotídica se lee igual
en ambas cadenas del ADN en dirección 5'-3'.
Cada enzima de restricción reconoce su secuencia de reconocimiento específica y corta el ADN según un
patrón de corte característico. Enzimas como EcoRI y Hindlll hacen cortes desplazados en las dos cadenas de
ADN, produciendo así fragmentos con extremos colgantes de una sola cadena, denominados extremos
cohesivos. Otras enzimas como Alul y BalI cortan ambas cadenas en el mismo par de nucleótidos,
produciendo fragmentos de ADN con extremos de doble cadena, denominados fragmentos con extremos
romos.
Una de las primeras enzimas de restricción identificadas fue aislada de la cepa R de Escherichia coli y se
denominó Eco-RI.
VECTORES DE ADN
Los vectores son moléculas de ADN que aceptan fragmentos de ADN y replican los fragmentos de ADN
insertados cuando se colocan los vectores dentro de células huésped.
- Un vector contiene varios sitios de restricción que permiten la inserción de los fragmentos de ADN que
haya que clonar.
- Los vectores deben ser introducidos en células huésped para permitir la replicación independiente del
ADN del vector y de cualquier fragmento de ADN que transporte.
- Para diferenciar las células huésped que incluyen vectores de las que no, el vector debe transportar un
gen marcador seleccionable (normalmente un gen de resistencia a los antibióticos o el gen de una
enzima que esté ausente de la célula huésped).
- Muchos vectores incorporan secuencias específicas que permiten la secuenciación del ADN insertado
- El vector y su fragmento de ADN insertado deben poder aislarse fácilmente de la célula húesped, con el
fin de poder recuperar el ADN clonado para diversas aplicaciones.
Vectores plasmídicos bacterianos
Los plásmidos se introducen en bacterias mediante el proceso de transformación. Para la transformación
bacteriana se utilizan ampliamente dos técnicas principales: una de las técnicas implica tratar las células con
iones de calcio y utilizar un breve choque de calor para introducir el ADN en las células. La otra técnica,
denominada electroporación, utiliza un breve pulso eléctrico de gran intensidad para introducir el ADN en
las células bacterianas.
Puesto que los plásmidos tienen un
origen de replicación (ori) que permite la
replicación del plásmido, muchos de ellos
pueden incrementar su número de copias
existentes, de manera que pueden existir
varios centenares de copias en una única
célula huésped. Estos plásmidos
incrementan enormemente el número de
clones de ADN que pueden producirse.
Los vectores plasmídicos también se han
modificado mediante ingeniería genética
para incluir en ellos diversos sitios de
restricción, correspondientes a enzimas
de restricción comúnmente utilizadas; se
incluyen dentro una región denominada
sitio de clonación múltiple
La clonación de ADN mediante un plásmido suele comenzar cortando con una misma enzima de restricción
tanto el ADN del plásmido, como el ADN que queremos clonar
Sin embargo, al clonar ADN utilizando plásmidos, no todos estos incorporarán el ADN que hay que clonar.
Por ejemplo, un plásmido cortado con una enzima de restricción concreta, puede terminar cerrándose sobre
sí mismo (autoligado) si los extremos de corte del plásmido se pueden recombinar. Asimismo, durante la
transformación, no todas las células huésped incorporarán los plásmidos. Por tanto, tiene una gran
importancia poder identificar fácilmente, en un experimento de clonación, las células bacterianas que
contienen ADN recombinante. Una forma de hacer esto es utilizando los genes marcadores seleccionables
Los genes que proporcionan resistencia a antibióticos tales como la ampicilina y los genes como lacZ son
genes marcadores seleccionables muy efectivos. Un ejemplo de cómo utilizar estos genes para identificar las
bacterias que contienen plásmidos recombinantes. Este proceso se suele denominar selección «azul-
blanco».
En la selección azul blanco, se emplea un plásmido que contiene el gen lacZ incorporado dentro del sitio de
clonación múltiple. El gen lacZ codifica la enzima β-galactosidasa que se utiliza para cortar el disacárido
lactosa en sus monosacáridos componentes, glucosa y galactosa. La selección azul-blanco aprovecha la
actividad enzimática de la β-galactosidasa.
Plásmidos eucarióticos
Están basados en el plásmido
de 2 micras. Los YACs son
vectores lineares que deben
llevar telómeros para que no
se degrade el ADN por los
extremos y un centrómero
para que haya un reparto
equitativo cada vez que se
divida una levadura.
También contienen su origen
de replicación, un marcador
seleccionable y, en la región
central, una región donde se
clona un fragmento de ADN
de interés.
Otros tipos de vectores de clonación
Entre los primeros vectores utilizados en lugar de plásmidos, se encuentran los sistemas de vectores fágicos.
Entre estos se incluyen cepas genéticamente modificadas del bacteriófago A.
Los vectores fágicos fueron muy populares durante bastante tiempo y todavía se siguen utilizando hoy día,
porque pueden transportar insertos de hasta 45 kb, más del doble de longitud que los insertos de ADN
existentes en la mayoría de los vectores plasmídicos. Los fragmentos de ADN se ligan al vector fágico para
producir vectores A recombinantes que luego se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago y se
introducen en células huésped bacterianas que se hacen crecer sobre placas de Petri.
A medida que se reproducen, producen la lisis de sus células húesped bacterianas, dando lugar a las manchas
denominadas calvas, de las que se puede aislar fagos para posteriormente recuperar el ADN clonado
Los cromosomas bacterianos (BAC) y los cromosomas artificiales de levadura (YAC) son otros dos ejemplos
de vectores que puede utilizarse para clonar grandes fragmentos de ADN.
Los vectores de expresión están diseñados para garantizar la expresión mediante ARNm de un gen clonado,
con el propósito de producir en una célula huésped muchas copias de la proteína codificada por el gen. Hay
disponibles vectores de expresión para células huésped tanto procarióticas como eucarióticas.
GENOTECA GENÓMICA Y DE ADNc
Genotecas genómicas
Una genoteca genómica consta de muchos fragmentos solapados del genoma, con al menos una copia de
cada secuencia del ADN presente en el genoma de un organismo, abarcando entre todos los fragmentos el
genoma completo. Para crear una genoteca genómica, se extrae ADN de las células o tejidos, se corta con
enzimas de restricción y los fragmentos resultantes se insertan en vectores utilizando las técnicas que hemos
expuesto en la sección anterior. Puesto que algunos vectores (como los plásmidos) solo pueden transportar
unos pocos miles de pares de bases de ADN insertado, uno de los aspectos más importantes es seleccionar
el vector de modo que la genoteca contenga el genoma completo en el menor número de clones posible.
Puesto que el ADN genómico es el ADN foráneo introducido en los vectores, las genotecas genómicas
contienen segmentos codificantes y no codificantes, como por ejemplo intrones
Genotecas de ADN complementario (ADNc)
Las genotecas de ADN complementario (ADNc)
ofrecen ciertas ventajas con respecto a las
genotecas genómicas y continúan siendo una
metodología particularmente útil para la
clonación de genes. Esto se debe principalmente
a que una genoteca de ADNc contiene copias de
ADN —denominadas ADNc— obtenidas a partir
de las moléculas de ARNm de una población de
células y que representan, por tanto, los genes
que estaban siendo expresados en las células en
el momento de formar la genoteca. El ADNc es
complementario a la secuencia nucleotídica del
ARNm y por tanto, a diferencia de una genoteca
genómica que contiene todo el ADN de un
genoma —las secuencias codificantes de genes y
las no codificantes— una genoteca de ADNc solo
contiene los genes expresados.
Estas genotecas también se pueden utilizar para comparar los genes expresados en los tejidos normales y en
los tejidos afectados por alguna enfermedad
 TÉCNICAS MOLECULARES PARA EL ANÁLISIS DEL ADN
Cartografía de restricción
Si tuviéramos un fragmento, lo podemos separar mediante
electroforesis y, al someterse a una corriente eléctrica
(cátodo en pocillo, los fragmentos migran hacia el ánodo,
carga positiva). El gen formado de sacarosa y un tampón
salino hace que las moléculas de mayor tamaño se quedan
retenidas en la parte superior, y las de menor tamaño se
mueven hacia el ánodo. El bromuro de tidio sirve para
teñir las moléculas y poder observar el resultado en un
mapa de restricción.
Un mapa de restricción establece el número, el orden y las distancias entre los sitios de corte de las enzimas
de restricción en un segmento de ADN clonado, proporcionando así información acerca de la longitud del
inserto clonado y de la ubicación de los sitios de corte de las enzimas de restricción dentro del clon
Hibridación de ácidos nucleicos
El método de hibridación Southern (Southern blot) se puede
utilizar para identificar qué clones de una genoteca contienen una
secuencia de ADN y para caracterizar el tamaño de los fragmentos.
Las hibridaciones Northern proporcionan información acerca de la
expresión de genes específicos y se utilizan para estudiar patrones
de expresión génica en tejidos embrionarios, en el cáncer y en
trastornos genéticos. Las hibridaciones Northern también
permiten detectar moléculas de ARNm con un corte y empalme
alternativo (múltiples tipos de transcritos derivados de un mismo
gen) y para obtener otras informaciones acerca de los ARNm
transcritos. Si se utilizan como controles marcadores ARN de
tamaño conocido, las hibridaciones Northern pueden emplearse
para medir el tamaño de los transcritos de ARNm correspondientes
a un gen
La hibridación Western es una técnica ampliamente utilizada para
el análisis proteico. Por tanto, parte de la importancia histórica de
la hibridación Southern es que condujo al desarrollo de otros
modos de hibridación muy importantes que hoy día constituyen
herramientas clave para estudio de los ácidos nucleicos y las
proteínas.
La hibridación fluorescente in situ, o FISH, es una potente herramienta que se basa en hibridar directamente
una sonda con un cromosoma o ARN, sin el paso previo de obtención y separación de fragmentos.
 2. OTRAS TÉCNICAS

La PCR es un método rápido de clonar ADN que incrementa el potencial de las investigaciones mediante ADN
recombinante y elimina en muchos casos la necesidad de utilizar células huésped para la clonación.
Copiando una secuencia específica de ADN mediante una serie de reacciones in vitro, la reacción PCR puede
amplificar secuencias de ADN presentes inicialmente en cantidades muy pequeñas, para obtener una
población de moléculas de ADN
Si se desea, los productos de la reacción PCR pueden clonarse en vectores plasmídicos para utilizarlos en
experimentos adiciona
La PCR es una reacción en cadena, porque el número de nuevas cadenas de ADN se duplica en cada ciclo, y
las nuevas cadenas, junto con las antiguas, sirven como moldes para el ciclo siguiente. Este proceso se
automatiza mediante unos instrumentos denominados termocicladores, o simplemente máquinas CPR, que
pueden programarse para llevar a cabo un número predeterminado de ciclos
Un requisito clave para la PCR es el tipo de ADN pol utilizado en las reacciones PCR. La realización de múltiples
ciclos de PCR implica un calentamiento y enfriamiento repetidos de las muestras, lo cual termina por conducir
a una desnaturalización por calor y a una pérdida de actividad de la mayoría de las proteínas. Las reacciones
PCR dependen de que las formas termoestables de la ADN polimerasa sean capaces de soportar múltiples
ciclos de calentamiento y enfriamiento sin una pérdida significativa de la actividad
Los cebadores específicos de un gen proporcionan una forma de utilizar la PCR para rastrear las mutaciones
implicadas en los trastornos genéticos, permitiendo determinar de forma rápida la localización y naturaleza
de una mutación
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA
Podemos coger un plásmido e
introducirle una mutación utilizando
enzimas de restricción para que corten
el gen y produzcamos una delección.
También cuando hemos cortado el
fragmento podemos añadir un nuevo
gen (reemplazamiento). También hay
enzimas (exonucleasas) para producir
delecciones en unos nucleótidos
concretos (delección seriada con
nucleasas).
En el caso de que nuestro gen no
contenga la diana que necesitamos
para realizar la mutagénesis lo que se
puede hacer es utilizar cebadores en
los que hayamos cambiado algunos
pares de base y así poder introducir
mutaciones. Esto daría lugar si
replicamos el ADN a un plásmido
mutante y a otro silvestre. De la
misma manera se pueden diseñar
cebadores con más o menos
nucleótidos de la cuenta y como
resultado tendríamos un plásmido
con un inserto o un plásmido con una
delección (según el tipo de cebador
que hayamos usado)
ANÁLISIS GENÉTICO DIRECTO: se realizan mutando genes y realizándose pruebas (cruces, compelmentación,
etc…) para poder identificar que gen se afecta y que ocurre fenotípicamente
ANÁLISIS GENÉTICO INVERSO: seleccionamos un gen por similitud de secuencia, obtendríamos mutantes
dirigidos realizando alguna sustitución, delección, etc… para luego ver el fenotipo. Es decir, buscamos el gen
responsable de un fenotipo y comprobamos si ciertamente es así
TECNOLOGÍA CRISPR-Cas: técnica que se puede utilizar en todo tipo de organismos y tiene muchas
aplicaciones. Esta basada en secuencias repetidas de bacterias que se parecían mucho a la de los virus, y eran
sistemas inmunes de bacterias contra fagos, de forma que cada vez que un fago infecta a una bacteria esta
guarda la secuencia del virus para reconocerlo y defenderse contra él
Cas 9 es una endonucleasa que da lugar a una proteína que corta el material hereditario del fago, y más hacia
la izquierda hay una secuencia de ADN que se transcribe y da lugar a un tracrARN (que será necesario para
que Cas9 pueda cortar). Esta molécula de ARN junto a la proteína Cas9 y el ARN proveniente de la secuencia
de repeticiones del CRISPR (ARNcr precursor que lleva los espaciadores y los trozos de distintos virus) para
formar el complejo Pre-crARN:tracrARN:Cas9. Cas9 actúa como una enzima de restricción y cortará cuando
encuentre una secuencia concreta. Una ARNasa de tipo III va a cortar en un lugar determinado y dará lugar
a un complejo maduro de Cas9 y el crARN. De esta forma si llega un fago el complejo maduro va a hibridar y
va a reconocer el ADN del virus para cortarlo. Para cortar es necesario que la secuencia del ARNcr sea
complementaria del ADN que acaba de llegar (homología) y una secuencia PAM (3 nucleótidos NGG).
Finalmente, el ADN del virus queda degradado.
APLICACIONES DEL CRISPR-Cas: podemos introducir en un plásmido el gen de la Cas9, un ARN híbrido entre
el activador y el ARNcr, de esta forma la bacteria puede unirse junto a Cas9 y cortar el ADN. Podemos
introducir un ARN guía con el plásmido con Cas9 para que nos de los dos elementos de ARN. Otra opción es
introducir directamente el ARN con Cas9 o directamente la proteína Cas9. Otra posibilidad es introducir con
la ayuda de un fago el ARN guía y la proteína Cas9. Esto se puede hacer en células individuales, en un embrión
o en organismos como hongos y plantas.
El corte dentro de, por ejemplo, células de mamífero, se da porque un ARN guía diseñado para que sea
complementario a la secuencia que nos interese va a hibridar y realizar un corte de doble cadena a unos
pocos nucleótidos de la secuencia PAM. Este corte nos servirá para realizar mutaciones dirigidas. Una vez
que se ha realizado el corte se va a generar extremos no homólogos con fragmentos de cadena simple que
degrada y los pega. Si la célula intenta reparar el corte con el sistema NHEJ se generan inserciones o
delecciones pequeñas
En cambio, si queremos sustituir un gen o parte de este le podemos suministrar un fragmento de ARN o de
ADN de cadena sencilla que quisiéramos y que sirviera para hibridar con la zona alrededor del corte y por
recombinación homóloga.
 3. INGENIERÍA GENÉTICA EN ORGANISMOS MULTICELULARES
Vectores Ti para células vegetales
Una técnica ampliamente utilizada para la inserción de
genes en células vegetales utiliza la bacteria del suelo
Rhizobium radiobacter, que infecta las células de las
plantas y produce tumores (denominados agallas) en
muchas especies vegetales. Antiguamente llamada
Agrobacterium tumefaciens, esta bacteria fue
renombrada basándose en el análisis genómico.
Rhizobium contiene un plásmido denominado plásmido
Ti (inductor de tumores), y la formación de tumores está
asociada con la presencia de genes concretos en el
plásmido Ti. En la naturaleza, cuando las bacterias que
transportan el plásmido Ti infectan las células vegetales,
se transfiere al genoma de la célula vegetal huésped un segmento del plásmido Ti, denominado ADN-T. Los
genes del segmento ADN-T controlan la formación de tumores y la síntesis de los compuestos requeridos
para el crecimiento de las bacterias que han causado la infección.
Pueden utilizarse los sitios de restricción de los
plásmidos Ti para insertar ADN foráneo,
introduciéndose vectores recombinantes en
Agrobacterium mediante transformación. Los
genes inductores de tumores de los plásmidos Ti
se eliminan del vector, para que el vector
recombinante no provoque la formación de
tumores. Las Agrobacterium que contienen ADN
recombinante se mezclan con células vegetales
(no todos los tipos de células vegetales pueden ser
infectadas por Agrobacterium). Una vez dentro de
la célula, el ADN foráneo se inserta en el genoma
de la planta cuando el ADN-T se integra en un
cromosoma de la célula huésped.
Las células vegetales que transportan un plásmido Ti recombinante pueden crecer en un cultivo de tejidos.
La presencia de ciertos compuestos en las células vegetales en el medio de cultivo estimula la formación de
raíces y brotes, terminando por formarse una planta madura que transporta un gen foráneo (plantas
transgénicas).

INTRODUCCIÓN DE ADN EN CÉLULAS ANIMALES

En estas podemos inyectar el ADN que queramos con inyecciones o con un virus. Al gen que se integrará se
conoce como transgén. Al igual que con bacterias podemos realizar transformación.
Cuando el ADN se queda dentro del núcleo lo que sucederá es que
como las secuencias son homólogas que dará lugar a una única
recombinación que dará como resultado una duplicación del gen A
(alelo mutado, el vector y le sigue el silvestre). En otros casos, el
ADN se integra fuera del sitio (integración ectópica), por lo que
obtendremos 2 alelos (el mutado y el silvestre en cromosomas
diferentes). Lo que más frecuentemente ocurre es que haya
integración ectópica (en todos los organismos suele pasar esto),
también puede haber integración homóloga pero es muy rara que
ocurra
 ANIMALES MODIFICADOS GENÉTICAMENTE

• Transgénico: Un animal transformado con un gen extra (transgén). Dicho transgén puede ser de
procedencia exógena o una copia extra de un gen propio. La integración es, por lo tanto, ectópica.
• Knock-out (KO): Se sustituye todo o parte de un gen por una secuencia alternativa que se puede
seleccionar (marcador). Así se elimina la función del gen. Por integración homóloga.
• Knock-in: Se sustituye la secuencia de un gen por un alelo diferente, normalmente acompañado de un
marcador para poder seleccionar las células que los portan. Por integración homóloga.
OBTENCIÓN DEL ANIMAL QUIMÉRICO

Un animal quimérico tiene células con dos orígenes genéticos diferentes)

OBTENCIÓN DEL ANIMAL MODIFICADO HOMOCIGÓTICO
Ahora tenemos que coger ese
animal quimérico y cruzarlo
con un animal homocigótico de
genotipo silvestre para que den
lugar a una nueva generación y
los cruzamos entre sí para
seleccionar los homocigóticos
para el gen que queremos
mutar. Este proceso es muy
laborioso y costoso por lo que
actualmente se utiliza CRISPR
para realizar esto.
 ANIMALES MODIFICADOS GENÉTICAMENTE
Utilizaremos un ARN guía y la
proteína Cas9 que se
ensamblarán formando un
complejo. Esto lo introducimos en
unos zigotos y les haremos una
electroporación (introducir ADN
mediante corrientes eléctricas).
Estos zigotos se introducen en la
hembra y algunos de los zigotos
que nazcan tendrán integrado el
ARN guía y serán albinos.
También se pueden coger los zigotos y cultivarlos para realizar un genotipado (por PCR o Southern)
ANÁLISIS DE LOS ANIMALES MODIFICADOS

4. APLICACIONES DE LA INGIENERÍA GENÉTICA

BIOTECNOLÓGICAS
- Producción de sustancias de interés
- Mejora vegetal y animal
BIOMÉDICAS
- Prevención y diagnóstico
- Terapia génica germinal y somática
PRODUCCIÓN DE INSULINA HUMANA EN E. COLI
 PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS EN LA LECHE

DIAGNÓSTICO
- PCR y RT-PCR para detectar infecciones en muestras clínicas
- PCR, hibridación o secuenciación para detectar mutaciones asociadas al cáncer en ADN circulante
libre de células en sangre
- Diagnóstico prenatal a partir de ADN circulante libre de células en la sangre de mujer embarazada
- Genómica personal