U.T.

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CLONACIÓN DE ACIDOS
NUCLEICOS
 LOS MÉTODOS DE CLONACIÓN MOLECULAR

La clonación molecular es un proceso de amplificación

in vivo de secuencias de ADN genómico o de ADNc
basada en la tecnología de ADN recombinante.

La tecnología del ADN recombinante es una aplicación

importante de las endonucleasas de restricción en
biología molecular que permite crear las moléculas de
ADN recombinante que serán introducidas en una
célula huésped.
Por multiplicación de estas células en cultivo se consiguen
multitud de copias del ADN recombinante y, en consecuencia,
del fragmento amplificado de interés
 Creación de moléculas de ADN recombinante

Recordar ADN recombinante y enzimas de restricción en U.T. 4: EL ADN

COMO MOLÉCULA PORTADORA DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA
Esquema general de la clonación. Una vez que se ha conseguido la
molécula de ADN recombinante adecuada y se ha introducido en el
huésped adecuado, se genera un clon de células genéticamente idénticas
(todas portan el vector recombinante) que se pueden almacenar y
propagar en cultivo indefinidamente.
 COMPONENTES DE LA CLONACIÓN
Los vectores de clonación
Los vectores de clonación son moléculas de ADN que pueden
replicarse autónomamente en una célula huésped y que permiten la
inserción de ADN extraño, sin perder esa capacidad de replicación
autónoma

Se caracterizan por:

•Tener un origen de replicación que le permita replicarse en la célula

huésped junto con el fragmento de ADN extraño que transporta.
•Tener, como mínimo, un sitio de inserción de ADN extraño.
•Contener algún marcador de selección, que permita distinguir las
células que portan el vector de aquellas que no lo portan.
•Contener un marcador de identificación, que permita distinguir las
células que portan un vector recombinante.
 Tipos de vectores
Plásmidos
Los plásmidos son moléculas circulares de ADN bicatenario
extracromosómico de origen bacteriano con capacidad
autónoma de replicación.
Para cada caso particular de
clonación, a la hora de elegir el
plásmido idóneo intervienen dos
parámetros importantes:

•El tamaño del inserto que puede

transportar.
•El número de copias del plásmido
por célula que puede alcanzar tras
su replicación en la célula
hospedadora.
ESTRUCTURA DEL pBR322

El pBR322 puede transportar

fragmentos de ADN
relativamente pequeños, de
entre 3,5 y 5 kb, y el número de
copias por célula es alrededor de
20.

Estructura del plásmido pBR322

con la localización del origen de
replicación (Ori), los genes de
resistencia a la ampicilina y la
tetraciclina y las dianas de
restricción
ESTRUCTURA DEL pUC18
El pUC18 es utilizado ampliamente por su capacidad para aceptar
insertos de hasta 10 kb y su alta tasa de replicación (alrededor de 500
copias por célula).

Estructura del plásmido pUC18 con la localización del origen de

replicación (Ori), el gen de resistencia a la ampicilina, el gen LacZα y el
polylinker con las dianas de restricción.

Polylinker : Secuencia de
DNA obtenida in vitro que
contiene múltiples sitios
de reconocimiento para
enzimas de restricción.
Generalmente se
incorporan a vectores de
clonamiento. 
Bacteriófagos
Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan bacterias.
Uno de los fagos más utilizados como vector de clonación: el
fago lambda (fago λ). En estos vectores se pueden incluir
insertos de hasta 20 kb.
Estructura del genoma del fago λ.

Su utilización como vector implica la sustitución de la región central por

ADN extraño, previa digestión con EcoRI. La molécula recombinante
puede circularizar gracias a las secuencias COS de los extremos. Estas
secuencias son necesarias para su empaquetamiento dentro de la
cápside vírica
Cósmidos
Los cósmidos son vectores híbridos
construidos con parte del
cromosoma del fago λ y parte de un
plásmido bacteriano.
Concretamente, contienen las
secuencias cos del fago λ, junto con
el origen de replicación de un
plásmido, un gen de resistencia a
antibióticos y un polylinker.

La presencia de las secuencias cos

permite empaquetar estos vectores
dentro de cápsides de fagoλ. Este
tipo de vectores admite insertos de
mayor tamaño, de hasta 50 kb
Fagémidos

Los fagémidos son también vectores híbridos compuestos por

un plásmido (con su origen de replicación bacteriano) al que se
le inserta el origen de replicación de un fago M13.
Cromosomas artificiales

Los cromosomas artificiales son vectores de clonación con

capacidad de transportar fragmentos de gran tamaño.
•Cromosomas artificiales bacterianos (BAC) pueden transportar
insertos de ADN extraño de hasta 300 kb.

Estructura de un cromosoma artificial

bacteriano (BAC), basado en el
plásmido F de E. coli. El BAC
mantiene los genes que controlan la
replicación y el número de copias del
plásmido, un origen de replicación,
un gen de resistencia al cloranfenicol
y unpolylinker en el interior del gen
LacZ.
Cromosomas artificiales de
levaduras (YAC):
son los vectores de mayor capacidad
ya que pueden transportar insertos
mayores de 1 Mb.

Estructura de un cromosoma artificial de

levadura (YAC) que contiene un origen
de replicación (Ori), un centrómero
(CEN), dos secuencias teloméricas (TEL),
dos marcadores de selección (A y B) y un
polylinker en el interior de un gen de
identificación (C). Mediante tratamiento
con la enzima de restricción 1 (Enz 1) se
lineariza el YAC.
Vectores lanzadera

Los vectores lanzadera o vectores transbordadores son

un tipo de vectores híbridos que contienen orígenes de
replicación de dos hospedadores diferentes, normalmente
uno de plásmido bacteriano y otro de levadura o de virus
animal
Células hospedadoras

Las células hospedadoras son aquellas en las que se

introduce el vector de clonación para su amplificación
mediante replicación.
Células hospedadoras bacterianas.

Las bacterias son las células más ampliamente utilizadas

como hospedadoras para clonar plásmidos, fagos y
cósmidos, por:

• la escasa complicación técnica que supone su

manipulación,

•su gran versatilidad

•la rapidez con que crecen.

Se suelen usar cepas defectivas especiales que carecen de
algunas actividades enzimáticas para favorecer la
estabilidad de los vectores:

•Suelen carecer de exonucleasas para evitar la degradación

de vectores de clonación lineales.

• Suelen carecer de genes que controlan la recombinación

génica, para evitar la integración del vector en el cromosoma
bacteriano.
La bacteria más utilizada en clonación es E. coli, en concreto la cepa K12, pero se
pueden utilizar otras especies, como Bacillus subtilis y especies del género
Streptomyces

Bacillus subtilis E. Coli K12

 Células hospedadoras eucariotas.

•Levaduras
Las levaduras son organismos eucarióticos unicelulares
que crecen de manera similar a las bacterias en medios
de cultivo sólidos y líquidos.

Se utilizan como hospedadores para clonar YAC.

La levadura más utilizada en clonación es S. cerevisiae,

aunque se pueden emplear otras especies, como Pichia
pastoris y Hansenula polymorpha.
Saccharoomyces cerevisiae
• Células vegetales y animales

Se utilizan principalmente en experimentos de clonación encaminados a la

inserción de genes extraños en el genoma de la célula hospedadora y su
posterior expresión para obtener organismos transgénicos.
En el caso de las células En el caso de células animales
vegetales, se suelen utilizar se suelen utilizar vectores
vectores basados en el plásmido Ti víricos, como los derivados del
de la bacteria Agrobacterium genoma de baculovirus, que
tumefaciens infectan células de insectos, o
retrovirus, que infectan células
de mamíferos.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN
Creación de un vector recombinante
Un vector recombinante es aquel que contiene un inserto de ADN extraño.
Preparación del ADN que se va a clonar

La forma más habitual de dotar a un ADN bicatenario de extremos

cohesivos es tratarlo con una enzima de restricción que genere ese
tipo de extremos
Esta digestión genera múltiples fragmentos de diferentes tamaños,
alguno de los cuales contendrá la secuencia de interés.

Cuando se quiere clonar solo un gen es preferible amplificar

previamente el ADN que se quiere clonar mediante PCR.
Preparación del vector de clonación.
Consiste principalmente en digerirlo con la misma enzima de
restricción que se utilizó para preparar el ADN que se va a clonar.

•Vector circular, con diana de restricción única (la mayoría de los

plásmidos).

•Vector circular con dos dianas de restricción.

•Vector lineal con diana de restricción única.

•Vector lineal con dos dianas de restricción (como el fago λ).

Inserción del ADN extraño en el vector
La inserción del ADN extraño en el vector de clonación se realiza
mezclando ambos en las concentraciones adecuadas e incubándolos en
las condiciones óptimas para que las dos moléculas se unan a través de
los extremos cohesivos generados por la misma enzima de restricción
mediante complementariedad de bases, en presencia de una ADN ligasa.

Esta reacción se denomina ligación

Introducción del vector en la célula hospedadora
Transformación bacteriana

La transformación bacteriana consiste en la captación e internalización por

parte de una bacteria de moléculas de ADN desnudas presentes en el
medio externo. Solo pueden realizarlo aquellas que se denominan
«competentes».

La transformación más habitual para E. coli consiste en un tratamiento

químico (con Cl2Ca) y físico (choque térmico), que aumenta la
permeabilidad de la pared y la membrana celulares

La competencia es un fenómeno que se da de forma natural en algunos

géneros bacterianos como Streptococcus, Bacillus, Pseudomonas.
Transfección

La transfección es un proceso similar a la transformación

bacteriana, pero en células hospedadoras eucarióticas,
principalmente animales.
Añadir el vector recombinante en una solución tamponada de fosfato
cálcico sobre un cultivo de células animales en monocapa. El vector
coprecipita junto con el fosfato cálcico sobre las membranas celulares y es
introducido en el interior de la célula por endocitosis.

Incluir el vector
en el interior de
liposomas. Estos
se fusionan con
las membranas
celulares y
liberan su
contenido al
interior de la
célula.
Transducción
La transducción consiste en la introducción de material
genético extraño en una célula por la acción de un virus.
Electroporación

La electroporación consiste en aplicar cortos pulsos eléctricos de alto

voltaje a una mezcla de células hospedadoras en suspensión y vectores
recombinantes en solución.

pulsos aumentan la
permeabilidad de las
membranas
 Selección e identificación de clones recombinantes
Una vez terminado el proceso de introducción del vector en la
célula hospedadora, se obtiene una mezcla con tres tipos de
células:

•Células no transformadas, que no han captado ninguna

molécula de ADN extraño.

•Células transformadas que portan el vector recombinante

específico.

•Células transformadas que portan un vector no recombinante

o alguna molécula de ADN no deseada producida durante la
ligación.

Este proceso está condicionado por los marcadores genéticos que porta
el vector.
Selección e identificación de colonias con plásmidos recombinantes basados en dos
genes de resistencia a antibióticos

En una placa con ampicilina crecen todas las bacterias transformadas,

puesto que todos los vectores conservan intacto el gen de resistencia para
ese antibiótico. En la placa con tetraciclina solo crecen las bacterias
transformadas con el plásmido no recombinante, ya que en el plásmido
recombinante el gen de resistencia a la tetraciclina se ha inactivado por
inserción del ADN extraño.
 Tasa de transformación
La tasa de transformación mide la eficiencia de la introducción del vector
en la célula hospedadora.

Tasa de transformación= UFC x Vt / C x Vs

Vt es el volumen total de la solución en la que se realiza la
transformación (µl);
C, la cantidad del vector empleado (mezcla que incluye vector
recombinante y vector no recombinante) (µg);
Vs , el volumen de suspensión bacteriana transformada
utilizada para sembrar una placa de medio de cultivo sólido
con antibiótico y
UFC, las unidades formadoras de colonias que crecen en
dicha placa.
La tasa de transformación se expresa, entonces, como
número de células transformadas/µg de vector.
 BIBLIOTECAS DE ADN
Una biblioteca o librería de ADN es una colección de vectores recombinantes
clonados cuyas secuencias de ADN extraño se han obtenido de un único
organismo.
 Tipos de bibliotecas de ADN
Bibliotecas genómicas.
Son colecciones de vectores recombinantes clonados que incluyen el
genoma completo de un organismo. En una biblioteca genómica están
representados, supuestamente, todos los genes de un organismo.
Bibliotecas cromosómicas.
Son bibliotecas de ADN construidas a partir de un único cromosoma o
fracción cromosómica. Se fabrican partiendo de un único cromosoma
previamente aislado de células mitóticas en metafase, bien por
microdisección, centrifugación en gradiente de densidad o citometría de
flujo.
Bibliotecas de ADNc.
Se obtienen a partir del ARNm de un tejido o una población celular
determinada, previa transcripción inversa con una retrotranscriptasa
 Análisis de una biblioteca de ADN
1.- La identificación del clon o clones que contienen un gen o una
secuencia concreta

2.- El paseo cromosómico o identificación de clones que porten

secuencias consecutivas

3.- La secuenciación. El análisis definitivo de un clon consiste en

descifrar la secuencia del ADN insertado que porta el vector
recombinante
 APLICACIONES DE LA CLONACIÓN MOLECULAR

La clonación en vectores de expresión, que posibilitan la

producción a nivel industrial de proteínas recombinantes.
Como ejemplo, podemos citar:

•De interés médico y farmacéutico: la insulina, la hormona

del crecimiento, el factor VIII, vacunas, reactivos para
diagnóstico, etc.

•De interés en la industria química y de la alimentación:

enzimas y catalizadores.

•De interés medioambiental: la creación de

microorganismos capaces de metabolizar petróleo, productos
tóxicos y materiales de desecho, etc.
La clonación mediante inserción de genes en el genoma de
células vegetales o animales. OMG.

Con estas técnicas se pueden transferir directamente

caracteres de interés a plantas y animales, produciéndose
individuos más resistentes a enfermedades o a productos
tóxicos, más fértiles, con mayores tasas de producción,
etc.
Ratones transgénicos.
Un ratón transgénico es aquel al que se le ha modificado su
ADN, ya sea por la introducción de un gen nuevo o por la
eliminación de un gen propio.
Una aplicación importante de los ratones transgénicos es el
estudio de enfermedades genéticas, tanto a nivel de
comprensión de la enfermedad, como a nivel de tratamiento

Ratones knockout, en los

que se inactiva un gen Ratones knockin, en los
determinado, bien por que un gen normal es
deleción de gran parte de sustituido por otro mutado
él, bien por inserción de
otro gen distinto, que
interrumpe la secuencia
codificante del gen que se
quiere inactivar.
Terapia génica.

La terapia génica consiste en transferir genes normales a

células somáticas para corregir una enfermedad genética.
Con esto se pretende conseguir que las células tratadas
sinteticen el producto génico normal, evitando así un
tratamiento farmacológico de por vida.