BIOLOGÍA MOLECULAR

TEMA 1 INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA MOLECULAR

- La biología molecular nace en 1953 de la mano de Watson y Crick con el descubrimiento del
ADN.

RUTAS DE INFORMACIÓN: Estas se comprenden dentro la biología molecular. Son procesos que
permiten a las células, mantener, propagar y expresar la información genética (sintetizar
macromoléculas o enzimas) (secuencias de nucleótidos).

DOGMA CENTRAL

- Con el descubrimiento del DNA en 1953 y su estructura de doble hélice pasan a considerarse las
biomoléculas como portadoras de información.

- Crick plantea el dogma central de la biología en 1958 que explica el flujo de información en todas
las células (unidireccional). Se basa en:

-Los virus no siguen este dogma

(no son células) retrovirus, transcriptasa inversa.

DNA RECOMBINANTE

El material genético se puede manipular, esto ocurre en la ingeniería genética. Se pueden crear
nuevas secuencias no existentes en la naturaleza, esto cobra importancia en la salud y la
biotecnología. (clonación, sobreexpresión de proteínas y transgénicos).

CLONACIÓN DEL DNA

- También se pueden clonar organismos concretos (pueden no ser 100% iguales debido a la
regulación de la expresión genética en el desarrollo).

- Clonación del DNA, se crean copias idénticas de un fragmento del DNA, es decir un gen. Además
se puede producir el aislamiento de un gen específico a partir de un determinado organismo y
amplificación en el organismo diana.

Etapas:
– Cortar el DNA en los límites del gen
– Seleccionar un vector apropiado
– Insertar el gen en el vector
– Insertar el vector recombinante en la célula huesped
– La célula huesped produce múltiples copias del DNA
recombinante

1
Paso 1: generar un vector recombinante

- Este se obtiene a partir de endonucleasas de restricción y DNA ligasa

Las endonucleasas de restricción rompen el enlace fosfodiéster en secuencias específicas de DNA.

Presentes en bacterias, reconocen y cortan el DNA foráneo. El corte puede ser escalonado (extremos
cohesivos) o rectos (extremos romos). A la hora de cortar reconocen secuencias de entre 6 y 8
nucleótidos.

- Por qué la enzima de restricción corta el DNA foráneo y no el de la propia bacteria?

Esto se debe a que otra enzima métila el DNA propio de manera que sea reconocible para las
endonucleasas.

- La DNA ligasa une los dos fragmentos con enlaces covalentes

– Funciona normalmente en reparación del DNA
– DNA ligasa humana usa ATP
– DNA ligasa de bacterias usa NAD

PASO 2 Introducir el vector recombinante en una célula huesped

PASO 3 Selección de las células transformadas

- En este caso al plásmido que contiene ese nuevo DNA recombinante también se le añade
resistencia a antibióticos como la penicilina y ampicilina (matan bacterias). De manera que una vez
introducidos los plásmidos en las bácterias, en el crecimiento de estás últimas solo crecerán aquellas
bacterias que hayan asimilado el plásmido, ya que las otras al ponerlas en cultivo, morirán.

PASO 4 Identificación de células transformadas con vector recombinante

- En este paso todas las células huesped tienen el plásmido, pero no se sabe si contienen el gen que
se quiere clonar o no. De manera que se produce como con el paso anterior, la puesta de dos
cultivos en diferentes placas, una con agar y la otra con agar+tetraciclina. Aquellas que crezcan solo
en el agar serán las que contengan DNA foraneo, mientras que las que crezcan en ambas no.

VECTORES DE CLONACIÓN

Los vectores de clonación permiten la clonación y amplificación de fragmentos de DNA.

VECTOR: Se define como una molécula de ADN de doble cadena (DNAds), con capacidad de
albergar un fragmento de ADN exógeno (de otro origen).

Tipos:
• Plásmidos
– Moléculas de DNA circular que se encuentran separados del genoma de la bacteria
– Se replican de forma autónoma
• Con orígenes de replicación para uso en bacterias y/o levaduras
– Portan genes de resistencia a antibióticos
– Permiten clonación de DNA hasta 15.000 pb
• Para clonar cromosomas completos (hasta 300.000 pb)
– Cromosomas bacterianos artificiales (BAC)
• Para uso en bacterias
– Cromosomas artificiales de levadura (YAC)

2
BIBLIOTECAS GENÓMICAS

• Una genoteca de DNA es una colección de clones de DNA reunidos con objeto disponer de una
fuente de DNA para secuenciar, descubir nuevos genes o para estudios de la función de un gen o
proteína
• Las más extensas son las genotecas genómicas. El genoma completo de un organismo se corta en
millares de fragmentos y cada uno se inserta en un vector de clonación
• El primer paso es la digestion parcial del DNA con endonucleasas de restricción

Genotecas cDNA: solo contiene los genes que se expresan (codificación de proteínas)

Por poner un ejemplo, tanto una neurona como una célula muscular tienen el mismo genoma, no
obtante esto no quiere decir que se expresen los mismos genes en una y la otra. De manera que para
crear estas genotecas de cDNA lo que se aisla es el ARNm (ya que este es el responsable de la
codificación de proteinas). Una vez aislado el ARNm de una célula, se puede utilizar como molde
para crear una cadena de ADN, como hacen los retrovirus, gracias a una enzima especial llamada
transcriptasa inversa.

- En primer lugar se genera una cadena híbrida, con una hebra de ARNm y una de ADN.
Seguidamente estas dos hebras se separan y se utiliza la nuevamente creada hebra de ADN para
codificar una nueva, formando así el cDNA.

- Como se hace?
Toda cadena de ARNm lleva en su extremo una cola poliA en el extremo 3’ (el ARNm tiene
polaridad), de manera que cuando se quiere formar esta primera cadena de ADN, se utiliza como
cebador una oligo-dT, COMPLIMENTARIO A ESTA COLA.

La cadena híbrida se rompe con la subida del pH a medio alcalino y la degradación del ARNm

Objetivos de la clonación molecular

• Investigación básica
– Identificar genes
– Determinar la función de genes desconocidos
– Estudiar el transcriptoma (conjunto de ARNm de una célula) y el proteoma (conjunto de
proteínas de una célula)
– Estudiar interacciones DNA-proteína y proteína-proteína
• Biotecnología
– Producción de proteínas de interés
– Producción de vacunas
– Animales y plantas transgénicas
• Medicina
– Terapia génica

EXPRESIÓN DE GENES CLONADOS

- El mayor interés de los genes clonados suele ser su producto, sobre todo si la proteína tiene valor
comercial, terapéutico o para investigación
• La expresión de genes clonados puede producir grandes cantidades de proteína
• Se requieren plásmidos especiales, llamados vectores de expresión, que contienen secuencias que
permiten la expresion del gen insertado
• Vectores de expresión se diferencian de vectores de clonación por tener:
– Secuencias promotoras
– Secuencias operadoras
3
– Sitio de unión al ribosama
– Secuencias de terminación de la transcripción

- La diferencia principal entre un vector de

clonación y un vector de expresión es que los
vectores son de clonación, su finalidad es el
almacenamiento de secuencias y la obtención de
grandes cantidades del ADN insertado o de la
molécula recombinante. Mientras que los vectores
de expresión son aquellos cuyo objetivo es producir
un transcrito (ARN) o la proteína producto de ese
transcrito. Los vectores de expresión pueden ser
plásmidos o fagos.

-Cualquier organismo puede servir de huesped para expresar proteínas de una especie diferente
(heterólogas)

• Sistemas de expression:
– Bacterias
– Levaduras
– Insectos y virus de insectos (baculovirus)
– Células de mamífero en cultivo

MUTAGÉNESIS DIRIGIDA

Esta técnica ha permitido estudiar la estructura y función de las proteínas al introducer cambios
específicos en la estructura primaria. Los cambios en la secuencia de aminoácidos se introducen
alterando la secuencia de nucleótidos del gen clonado. El plásmido mutado debe ser secuenciado
para confirmar que la mutación deseada (y solo la deseada) está presente.

4
PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA)

• Se usa para amplificar DNA en el tubo de ensayo (in vitro)

– Puede amplificar una región de interés en DNA lineal

– Puede amplificar DNA circular completo (plásmido)

• Mezclar:

– DNA diana (se deben conocer los extremos)

– Cebadores (oligonucleotidos complementarios a dos regiones en el DNA diana)
– Nucleótidos: dATP, dCTP, dGTP, Dttp
– DNA polimerasa termoestable

• Colocar la mezcla en un termociclador

FASE 1 – Calentar DNA a 95 ºC (para separar las hebras)
FASE 2 – Enfriar hasta 50–60°C (se une el cebador)
– Los cebadores se aparean con las regions complementarias
FASE 3 – Calentar a 72ºC
-- La polimerasa extiende los cebadores en la dirección 5’→ 3’
– Completado el ciclo, repetir todos los pasos

SEPARACIÓN DE DNA POR ELECTROFORESIS

- Se utiliza como técnica para separar moléculas según su tamaño

- El DNA presenta carga negativa (debido al grupo fosfato), y por tanto migra hacía el anodo
(positivo), siempre en presencia de un campo eléctrico.
- El gel de agarosa dificulta la movilidad del DNA
- La mobilidad depende del tamaño y la forma
– Moléculas pequeñas → más rápido
– Moléculas compactas → más rápido

Usos:
– Análisis del DNA
– Purificación del DNA
– Estudios de interacciones DNA-proteina

GENOTIPADO DEL DNA

-El método se basa en el polimorfismo de secuencia.

- Las repeticiones cortas en tánden (STR) tienen comúnmente 4 pb de longitud y se repiten de 4-50
veces.
- Se han caracterizado 20.000 loci STR y pueden haber más de un millón en el genoma humano.

PURIFICACIÓN DE PROTEINAS RECOMBINANTES

Aplicación del etiquetado de proteínas

• La cromatografía de afinidad es uno de los métodos más eficientes de purificación de proteínas
(No es aplicable a muchas proteínas)
• En este caso, el gen que codifica la proteína de interés se acopla a un gen que codifica un péptido
que se une a un ligando con alta afinidad y especificidad
• El péptido usado con esta finalidad se llama etiqueta
• El producto de este tipo de genes se denomina proteína de fusión4
5
 BIOLOGÍA MOLECULAR

TEMA 2. NUCLEÓTIDOS Y ÁCIDOS NUCLEICOS

FUNCIONES DE NUCLEÓTIDOS Y ÁCIDOS NUCLEICOS

Ácidos nucleicos, polímeros de nucleótidos con función:

- Almacenar información genética DNA

-Transmisión de información genética ARNm
- Procesamiento de información genética (ribozimas, ARN con capacidad catalítica)
- Síntesis de proteínas ARNt y ARNr

Nucleótidos, en forma monomérica, función:

- Energía para el metabolismo ATP

- Cofactores enzimáticos NAD+
- Transducción de señales AMPc

ESTRUCTURA DE UN NUCLEÓTIDO

- Base nitrogenada ATGCU

- Pentosa, ribosa o desoxiribosa NUCLEÓTIDOS
- Fosfato

- Base nitrogenada
- Pentosa NUCLEÓSIDO

+ Los átomos de C y N de la base nitrogenada se numeran de forma cíclica.

+ Los C de la pentosa se designan con una comilla para evitar las confusiones (1’-5’)

GRUPO FOSFATO

- Carga negativa a pH neutro

- Unido a la posición 5’
- Un ácido nucleico se forma a partir de la versión 5’-trifosfato del nucleótido
- Dos de los tres fosfatos de los nucleótidos trifosfato usados para formar los ácidos nucleicos se eliminan y
solo queda un fosfato por nucleótido
- Pueden unirse a otras posiciones para cumplir funciones especializadas

PENTOSA

- β-D-ribonucleasa en RNA
- β-2’-desoxi-D-ribofuranosa en DNA

El anillo de ribosa no es plano y puede adoptar distintas conformaciones

dependiendo de la posición de los C respecto al plano del anillo.
Los C1 y C4 siempre están en el mismo plano
Los C2 y C3 pueden estar por encima (ENDO) o por debajo (EXO) del plano del anillo.

1
BASES NITROGENADAS

- Son derivados de la pirimidina o la purina

- Heterociclos aromáticos que contienen N
- Estructuras planas
- Absorben lus UV (250–270 nm) se debe a las transiciones
electrónicas π → π* (estado excitado del orbital)
Los estados excitados de las bases decaen rápidamente mediante transiciones sin emitir radiación
– Proporciona fotoprotección al material genético
– Los AN no emiten fluorescencia

Características de las bases nitrogenadas:

- Citosina, adenina y guanina se ecuentran tanto en DNA como en RNA

- Timina solo en DNA
- Uracil solo en RNA
- TODAS son buenos dadores y aceptores de puntes de H
- Neutras a pH 7

BASES PÚRICAS BASES PIRIMIDÍNICAS

Adenina: desoxiadenilato (desoxiadenosina 5’-monofosfato) (A, dA, dAMP)

Guanina: desoxiguanilato (desoxiguanosina 5’-monofosfato) (G, dG, dGMP) desoxirribonucleótidos
Timina: desoxitimidilato (desoxitimidina 5’-monofosfato) (T, dT, dTMP)
Citosina: desoxicitidilato (desoxicitidina 5’-monofosfato) (C, dC, dCMP)

Adenina: adenilato (adenosina 5’-monofosfato) (A, AMP)

Guanina: guanilato (guanosina 5’-monofosfato) (G, GMP) ribonucleótidos
Uracil: urilato (uridina 5’-monofosfato) (U, UMP)
Citosina: citidilato (citidina 5’-monofosfato) (C, CMP)

2
ENLACE β-N-GLUCOSÍDICO

- En los nucleótidos, el anillo de la pentosa se une a la base nitrogenada mediante este enlace
- Interviene el carbono anomérico del azucar (pentosa) en conformación β que se une a:
- La posición N1 en las pirimidinas
- La posición N9 en las purinas
- Bastante resistente a la hidrólisis (sobretodo pirimidínicas)
-La hidrólisis se puede catalizar mediante un ácido.

Conformación alrededor del enlace N-glucosídico

- Los nucleótidos libres pueden rotar libremente alrededor del enlace

- La secuencia de átomos para elegir el ángulo es:
- O4’-C1’-N9- C4 para purinas
- O4’-C1’-N1-C2 para pirimidinas
- Si el ángulo es próximo a 0° , la conformación es sin
- Si el ángulo es próximo a 180° , la conformación es anti
- La conformación anti es la presente en el B-DNA

TAUTÓMEROS EN LAS BASES NITROGENADAS

- La tautomería prototrópica hace referencia a isómeros estructurales que difieren en la localización de

protones
- La tautomería ceto-enólica es frecuente en las cetonas
- La tautomería lactama-lactima tiene lugar en algunos heterociclos. Los dos tautómeros están presents en
disolución pero la forma lactama predomina a pH neutro

Nucleósidos minoritarios en el ADN

-5-metil-citosina: es común en las eucariotas
-N6-metil-adenosina: es común en procariotas.
Ambos sirven como una marca epigenética. En procariotas se utiliza para marcar el DNA propio y
así poder degradar el intruso, y en eucariotas sirve para señalizar los genes que deben estar activos.

• Nucleósidos minoritarios en el ARN

-Inosina: aparece en el anticodón del ARNt, enriqueciendo al código genético.
- Se forma por desaminación de la adenosina
-Pseudouridina: aparece en ARNt y ARNr, siendo más común en procariotas.
- Estabiliza la estructura del ARNt
- Ayuda al plegamiento del ARNr.
- Se forma a partir de la uridina por isomerización enzimática tras la síntesis del tRNA

Otras funciones de los nucleótidos:

- Coenzimas
- Señalización celular
- Fuente de energía

3
POLINUCLÓTIDOS
- Los diferentes ucleótidos se unen entre ellos covalentemente por enlaces fosfodiester. Esto confiere carga
negativa al esqueleto de la cadena de polinucleótidos
- esqueleto del DNA, muy estable (la hidrolisis se acelera con Dnasas)
- Esqueleto del RNA, inestable
- In vitro y en disoculción acuosa, el RNA se degrada en pocos años
- In vivo, en las células, el mRNA se degrada en pocas horas
-Son polímeros lineales sin ramificaciones y tienen polaridad (la secuencia de nucleótidos siempre se lee en
dirección 5’ a 3’)
HIDRÓLISIS DEL RNA
- Inestable en condiciones alcalinas
- Se hidroliza también por RNasas, estas enzimas son muy comunes por lo que el RNA tiene un periodo de
vida muy corto en ambientes no protegidos.
- RNasas de interés:
- S-RNasa en plantas previene endogamia
- RNase P es una ribozima (enzima formada por RNA) que procesa los precursors de tRNA
- Dicer es una enzima que hidroliza RNA de doble cadena en oligonucleótidos
• Proporciona protección frente a genoma de virus
• Ha permitido el deasarrollo de la tecnología de RNA de interferencia
PUENTES DE HIDRÓGENO
- Dos pases pueden unirse mediante un puente de hidrógeno para formar un par de bases
- En forma monomérica las bases pueden formar muchos pares de bases distintos
- En los polinucleótidos solo hay unas pocas posibilidades
- Los pares de bases de Watson y Crick predominan en el DNA de doble cadena (AT-CG)

ESTRUCTURA DEL DNA

Watson y Crick
- Capas ausentes indican un patrón de distribución alterno (surco mayor y menor)
- Puentes de hidrogeno AT Y CG
- La doble hélice se ajusta a los datos experimentales
Franklin y Wilkins
- La X indica una hélice
- Los diamantes indican que el esqueleto de azucar-fosfato se encuentra en el exterior
- Calcularon parámetros de la hélice

CADENAS DEL DNA

- A las cadenas también se les llama hebras y tienen distintas secuencias, que se leen de 5’ a 3’
- Ambas cadenas son complementarias y antiparalelas

4
REPLICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO
- Separación de las hebras
- Cada una de ellas molde para una nueva síntesis (Las DNA polimerasas catalizan este proceso)
- Cada nueva molécula de DNA tiene una hebra hija y otra parental (semiconservativa)

RNA MENSAJERO
- Se sintetiza a partir de DNA, y solo tiene una hebra
- Ribosa en lugar de desoxiribosa
- Uracilo en lugar timina
- Monocistrónico: si solo puede codificar una proteínas
- Policistrónico: más de una
- Junto al tRNA transfiera la información del DNA a las proteínas

- Puede contener secciones palindrómicas, secuencias idénticas que se leen igual de izquierda a derecha y
viceversa. Se forman horquillas, y junto a la compleja estructura del RNA se estabillizan mediante
interacciones entre bases distintas.
DESNATURALIZACIÓN DEL DNA
- Los enlaces covalentes permanecen intactos
- La información genética no se altera
- S e rompen los puentes de hidrogeno (se separan las dos hebras)
- Se pierde el apilamiento de bases y aumenta la absorción en el UV
- La desnaturalización puede producirse por cambio de T o pH y puede ser reversible (apareamiento)

Desnaturalización térmica
- Al elevar la temperatura las dos hélices se separan, si la temperatura baja las cadenas se vuelven a aparear
- La desnaturalización térmica reversible es la base de la PCR
- La desnaturalización del DNA se puede seguir mediante espectofotometría a 260 nm

- Temperatura de fusión del DNA: cuando el 50% del DNA tiene sus hebras separadas
- La temperatura de fusión aumenta a mayor contenido de pares CG
- La temperatura de fusión también depende de la longitud del DNA (más larga más alto el punto)
- También depende del pH y fuerza iónica
- Alta concentración de sales aumenta Tm
- pH elevado disminuye Tm

5
 BIOLOGÍA MOLECULAR

TEMA 3. MATERIAL GENÉTICO: GENES Y CROMOSOMAS

GEN

- Un gen es una secuencia de nucleótidos en el DNA que codifica un producto (RNA o proteína)
- Durante la expresión de los genes el DNA se transcribe primero a RNA
- El RNA puede ser directamente funcional: tRNA y rRNA
- O un intermediario en la síntesis de proteínas: mRNA
- Un gen que codifica una proteína puede dar lugar a diferentes productos; isoformas

DNA

- El DNA tiene unas dimensiones mucho mayores que las células o virus que lo
contienen, es por esto que el DNA se organiza de una forma muy compacta mediante:
- Superenrrolamiento y asociación con proteínas (histonas)

Codificación de la información desde el DNA a las proteínas

- Transcripción:Una hebra del DNA de doble cadena actua como molde para crear una
cadena monocatenaria de mRNA (3 nucleótidos 1 codón)

- Traducción: Tripletes de mRNA se unes a sus complementarios en el tRNA

- El tRNA portan un aminoácido asociado al triplete concreto.
- Los aminoácidos se unen formando cadenas de polipéptidos.

La secuencia de aminoácidos en una proteína determina su función biológica

¿Cuantos genes tiene un organismo?

- E.Coli: 1 cromosoma circular, 4300 genes para proteínas, 157 genes para RNAs catalíticos o
estructurales (casi tod oel material genético de virus y bacterias contiene información)
- Homo sapiens: 24 cromosomas, 20.000 genes

MATERIAL GENÉTICO EN VIRUS

- Puede ser RNA o DNA.

- Puede ser doble cadena o simple.
- Circular o lineal.
- Puede cambiar de circular a lineal en el ciclo replicativo.
- La mayoría tienen el material genético envuelto en una envoltura proteica.
- Utilizan el genoma del huésped cuando infectan plantas, animales o bacterias.

GENOMA DE BACTERIAS
- DNA de doble cadena circular
- Contienen plásmidos (2000-10.000 pb)
- Resistencia a antibióticos
- Intercambio de plásmidos entre bacterias
GENOMA DE EUCARIOTAS

- El número varia con la especie

- Células somáticas humans 46 cromosomas
- 22 pares más X e Y
- Longitud de cada pareja de cromosomas distinta

1
MITOCONDRIAS Y CLOROPLASTOS

- DNA circular de doble cadena

- DNA mitocondrial humano (mtDNA)
- Codifica rRNAs y tRNAs mitocondriales y algunas proteínas mitocondriales (codificadad por
genes nucleares)
- mtDNA de plantas (200.000-2.500.000)
- DNA de cloroplastos, cpDNA (120.000-160.000)

DNA, cromosomas, genes y complejidad de los organismos

- Ni la longitud total del DNA, ni el número de cromosomas se correlacina con la complejidad del
organismos
- La correlación entre el tamaño del genoma y la complejidad es tan baja debido a que la mayoría del DNA
no es codificante (400 genes como mínimo)

TIPOS DE SECUENCIAS DE DNA EN EL GENOMA HUMANO

- Solo una pequeña fracción del DNA humano son genes que codifican proteínas (1.5%)
- Hay una gran cantidad de DNA sin función conocida
- DNA no genómico, secuencias repetidas:
- Rep de secuencia simple (3%). Menos de 10 pb, millones de veces por células
- Secuencias repetitivas largas (8%). Centrómeros y telómeros.
- Transposones: secuencias de centenares de miles de pb que pueden moverse de un lugar a otro del genoma.
- Mitad del genoma humano.
- El genoma eucariótico no es completamente estático
- Presentes en todas las formas de vida y algunos virus
- Repeticiones en sus extremos
- Las repeticiones hibridan con regiones complementarias del DNA diana durantela inserción.
- Secuencias únicas: genes que codifican proteínas, y otras secuencias (11’6%) codifican genes para RNA
funcionales.
- Intrones: forman parte de los genes que codifican proteínas pero que no se traducen.
- Transcritos maduros a partir de primarios
- Hasta 1993 solo intrones en eucariotas
- El 25% de los genomas d bacterias secuenciados presentan intrones
- No se encuentran en genes que codifican proteínas. Aparecen en genes para tRNAs
- En bacteriofagos interrumpen secuencias que codifican proteínas
- Muchos intrones de bacterias codifican RNAs catalíticos que les permiten hacer
transcripción inversa a DNA genómico
- Exones: secuencias de DNA que se expresan
- Secuencias simples: repeticiones en tandem, huella genética (paternidad y criminalística)

CENTRÓMEROS

- Se anclan proteínas durante la mitosis que fijan el cromosoma a los microtúbulos del huso mitótico
- Son esenciales para la distribución equitativa de los cromosomas a las células hijas
- Regiones ricas en pares A=T
- En eucariotas superiores contienen repeticiones de secuencia simple de función desconocida

2
TELÓMEROS

- Los extremos de una molécula lineal de DNA no puede replicarse de forma rutinaria
- Los telómeros se acortan tras cada replicación del DNA
- De esta forma el DNA entra en senescencia
- Las células humanas “normales” pueden dividirse una 52 veces antes de perder la capacidad de dividirse
(límite de Hayflick)

SUPERENRROLLAMIENTO DEL DNA

- El DNA se organiza para:

- Empaquetamiento de largas moléculas de DNA
- Acceso de las proteínas que deben leer la información
- Hay varios niveles de organización, uno es el superenrollamiento de la doble hélice del DNA

- Cadenas de doble hélice del DNA están enrolladas sobre sí mismas dando lugar a estructuras
superenrolladas
- También se llaman superhélices porque son hélices que a su vez están plegadas
formando otra hélice TELÉFONO
- Superenrollamiento se da en DNA de procariotas y de eucariotas

- El estado NO superenrollado se llama relajado

- La mayoría están superenrollados
- Muy regulado
- Cuando el eje de la doble hélice del DNA se enrolla sobre si mismo se forma
una superhélice (superenrollamiento)
- Gran impacto en la transcripción y replicación del DNA.
- Debido a que el DNA es una estructura en doble hélice, la separación de las hebras
provoca tensión adicional y superenrollamiento si el DNA está constreñido (sin
libertad de rotación) más allá de la separación de las hebras

LK (linking number)
- Número de veces que dos cadenas se cruzan entre si
- DNA circular relajado Lk = nº pb ÷ nº pb/vuelta
- Lk es un número entero. Cada molécula de DNA tiene un valor de Lk

- Los cambios en Lk son útiles para describir el superenrollamiento

+ La LK depende de la torsión y del retorcimiento

-La torsión (Twist,Tw) es el nº de vueltas de la hélice en el DNA
relajado. Tw es siempre positivo porque las vueltas de la hélice
son dextrógiras
- El retorcimiento (Writhe, Wr) es el nº vueltas del
superenrollamiento
- Puede tener valor – ó +:
– Valor – si superhélice se forma por giros a la izquierda
DESENRROLLAMIENTO
– Valor + si superhélice se forma por giros a la derecha
SOBREENRROLAMIENTO
– Generalmente tiene valor negativo

3
TOPOISOMERASAS

- Enzimas que modifican la Lk, lo aumentan o lo disminuyen

- Para cambiar Lk se deben romper enlaces fosfodiester
- Dos actividades:
- Endonucleosas, cortan las cadenas de nucleótidos
- Ligasa, para unir cadenas
- Se requieren para el desenrollamiento y posterior enrollamiento del DNA durante transcripción, replicación
y empaquetamiento del DNA

- Tipos:
- Tipo I: Realizan un corte transitorio en una hebras. Cambian el valor de Lk en incrementos de 1
- Tipo II: Cortan de forma transitoria ambas hebras y hacen variar Lk en incrementos de 2

DIANAS FARMACOLÓGICAS topoisomerasas

- La inhibición de las topoisomerasas provoca que las células no puedan replicar su DNA, expresar sus genes
o empaquetar su DNA. En consecuencia mueren
- Dos clases de inhibidores de topoisomerasas de bacterias actúan como antibióticos:
- Cumarinas, topoisomerasas de bacterias de tipo II al impeder la unión de ATP
- Quinolonas, Inhiben el ultimo paso (reparación de los cortes del DNA)

Las células cancerosas y otras células en rápido crecimiento expresan topoisomerasas

- Los inhibidores aumentan las lesiones en el DNA de estas células
- Inhibidores de topoisomerasas eucarióticas de Tipo I
- Inhibidores de topoisomerasas eucarióticas de Tipo II

ESTRUCTURA DE LOS CROMOSOMAS Y CROMATINA

- El término cromosoma se usa para designar las moléculas de ácido nucleico que actúan como depositario
de la información genética en virus, bacterias, células eucarióticas y orgánulos.
- Su estructura varia durante el ciclo celular.
- Eucariotas, en la células que no se dividen G0 o interfase G1, S Y G2 (El material cromosómico,
denominado cromatina es amorfo y aparentemente disperso al azar )
- En la profase de la mitosis:
- Los cromosomas se condensan y adquieren la forma definida de los de cromátidas hermanas características
de cada especie

DNA SE EMPAQUETAN CON PROTEÍNAS

- El genoma de los virus puede estar asociado con las proteínas de la cápsida
- El DNA de procariotas se asocia con proteínas en el nucleoide
- En eucariotas el DNA se organiza con proteínas para formar la cromatina

- El DNA se encuentra intimamente asociado con proteínas denominadas histonas (Son proteínas de tamaño
pequeño, con abundantes residuos básicos )
- Presentan abundantes modificaciones postraduccionales: metilación, acetilación, ADPribosilación,
fosforilación, glicosilación, sumoilación, ubiquitinación
- Estas modificaciones afectan la carga neta, la forma y las propiedades estructurales de la cromatina

4
Empaquetamiento del DNA en la cromatina

- Las histonas empaquetan y ordenan el DNA en unidades estructurales denominadas nucleosomas

- La cromatina también contiene muchas proteínas no histonas que ayudan a mantener la estructura del
cromosoma y otras regulan la expresión de genes específicos
- La descondensación parcial de la cromatina muestra una estructura denominada “collar de perlas”
- Cada nucleosoma consiste en ~146 pb de DNA enrollados alrededor de 8 histonas (el
núcleo=octámero de histonas); hay dos unidades de cada histona: H2A, H2B, H3, H4. – El
DNA envuelve al octámero formando una superhélice levógira de tipo solenoide con 1,67
vueltas
-El DNA de union entre los nucleosomas tiene ~54 pb y está unido a la histona H1
- Las colas amino terminales de las histonas se extienden hacia afuera y constituyen sitios para
la modificación covalente. Además, forman contactos importantes entre nucleosomas

- Las colas amino terminales de un nucleosoma se extienden fuera de la partícula e interaccionan con los
nucleosomas adyacentes contribuyendo a determinar el empaquetamiento de orden superior del DNA

- El enrollamiento del DNA alrededor del núcleo de histonas require la eliminación de una vuelta de la hélice
de DNA (superenrollamiento -)
- Puesto que la union no rompe el DNA, ni varia el número de enlace (Lk) debe formarse un
superenrollamiento + en el DNA no unido al octámero para compensar
- Las topoisomerasas eucarióticas relajan este superenrollamiento +
- El DNA queda finalmente con un superenrollamiento - y un descenso en Lk

La unión de las histonas al DNA depende de la secuencia de nucleótidos

• La unión no es aleatoria
• Es más frecuente en las regions ricas en pares A-T
• Segmentos de dos o más pares G-C tienen el efecto opuesto.
• El enrollamiento del DNA alrededor del octámero de histonas require la compresión del surco menor

Los nucleosomas se empaquetan en estructuras de orden superior altamente condensadas

• El enrollamiento del DNA alrededor de los nucleosomas hace que la longitud del DNA se compacte unas 7
veces
• Pero la compactación final del DNA es de unas 10.000 veces
• Esto demuestra la existencia de órdenes superiores de organización estructural
• El siguiente nivel structural es la fibra de 30 nm
• Los niveles superiores de plegamiento no se conocen todavía con exactitud

5
 BIOLOGÍA MOLECULAR

TEMA 4. METABOLISMO DEL DNA

- DNA es el dispositivo para el almacenamiento estable de la información genética

- La síntesis, con alta fidelidad, de una nueva copia de DNA antes de cada división celular
- La revisión y reparación de los errores producidos durante o después de la síntesis del
DNA
- La reordenación de la información genética mediante procesos de recombinación que permiten
transmitir nueva información a la descendencia

Convención clave para nombrar a los genes de bacterias

- Los genes en bacterias se nombran con tres letras en minuscula y en cursiva (suele hacer referencia asu
función). Las proteinas no van en cursiva y la primera letra es en mayuscula.
- En eucariotas no se siguen ninguna norma

REGLAS DE LA REPLICACIÓN:

- Síntesis del DNA de todos los organismos

- Replicación semiconservativa
- cadena hija con cadena molde
- Un origen (procariotas) varios (eucariotas)
- Bidireccional
- Sísntesis 5’ a 3’ semidiscontínua
- Adición de nuevos nucleótidos al extremo 3’
- La hebra conductora se sintetiza de forma contínua en la dirección seguida por la horquilla
- La hebra rezagada se sintetiza de forma discontínua (f de okazaki) en dirección opuesta
- DNA-ligasa une los fragmentos

DNA DEGRADADO POR NUCLEASAS

- DNasas son específicas de DNA

- RNasas son específicas de RNA

-Dos grandes grupos de nucleasas:

– Exonucleasas degradan los ácidos nucleicos desde un extremo. Pueden actuar en dirección 5’ 3’ ó 3’ 5’
– Endonucleasas degradan en puntos internos de una molécula, reduciéndola a fragmentos cada vez más
pequeños

DNA sintetizado por DNA-polimerasas

Mecanismo de elongación de una cadena de DNA

- Cadena de DNA como molde

- Se utilizan nucleótidos trifosfato
- El OH situado en el extremo 3’ de la cadena, produce un ataque nucleofílico al fosfato α del nucleótido (el
carácter nucleofílico aumenta en el OH por la presencia de Mg+)
- Como producto de la reacción se libera pirofosfato (formado por los fosfatos β y γ del nucleótido )
- Se hidroliza para dar dos moléculas de fosfato inorgánico
- La incorporación de cada nucleótido requiere la hidrólisis de dos enlaces fosfato de alta energía

CEBADOR

- Cadena de ácido nucleico corta y complementaria al DNA molde

- Suele ser de ARN
- Primera reacción catalizada por la DNA polimerasa, hidroxio libre en extremo 3’

1
DNA POLIMERASA

- Centro activo con 2 regiones:

- Sitio de inserción, se une el nucleótido entrante para formar e enlace
fosfodiester
- Sitio de postinserción: donde se coloca el par de bases recién
formado al desplazarse la polimerasa en el DNA molde en dirección
3’5’
- El centro activo de la DNA polimerasa excluye a los pares de bases
con geometría incorrecta

Las DNA polimerasas pueden añadir nucleótidos o disociarse del DNA molde

- La procesividad es el número de nucleótidos añadidos antes de la disociación (varia desde unos pocos
nucleótidos a muchos miles )
- Cada polimerasa posee un valor de procesividad y de velocidad de polimerización

Los errores durante la replicación se corrigen por la actividad exonucleasa 3’ 5’ de la DNA polimerasa I -
A esto se le llama corrección de pruebas

E. Coli, 5 tipos de DNA polimerasas

- La DNA polimerasa I es abundante pero no es adecuada para la replicación (procesividad y velocidad

bajas)
- La DNA polimerasa III es la enzima principal de la replicación
- Las DNA polimerasas II, IV, y V están implicadas en la reparación del DNA

La DNA polimerasa I también posee actividad exonucleasa 5’ 3’ (diferente de la actividad exonucleasa
3’5’)
• Las restantes polimerasas carecen de la actividad exonucleasa 5’ 3’
- Es capaz de reemplazar un segmento de DNA apareado a la hebra molde, en un proceso denominado
translación de la mella
- La actividad exonucleasa 3’5’ (corrección de pruebas) junto a la actividad polimerasa reside en el
fragmento de Klenow

TRANSLACIÓN DE LA MELLA

- Proceso de sustitución de un fragmento de cadena por otro

- Solo lo realiza DNAP I
- Desplazamiento de mella porque desplaza posición del Nick
- Dos actividades del DNAP I
o Exonucleasa 5’ → 3’. Elimina cadena, extremo 5’-P del Nick
o polimerasa 5’ → 3’. Reconstruye cadena, extremo 3’-OH

DNA POLIMERASA III

- Enzima principal replicación E.Coli

- 10 tipos de subunidades que forman 3 conjuntos
o Polimerasa núcleo: actividad de polimerización y corrección de pruebas. Puede polimerizar
pero su procesividad es limitada
o Dos subunidades se unen al complejo de carga de la abrazadera
o Abrazadera deslizante β, aumenta procesividad del complejo. Impide que la DNA
polimerasa III se disocie del DNA.

La replicación del DNA requiere muchos enzimas y factores proteicos

Muchas enzimas y proteínas diferentes

A esto se le llama replisoma, e incluye:
2
 - Helicasas: usan energía ATP para separar las cadenas
- Topoisomerasas: Liberan tensión causada por la separación
- Proteínas de unión al DNA: estabilizan la separación de las cadenas
- Primasas: sintetizan los cebadores de RNA
- DNA ligasa: sellan los fragmentos de Okazaki

ETAPAS DE REPLICACIÓN E.COLI

INICIACIÓN
- En bacterias hay un único origen de replicación oriC
- Secuencias de DNA muy conservadas:
o Cinco repeticiones de 9 pb (sitios R) que actúa de sitio de unión para la proteína de
iniciación DnaA
o Región rica en pares A = T denominada elemento de desenrollamiento del DNA (DNA
unwinding element (DUE))
o Tres tipos de sitios de adicionales para la unión de las proteínas:
 DnaA (sitios I. Hay 3)
 IHF (factor de integración del huesped)
 FIS (factor de estimulación de la inversión)

Ocurre una vez por ciclo

Ocurre cada 20-40 min
Se requieren al menos 10 proteínas diferentes
El objetivo es separar las dos cadenas de DNA para formar el complejo precebador

ELONGACIÓN
- Cadena conductora
o Síntesis continua
o La primasa dnaG sintetiza el cebador
o Esta interacciona con la helicasa dnaB pero se desplazan en dirección opuesta
o La DNA pol III añade ucleótidos al extremo 3’ de la cadena
o La pol III está únida a la dnaB, que está asociada a la cadena opuesta

- Cadena rezagada
o Sintesisi del cebador y pol III añade nucleótidos
o Un dímero asimétrico de DNA pol III sintetiza ambas cadenas simultáneamente
o El crecimiento de la cadena rezagada transcurre en sentido opuesto al crecimiento de la
horquilla
 Síntesis de Fragmentos de Okazaki
 La holoenzima de la pol III se disocia en la abrazadera β
o Se disocia y se vuelve a unir al DNA
o El cargador de la abrazadera con una nueva abrazadera β dimérica
une 3 moléculas de ATP
o La unión fuerza la apertura de la abrazadera β en la interfase entre
sus subunidades
o La hebra rezagada con el nuevo cebador se desliza al interior del
anillo a través de la apertura
o La hidrólisis del ATP permite de nuevo el cierre de la abrazadera β
alrededor del DNA
 Pol I elimina cebador
 Pol I rellena hueco
 Ligasa sella mella
o Enlace fosfodiéster entre extremo 3’-OH libre y el fosfato 5’ de la
cadena sintetizada
o Hidrolisis molécula de ATP

3
TERMINACIÓN

Ambas horquillas de replicación llegan a una región con una determinada secuencia llamada TER
- TER, cerca uno del otro pero en direcciones opuestas
- Atrapa a la horquilla y no la deja salir
- También es el sitio de unión de la proteína Tus

ETAPAS DE REPLICACIÓN EUCARIOTAS

- Similar pero más compleja

- Múltiples orígenes de replicación
- Genoma completo replicado por ciclo celular
- Reglado por proteínas ciclinas y quinasas
- Ciclinas marcadas con ubiquitina para destruirse al final de la fase M

INICIACIÓN

Requiere la formación de un complejo prerreplicativo en los sitios de iniciación de la replicación

El acontecimiento clave del inicio es la carga de la helicasa
El complejo de reconocimiento del origen de replicación, incorpora una helicasa al DNA
ORC actúa como la DnaA de bacterias
La helicasa es un hexámero denominado proteínas de mantenimiento de minicromosomas (MCM2-7 actúan
como la helicasa DnaB de bacterias)

Replicación más lenta que en bacterias pero compensado por múltiples orígenes de replicación

ELONGACIÓN

- DNA pol α (actividades polimerasa y primasa)

o Carece de actividad correctora 3’5’. Sintetiza los cebadores y los extiende por ~10
nucleótidos
- DNA Pol δ (cadena retardada) y DNA Pol ε (cadena conductora). (asociada con PCNA
o Las dos con alta procesividad
o Las dos con actividad correctora 3’5’

TERINACIÓN
- La síntesis termina en unas estructuras especializadas denominadas telómeros que se encuentran en
los extremos de los cromosomas lineales

Las DNA polimerasas víricas son dianas farmacológicas

- Muchos virus de DNA codifican sus propias DNA polimerasas

Mutaciones y reparación del DNA

- La mayoría de las células solo tienen una o dos copias de DNA genómico que son irremplazables
- El DNA dañado por procesos expontáneos o agentes ambientales
o La mayoría se corrigen utilizando la cadena no dañada como molde
o Algunos cambios en la secuencia de bases escapan a la reparación y sirven como molde para
la replicación
o Las nuevas cadenas sintetizadas contienen el cambio en la secuencia de bases en ambas
cadenas
o La acumulación de mutaciones en las células eucarióticas se correlaciona con el cáncer.
o Se producen miles de lesiones/ pero solo 1/1.000 constituyen una mutación gracias a la
reparación del DNA
o El genoma humano contiene más de 130 genes que codifican proteínas implicadas en la
reparación del DNA

- Principales tipos de daños:

4
 o Apareamientos incorrectos, incorporación de nucleótidos incorrectos. Se reparan con la
información de la cadena complementaria
o Bases no habituales. Se forman por desaminación espontánea, alquilación química de bases
o exposición a radicales libres
o Dímeros de pirimidina. Se forman cuando el DNA se expone a luz UV
o Roturas de cadena. Se producen por exposición a radiación ionizante o radicales libres.
Muerte celular

¿Cómo sabe la maquinaria de reparación cual es la cadena correcta?

- Cadena parental metilada, después de un tiempo se metila la hija

- Si hay un error: (apareamientos incorrectos)
o Degradación por exonucleasa I
o La DNA polimerasa III vuelve a sintetizar el fragmento que portaba el error
o La DNA ligasa sella la mella
- Reparación por escisión de base:
o Enzimas específicos, DNA glucosilasas
o Eliminan el enlace N-glucosídico entre pentosa y base
o DNA pol I endo y exo
- Reparación directa:
o Las fotoliasas utilizan la energía de la luz para reparar dímeros de pirimidina

Recombinación del DNA

- En los organismos con reroducción sexual, la recombinación y las mutaciones son dos mecanismos
que dirigen la evolución
- Recombinación de genomas virales que coinfectan a una misma célula puede aumentar la virulencia
y provocar resistencia a antivirales
- Tipos de recombinación:
o Recombinación homóloga (general). Intercambio entre dos DNAs que comparten una región
extensa de secuencia casi idéntica
o Recombinación específica de un sitio determinado. Intercambia solo una secuencia
particular
o Transposición del DNA. Secuencias cortas de DNAs que pueden moverse de un cromosoma
a otro

5
 BIOLOGÍA MOLECULAR

TEMA 5. METABOLISMO DEL RNA EN PROCARIOTAS

FUNCIONES DEL RNA

- mRNA: codifica secuencias de aminoácidos de todas las proteínas de las células

- tRNA: se carga con un aminoácido específico para la síntesis de proteínas y empareja su
anticodón con el mRNA
- rRNA: Son components estructurales de los ribosomas

Otras funciones relevantes

- MicroRNAs: regulan la expresión génica mediante la unión a secuencias de nucleótidos

específicas
- Ribozimas: RNA con función catalítica
- Material genético de algunos virus

TRANSCRIPCIÓN EN E.COLI

- Adición de ribonucleótidos 5’-trifosfato al extremo 3’

- La hebra de RNA que se sintetiza es complementaria a una hebra de DNA (molde)
- La RNA polimerasa cataliza la síntesis y emplea 2 iones Mg+

Características:

- Para comenzar la transcripción, la RNA pol se une al

promotor
- La doble cadena de DNA se desenrolla temporalmente
formando la burbuja de transcripción
- De izquierda a derecha, de desenrolla por delante se enrolla
por detrás
- La RNA pol genera superenrollamientos positivos por
delante que posteriormente se liberan por topoisomerasas y
vueltas superhelicoidales negativas (DNA subenrollado) por detrás

HEBRA MOLDE (SIN SENTIDO) Y HEBRA CODIFICANTE (CON SENTIDO)

- La RNA pol sintetiza el RNA en dirección 5'→3', de modo que la hebra de DNA que actúa
como molde está orientada en sentido 3'→5', por lo que también se la conoce como hebra
sin sentido, hebra no codificante o hebra (-)
- La hebra de DNA complementaria a la que actúa como molde presenta la misma secuencia
que el transcrito de RNA (aunque contiene T en lugar de U) y se la conoce como hebra con
sentido, hebra codificante o hebra (+)
- Cuando se va a depositar la secuencia de un gen en una base de datos, se envía siempre la
secuencia de la hebra codificante

- La hebra superior suele ser la codificante

- Puede ser que cada hebra codifique un gen distinto (adenovirus)

RNA POLIMERASA EN PROCARIOTAS

1
 - Seis subunidades la constituyen (5+1)
- Ese +1 hace referencia a la subunidad σ se une transitoriamente al núcleo y dirige a la
enzima a sitios de unión específicos en el DNA
- Carece de actividad exonucleasa 3’  5 por lo que tiene una alta tasa de error
- La RNA pol se une a los promotores

PARTES:
- Las dos subunidades α participan en el ensamblaje y unión a los
elementos UP
- La subunidad β es la principal subunidad catalítica
- La subunidad β’ es responsable de la unión al DNA
- La subunidad σ dirige a la enzima al promotor (cada clase de
holoenzima tiene una subunidad σ diferente)
- La subunidad ω protege a la polimerasa de la desnaturalización

PROMOTORES EN E.COLI

- La region del promotor se extiende de -70 a +30

o Por convención, los pb que preceden al sitio de inicio de la transcripción reciben
números negativos. Se les denomina (aguas arriba).
o Los pb que corresponden a partir del inicio, son positivos y se les denomina (aguas
abajo)
- Hay dos secuencias consenso centradas en −10 (TATAAT) y −35 (TTGACA) para la
interacción de la subunidad σ
o Se denominan secuencias TATA
- Un tercer elemento de reconocimiento, rico en A-T, denominado elemento UP (corriente
arriba del promotor.
o La subunidad α se une al elemento UP
o Estas secuencias regulan la eficacia de unión de la RNA pol al promotor y, por tanto,
afectan al nivel de expresión génica

INICIACIÓN

- La RNA pol, dirigida por el factor σ unido, se asocia al promotor y forma un complejo
cerrado
- Se forma un complejo abierto en el que el DNA está parcialmente desenrrolladO
- La RNA pol se aleja aguas arriba del promotor (desalojo del promotor)
o La subunidad σ se reemplaza por la proteína NusA

ELONGACIÓN

- La RNA pol une nucleósidos trifosfato y genera el transcrito de RNA

- La proteína NusG se une directamente a la RNA pol y al ribosoma, vinculando ambos
complejos.
o El nivel de traducción afecta directamente al nivel de transcripción

TERMINACIÓN
2
 - La terminación de la transcripción está señalizada por secuencias específicas
- Una vez finalizada la transcripción se libera el RNA, se disocia la proteína NusA y la RNA
pol se disocia del DNA. La RNA pol queda lista para unir otra subunidad σ y comenzar de
nuevo

SEÑALES DE TERMINACIÓN

Pueden ser:

- Independiente de ρ
o Estos terminadores tienen dos características distintivas:
 Región con secuencias autocomplementarias en el RNA que permiten la
formación de una estructura en horquilla centrada 15- 20 nucleótidos antes
del final del RNA
 Secuencia de 3 residuos de A que se transcriben a U cerca del extremo 3’ de
la horqulla
o La RNA pol se detiene en el terminador. La horquilla desestabiliza el híbrido
DNARNA. El híbrido A=U es relativamente inestable y el RNA se disocia

- Dependiente de ρ
o La cadena molde contiene una secuencia rica en CA llamada elemento rut
o La proteína ρ es una helicasa que se une al elemento rut
o La proteína ρ migra en dirección 5’→3’ hasta encontrar el complejo de transcripción
detenido en el terminador

3
Miranda Moreno

TEMA 6 Metabolismo del RNA en eucariotas y virus de RNA

• RNA polimerasas de eucariotas

• Promotores de la RNA polimerasa II
• Maquinaria general de transcripción
• Maduración del RNA
• Síntesis de DNA y RNA dependiente de RNA
• Telómeros

1. Las células eucarióticas tienen tres tipos de RNA polimerasas nucleares

• RNA polimerasa I. Sintetiza RNA prerribosómico (precursor de los rRNAs 28S, 18S y 5,8S)
• RNA polimerasa II. Responsable de la síntesis del mRNA
-Muy rápida (500–1.000 nucleótidos/s)
-Inhibida de forma específica por la toxina α-amanitina de ciertos hongos
-Puede reconocer miles de promotores
• RNA polimerasa III. Sintetiza tRNAs, rRNA 5S y algunos RNA especializados de pequeño tamaño
• Las plantas poseen una RNA polimerasa IV responsable de la síntesis de pequeños RNAs de interferencia
• Las mitocondrias poseen su propia RNA polimerasa

2. Promotores reconocidos por la RNA polimerasa II

• La RNA pol II reconoce miles de promotores, cuyas secuencias pueden diferir ampliamente.
• Secuencias consenso:
- Secuencia TATA. Formada por TATA(A/T)A(A/T)(A/G) y próxima a la posición −30
-Secuencia Inr (Iniciador). Próxima a la posición +1
• Secuencias reguladoras que pueden localizarse alejadas aguas arriba del sitio de unión de la RNA polimerasa II

2.1 La RNA polimerasa II es mucho más compleja que la RNA polimerasa de bacterias
• A pesar de la mayor complejidad, hay una notable conservación de estructura, función y mecanismo
• La enzima de levaduras contiene 12 subunidades
• Algunas subunidades comparten homología con las de la RNA polimerasa de bacterias:
-Subunidad mayor (RBP1) es homóloga a β’
- RBP2 es homóloga a la subunidad β
- RBP3 y RBP11 muestran cierta homología a las subunidades α
• La subunidad RBP1 posee una cola C-terminal consistente en una secuencia consenso de siete aminoácidos.

2.2 La RNA polimerasa II requiere muchos factores proteicos para su actividad

• La maquinaria general de transcripción es un complejo multiproteico formado por la RNA pol II y una serie de
proteínas denominadas factores de transcripción generales (TFII)
• Los TFII se requieren en todos los promotores de la RNA pol II y están muy conservados
• La formación del complejo depende de numerosos contactos proteína-proteína
• La transcripción por la RNA pol II comprende 4 fases:
-Ensamblaje
-Inicio
-Elongación
- Terminación
Miranda Moreno

2.3 Ensamblaje de la RNA polimerasa II y los TFII en el promotor e inicio de la transcripción

• Se inicia con la unión de la proteína de unión a TATA (TBP)
-TBP forma parte del complejo TFIID
-A continuación, se incorporan TFIIB, TFIIA, TFIIF, TFIIE y TFIIH (complejo de preinicio, cerrado)
• La actividad helicasa de TFIIH desenrolla el DNA en el promotor (complejo de inicio, abierto)
• La actividad quinasa de TFIIH fosforila a la RNA pol II en CTD, lo que produce un cambio conformacional que permite
a la RNA pol II la síntesis de mRNA (complejo de elongación)

2.4 Elongación y terminación

• Tras 60-70 nt, se libera TFIIE seguido de TFIIH
• TFIIF permanece asociado a RNA pol II durante toda la elongación
• Los factores de elongación optimizan el proceso de elongación y coordinan las modificaciones postraduccionales
• Algunos factores de elongación se unen al CTD fosforilado
• Para la terminación, se desfosforila la RNA pol II.

3. TFIIH y reparación
• TFIIH no solo participa en la formación de los complejos cerrado y abierto
• La reparación de los genes que están siendo transcritos de forma activa es más eficiente que la del DNA inactivo
transcripcionalmente
• TFIIH también participa en el complejo de reparación por escisión del nucleótido (NER)
-Incorpora al complejo NER en las lesiones
• Algunas enfermedades genéticas asociadas a fallos en la reparación están relacionadas con defectos en TFIIH:

4. Inhibición específica de RNA polimerasas

• Actinomicina D y acridina
- Se intercalan en el DNA e impiden la transcripción
• Rifampicina
-Se une a la subunidad beta de la RNA pol de bacterias

5. Maduración del RNA

• La mayoría del RNA de bacterias y la totalidad del RNA de eucariotas es modificado después de su síntesis.
• Una molécula de RNA recién sintetizada se denomina transcrito primario.
• Las modificaciones más importantes se producen en los mRNA de eucariotas y tRNAs de eucariotas y bacterias.
• La maduración de los mRNA eucarióticos incluye:
-Corte y empalme del RNA
-Adición de un casquete en 5’
-Adición de una cola de poli(A) en el extremo 3’
-Degradación
6. Intrones y exones
• Los genes que codifican proteínas pueden estar interrumpidos por secuencias no codificantes denominadas intrones
• Ocurre en casi todos los genes de vertebrados (excepción: genes de histonas), en algunos de levaduras y en muy
pocos genes de bacterias.
• Los segmentos codificantes del gen son los exones.
• Los intrones tiene una longitud de 50−700.000 pb
Miranda Moreno

-1.800 pb (longitud media)

• Algunos genes poseen docenas de intrones
-El genoma humano tiene más de 200.000 intrones distribuidos en ~20.000 genes

6.1Hay cuatro tipos de intrones

• Intrones del grupo I y del grupo II. Son de autocorte y empalme (self- splicing)
-No son necesarios enzimas proteicos ni ATP
-Se encuentran en algunos genes nucleares, mitocondriales y de cloroplastos y Presentes en algunas bacterias
• Intrones de espliceosoma. Se procesan en un gran complejo proteico denominado espliceosoma
-Son los más comunes
-Muy frecuentes en genes codificantes de proteínas de eucariotas
• Intrones de tRNA. Requieren enzimas proteicos para su procesamiento
- Una endonucleasa corta al transcrito primario
-Los exones se empalman por una ligasa dependiente de ATP.

6.2. Mecanismo de corte y empalme de intrones del grupo I

• El 3’-OH de un nucleótido de guanosina (GMP, GDP, GTP) actúa como nucleófilo
• Ataca el enlace fosfodiester entre U y A al final del exón
• Libera el extremo 3’-OH del exón (acabado en U)
• El extremo 3’-OH del exón escindido actúa como nucleófilo en el extremo 3’ del intrón. El resultado es la escisión
completa del intrón y la ligación de los intrones

6.3 Mecanismo en intrones de grupo II

-El mecanismo es similar a los del grupo I excepto:
• La identidad del nucleófilo del primer paso. Es el OH en posición 2’ de un residuo A del intrón
• Se forma un intermedio tipo lazo en el que una rama es un enlace fosfodiester 2’, 5’
6.4 Mecanismo de corte y empalme en intrones de espliceosoma
• Experimentan el mismo mecanismo de formación de lazo de los intrones de tipo II
• El espliceosoma está formado por complejos RNA-proteína denominados snRNPs
- Cada snRNP contiene unas 10 proteínas y un RNA denominado snRNA
-Hay 5 snRNAs descritos en eucariotas (U1, U2, U4, U5, U6)
• Los sitios de corte se señalan con GU en el extremo 5’ y AG en el extremo 3’

6.5 Interacciones de apareamiento de RNA en la formación de los complejos del espliceosoma

• U1 y U2 snRNAs contienen regiones complementarias al mRNA.
• U1 determina la posición 5’ del corte y empalme.
• U2 se une cerca del extremo 3’ del intrón.
• El apareamiento produce una protuberancia que desplaza y ayuda a activar a una A para actuar como nucleófilo.
• Esta A forma el enlace fosfodiéster 2’-5’ del intermedio tipo lazo.

6.6 Ensamblado del espliceosoma

• A continuación se unen U2, U4, U5 y U6 y al menos 50 proteínas para crear el espliceosoma
• Se requiere ATP para el ensamblado, pero no para el corte
• Parte del espliceosoma se une al CTD de la RNA Pol II.
Miranda Moreno

-Indica coordinación del corte empalme con la transcripción.

7. Adición de la cola de poli(A)
• Sirve de sitio de unión para proteínas específicas.
• Protege al mRNA de la destrucción enzimática.
• Etapas de la síntesis de la cola de poli(A):
- RNA pol II sintetiza RNA más allá del sitio de poli(A)
-A la secuencia señal para el corte se une un complejo enzimático que contiene una endonucleasa y una poliadenilato
polimerasa.
-La endonucleasa corta el mRNA en un punto que se encuentra en el lado 3’ (aguas abajo) de la secuencia de corte
(5’).
-La poliadenilato polimerasa sintetiza una cola de poli(A) de 80−250 nts empezando en el sitio de corte.

¿Guarda relación la complejidad aparente de los organismos con el número de genes que codifican proteínas?

7.1 Corte y empalme alternativo

• La maduración diferencial del mRNA puede dar lugar a múltiples productos a partir de un gen
• Determinadas regiones pueden eliminarse o permanecer lo que produce diferentes mRNA maduros a partir del
mismo transcrito primario
• El mecanismo de corte y empalme alternativo ocurre en más del 95% de los genes humanos.

7.2 Elección del sitio de adición poli(A)

• Algunos transcritos poseen más de un sitio de adición de poli(A)
• Genera mayor diversidad
• Ejemplo: dominios variables de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas

8. Procesamiento de los tRNAs y rRNAs

• Los rRNAs y tRNAs, tanto de células eucarióticas como arqueas y bacterias, sufren procesamiento.
• Algunas de las bases se modifican en reacciones posteriores a la transcripción: pseudouridina, tiouridina y
dihidrouridina.
*Poseen bases no habituales los mrna mensajeros
• Los rRNAs y tRNAs maduros se forman por procesamiento de precursores de mayor tamaño.

9. Los microRNAs son una clase especial de RNAs que intervienen en la regulación génica
MicroRNAs (miRNAs):
• Son RNAs cortos y no codificantes.
• Se encuentran en plantas y animales
• Se unen a regiones específicas del mRNA para alterar la traducción.
-Ayudan a cortar los mRNAs O a bloquear la traducción del mRNA
• En humanos hay unos 1.500 genes que codifican miRNAs y afectan a la expresión de la mayoría de los genes que
codifican proteínas
• Se sintetizan a partir de precursores de mayor tamaño

9.1. Síntesis y maduración de los miRNAs

• El transcrito primario de los miRNA se sintetiza en el núcleo y es de mayor tamaño que el miRNA maduro
• La endorribonucleasa Drosha y la proteína DGCR8 reduce el pre-miRNA.
Miranda Moreno

• Exportina y Ran (GTPasa) exportan este precursor al citoplasma

• La endorribonucleasa Dicer procesa el pre-miRNA hasta dsRNA.
• Una RNA helicasa elimina el RNA complementario
• El miRNA maduro se incorpora a un complejo proteico denominado Complejo de silenciamiento inducido por RNA
(RISC)
• RISC se une al mRNA diana

9.2. El complejo RISC-miRNA suprime la traducción del mRNA

• El miRNA de RISC se une a una secuencia diana complementaria en el mRNA
• Si la complementariedad es casi perfecta, el mRNA diana se degrada (no se traduce)
• Si la complementariedad es parcial, se bloquea la traducción

10. Ribozimas
• El estudio de la maduración de los RNA ha producido el descubrimiento de enzimas de RNA denominados ribozimas.
• El sustrato suele ser una molécula de RNA que puede ser parte del mismo ribozima.
• Se inactivan por desnaturalización.
• Siguen la cinética de Michaelis-Menten:
-Especificidad por el sustrato, Saturable, Sitio activo, KM, Inhibición competitiva, Mecanismo catalítico basado en dos
reacciones: la transesterificación y la hidrólisis del enlace fosfodiéster.

10.1 Ejemplos de ribozimas

• Intrones del grupo I
• Ribozima en cabeza de martillo
-Digiere el RNA de virusoides
• RNasa P

11. Degradación de los mRNAs celulares

• La durabilidad de los mRNAs es uno de los mecanismos de regulación de la expresión génica.
-Cada producto génico se necesita por un tiempo determinado.
• La vida media varía desde segundos hasta horas.
-Velocidad síntesis: velocidad degradación.
-Estado estacionario (síntesis y degradación tienen mismas velocidades)
-Promedio de vida media del mRNA de vertebrados ~3 hrs
-Recambio de cada mRNA de ~10 veces por generación.
- En bacterias la vida media es mucho más corta (~1,5 mins)
• La degradación ocurre por medio de ribonucleasas.
• Una estructura en horquilla presente en los mRNAs de bacterias con un terminador independiente de rho puede
extender la vida media.
• El casquete en el extremo 5’ y la cola de poli(A) en el extremo 3’ aumenta la estabilidad de los mRNAs de eucariotas.

12. La transcripción inversa y la replicación del RNA suponen una ampliación del Dogma Central
• En eucariotas y procariotas el DNA y el RNA se sintetizan a partir de un molde de DNA
• Los virus de RNA incumplen esta norma
• Los retrovirus tienen genomas de ssRNA y la enzima transcriptasa inversa
Miranda Moreno

- El virus entra en la célula huésped.

-La transcriptasa inversa sintetiza DNA a partir del RNA.
-Degrada el RNA del híbrido DNA-RNA y lo reemplaza por DNA
- El DNA se incorpora en el DNA de la célula huésped.

12.1. La transcriptasa inversa cataliza tres reacciones

1. Síntesis de DNA dependiente de RNA
2. Degradación del RNA
3. Síntesis de DNA dependiente de DNA
• Contiene Zn2+, como DNA pol
• Usa un cebador de tRNA
• Carece de actividad correctora 3’ -> 5’, como RNA pol.
-Determina que la transcriptasa inversa sea propensa a cometer errores.
-Explica la alta tasa de mutación/evolución de estos virus.

12.2. Algunos RNA se replican mediante una RNA polimerasa dependiente de RNA
• Sucede en virus de RNA que no tienen fase de DNA
• Todos los virus de RNA, a excepción de los retrovirus, tienen que codificar una proteína con actividad RNA polimerasa
dependiente de RNA (RNA replicasa)
• Las células huésped no poseen esta enzima.

13. Telómeros
• Los extremos de un cromosoma lineal no pueden ser replicados por las DNA polimerasas celulares
• Los telómeros son estructuras especializadas que se encuentran en los extremos de los cromosomas eucarióticos
• Consisten en muchas copias en tándem de una secuencia corta.
• La longitud puede ser de hasta decenas de kb en mamíferos

13.1. La telomerasa extiende los extremos de los cromosomas eucarióticos

• Los telómeros no pueden replicarse con las DNA polimerasas
-Más allá del extremo no hay DNA molde para la síntesis de un cebador
-Los cromosomas se acortan con cada generación
• La telomerasa resuelve este problema añadiendo secuencias teloméricas

13.2 El mecanismo de la actividad telomerasa

• La telomerasa es una transcriptasa inversa especializada
• La telomerasa contiene un RNA con una secuencia repetida CyAx que sirve para extender la cadena TxGy del
telómero
• La telomerasa se une al extremo 3’ del cromosoma y se aparea con el cebador TxGy del DNA
• La telomerasa extiende el extremo 3’ usando el RNA de la enzima como molde. A continuación, reposiciona el molde
interno de RNA para permitir la adición de más residuos de T y G en el telómero
• La hebra complementaria se sintetiza por DNA polimerasas celulares después de cebado por una RNA primasa
 BIOLOGÍA MOLECULAR

TEMA 7. METABOLISMO DE PROTEÍNAS I

INTRODUCCIÓN A LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

- La información presente en el mRNA para la síntesis de proteínas reside en 4 nucleótidos

distintos
- Las proteínas se forman a partir de 20 aa
- Traducción
- Es el proceso de biosíntesis más complejo que realiza la célula
o Consume entre 80 y 90% de energía que se gasta en biosíntesis
o Muy regulado
o Velocidad en bacterias es ∼20 aminoácidos/s – Velocidad en eucariotas es 2 a 4
aminoácidos/s
- Puede ser muy rápida cuando tiene lugar en un cúmulo de ribosomas llamado polisoma
(polirribosoma)
- En bacterias la traducción puede empezar antes de concluir la transcripción
- Las proteínas se sintetizan en los ribosomas

- Los aa se activan para la síntesis de proteínas mediante unión a un tRNA en una reacción
catalizada por enzimas denominadas aminoaciltRNA sintetasas
- Los tRNA llevan los aminoácidos hasta el ribosoma. Actúan como “puentes” que emparejan
un codón en el mRNA con el aminoácido que codifica

El código genético consiste en tripletes de nucleótidos

- Un código de 4 letras del DNA (A, T, C y G)

en grupos de 2, permitiendo repeticiones y
distinto orden de colocación, es insuficiente
(42=16 combinaciones distintas)
- Un código de 4 letras en grupos de 3 ,
permitiendo repeticiones y distinto orden de
colocación, es suficiente (43=64
combinaciones distintas)
- Los seres vivos utilizan un código de mRNA
no solapado y sin puntuación

CARACTERÍSTICAS

- El código se escribe en la dirección 5’ → 3’

- La tercera base es menos importante en la union al tRNA
- El primer codón determina el marco de lectura
o Todos los mRNA tienen tres pautas (marcos) de lectura potenciales
o El DNA tiene seis pautas de lectura potenciales (2 cadenas x 3)
- Si se altera el marco de lectura por una o dos bases, todos los codones posteriores serán
incorrectos
- 61/64 codones codifican aminoácidos
o Hay tres codones de terminación: UAA, UGA, UAG
o AUG = codón de inicio (también codifica Met)

1
La mayoría de los aminoácidos tienen más de un codón

- Hay 61 codones para 20 aminoácidos

- El código es degenerado
o Un aminoácido determinado puede ser especificado por más de un codón
- Solo Met y Trp tienen un único codón

El código genético es casi universal

- Los codones de los aminoácidos son idénticos en todas las especies examinadas hasta ahora
- Solo hay pequeñas variaciones en mitocondrias, algunas bacterias y algunos eucariotas
unicelulares
o En mtDNA de vertebrados :
 UGA codifica Trp (en lugar de STOP)
 AGA/AGG codifica STOP (en lugar de Arg)
o Mitocondrias codifican sus propios tRNAs y usan 22 en lugar de 32

RELACIÓN DE APAREAMIENTO CODÓN-ANTICODÓN

- Las secuencias del codón y anticodón son complementarias

- El codón del mRNA se une al anticodón del tRNA mediante
puentes de H entre bases
- El alineamiento de los dos RNAs es antiparalelo

El balanceo permite que algunos tRNA reconozcan más de un codón

- La tercera base de un codón puede aparearse de forma no

convencional con la primera base del anticodón del Trna
- Estos puentes de H son más débiles que los apareamientos
convencionales de Watson y Crick
- Algunos tRNAs contiene Inosinato (I), que puede formar puentes de H con U,C y A
- Crick propuso un conjunto de 4 relaciones denominadas hipótesis del balanceo

HIPÓTESIS DEL BALANCEO

1. Las dos primeras bases del codón siempre forman apareamientos fuertes (tipo Watson-
Crick) con las bases correspondientes del anticodón
2. La primera base del anticodón (apareada con la tercera del codón) determina el número de
codones reconocidos por el tRNA.
o Cuando la base es A o C, el anticodón solo reconoce un codón
o Si la base es U o G, se reconocen dos codones
o Si la base es inosina (I), se pueden reconocer tres codones
1. Cuando un aminoácido es codificado por varios codones diferentes, los codones que difieren
en las dos primeras bases requieren tRNAs diferentes
2. Para traducir los 61 codones se requiere un mínimo de 32 tRNAs (31 para codificar los
aminoácidos y uno para el inicio)

2
CÓDIGO GENÉTICO RESISTENTE A MUTACIONES

- La degeneración del código permite que ciertas mutaciones puntuales no alteren el aa

codificado
o La mayoría de estas mutaciones son silenciosas (el nucleótido en el DNA es
diferente pero el aa codificado es el mismo)
- La mutación de la primera base de un codón produce frecuentemente una sustitución
conservadora
o Ejemplo:
 GUU  Val
 AUU Leu

RIBOSOMA

- El ribosoma es una compleja máquina

supramolecular
- Representan ~25% del peso seco de la
célula procariótica
- ~65% rRNA, 35% proteínas
o rRNA forma el núcleo estructural
o El ribosoma es un ribozima: el RNA cataliza la formación del enlace peptídico
- Formado por dos subunidades unidas (30S y 50S en bacterias). El mRNA se desplaza en la
hendidura entre ambas subunidades

Los rRNAs poseen estructuras secundarias complejas

- La estructura secundaria de los rRNAs de la subunidad pequeña de los tres dominios de la

vida está muy conservada
- Son abundantes los apareamientos de bases intracatenarios

RIBOSOMAS ES BACTERIAS Y EUCARIOTAS

- Son muy similares

- Formados por dos subunidades con el mRNA desplazándose en la hendidura entre ambas
- En eucariotas son mayores (80S60S Y 40S) y más complejos (contienen > 80 proteínas)
- Mitocondrias y cloroplastos tienen ribosomas más sencillos que los de bacterias

tRNAs CARACTERÍSTICAS

- Actúan como adaptadores en la traducción del lenguaje de los ácidos nucleicos al de las
proteínas
- ssRNA de 73–93 nucleótidos en bacterias y eucariotas
- Estructura secundaria en forma de hoja de trébol con cuatro brazos
- La estructura tridimensional se parece a una L retorcida
- Todos tienen la secuencia CAA en el extremo 3’
- La mayoría tienen un residuo de G en el extremo 5’
- Presentan bases modificadas
o Derivados metilados de las bases principales

3
ESTRUCTURA DEL tRNAs

- Brazo del aminoácido

o Lleva un aminoácido específico esterificado por su grupo carboxilo al grupo
hidroxilo 2’ o 3’ del residuo de A de la secuencia CAA (del extremo 3’ del tRNA)
- Brazo anticodón
o Contiene el anticodón
- Brazo D
o Contiene el nucleótido infrecuente dihidrouridina (D)
o Contribuye al plegamiento
- Brazo TψC
o Contiene pseudouridina (ψ) (tiene un enlace inusual entre la base y la ribosa)
o Contribuye al plegamiento

4
 BIOLOGÍA MOLECULAR

TEMA 8. METABOLISMO DE PROTEINAS II

ETAPAS DE LA SÍNTESIS DE PROTEINAS

1. Activación de aminoácidos
- Síntesis de aminoacil-tRNA
1. Inicio de la traducción
o mRNA y el aminoacil-tRNA se une al ribosoma
1. Elongación
o Se repiten ciclos de unión del aminoacil-tRNA al ribosoma y formación del enlace
peptídico… hasta alcanzar un codon STOP
1. Terminación y rescate de ribosomas
o El mRNA y la proteína se disocian y el ribosoma se recicla
1. Plegamiento y modificaciones postraducción
o Catalizadas por diferentes enzimas

ACTIVACIÓN DE AMINOÁCIDOS

- Paso 1 − Formación de un intermedio aminoacil adenilato

o Las aminoacil-tRNA sintetasas esterifican los 20 diferentes aminoácidos con sus
correspondientes tRNAs
 El grupo COO– del aminoácido ataca al fosfato del ATP se crea un intermedio
aminoacil adenilato
o El pirofosfato (PPi ) liberado también se hidroliza por lo que se consumen dos enlaces
fosfato de alta energía y la reacción global es practicamente irreversible

- Paso 2 – Transferencia del aminoacil adenilato al tRNA

o Aminoacil-tRNA sintetasas (dos clases) transfieren el grupo aminoacilo desde el enzima
al tRNA

Aminoacil-tRNA sintetasas

- Cada enzima se une a un aminoácico específico y al tRNA correspondiente

- La mayoría de las células tienen 20 aminoacil-tRNA sintetasas diferentes, una para cada
aminoácido
- Algunas células contienen menos de 20 sintetasas; en este caso, un aminoácido se convierte en
otro después de cargarse en el tRNA

Interacción entre una aminoacil-tRNA sintetasa y un tRNA: un segundo código genético

- Las aminoacil-tRNA sintetasas deben ser específicas para el aminoácido y el tRNA

o El emparejamiento de un determinado aa con sus tRNAs ha sido calificado un “segundo
código genético”
o Este código consiste en el reconocimiento molecular de un tRNA específico por una
sintetasa específica
- Unos pocos nucleótidos en el tRNA confieren la especificidad de union:
o Región anticodón
o Brazo del aminoáccido
o Otras partes de la molécula del tRNA

1
INICIO DE LA TRADUCCIÓN

- La síntesis de proteínas comienza con aminoácido específico

- El primer tRNA es exclusivo
- El primer codón de cualquier péptido es AUG (Met)
- Hay un solo codón para Met pero todos los organismos tienen dos tRNAs para Met:
o Bacterias, cloroplastos y mitocondrias utilizan para el inicio de la traducción un tRNA
especial denominado tRNAfMet que incorpora N-formilmetionina como primer
aminoácido
o El resto de Met utilizan un tRNA normal denominado tRNAMet.
- En eucariotas las proteínas comienzan con Met, (no fMet), pero también utilizan un tRNA
especializado para el inicio de la traducción

Aminoácidos inusuales que forman parte de las proteínas

- Es una expansión natural del código genético para introducir dos nuevos aminoácidos en las
proteínas
- En todos los organismos hay 20 aminoácidos codificados por el código genético convencional
- Además, hay otros dos aminoácidos que también están codificados genéticamente y aparecen en
unas pocas proteínas
- Selenocisteina
o Se forma después de cargar con Ser un tRNA que reconoce un codón UGA (stop) en
baterias y eucariotas
o Es un tRNA especial que se encuentra en la célula en niveles muy bajos
- Pirrolisina
o Se une directamente a un tRNA que reconoce a un codon UAG (stop) en algunas arqueas

Ingredientes clave para el inicio de la síntesis de proteínas (procariotas)

- El inicio de la traducción require un gran complejo

- En bacterias se requiere:
o Subunidad 30S del ribosoma
o mRNA
o fMet-tRNAfMet
o Factores de inicio IF-1, IF-2 e IF-3
o Subunidad 50S del ribosoma
o GTP
o Mg2+

El inicio de la traducción en procariotas consta de tres pasos

- Paso 1: IF-1, IF-2, IF-3 y el mRNA se unen a la subunidad 30S del ribosoma
o El factor de iniciación IF-3 mantiene separadas las subunidades 30S y 50S
o La secuencia de Shine-Dalgarno es una region del mRNA que es complementaria del
RNA ribosómico 16S
o La secuencia de Shine-Dalgarno guía al codón de inicio del mRNA (5’)-AUG hasta la
posición correcta

- Paso 2: fMet-tRNAfMet se une al complejo

o fMet-tRNA cargado con formilmetionina (fMet-tRNAfMet) se une al sitio P del
ribosoma y se aparea con el codón AUG

- Paso 3: Se asocia la subunidad 50S

o La subunidad mayor del ribosoma (50S) se combina con la menor (30S) y se forma el
complejo de inicio
 IF-2 hidroliza GTP
2
ELONGACIÓN

Los enlaces peptídicos se forman durante la fase de elongación

- Paso 1: Unión de un aminoacil-tRNA entrante

o El aminoacil-tRNA se une primero a un complejo EF-Tu –GTP
o El complejo aminoacil-EF-Tu-GTP se une al sitio A del complejo de inicio 70S
o Se hidroliza GTP y EF-Tu-GDP se disocia del ribosoma

- Paso 2: Formación del enlace peptídico

o En este punto, se encuentran dos aminoácidos unidos a tRNAs y en posición para
enlazarse
 Uno está situado en el sitio A y el otro en el sitio P
o Se transfiere N-formilmetionina desde su tRNA en el sitio P al aminoácido en el sitio A
 La reacción está catalizada por el rRNA 23S (ribozima)
o El tRNAfMet “descargado” (sin el aminoácido) se encuentra ahora en el sitio P

- Paso 3: Translocación del ribosoma

o El ribosoma se desplaza un codon hacia el extremo 3’ del mRNA –
 Se usa la energía de la hidrólisis del GTP
 GTP forma parte de EF-G (translocasa)
 Deja libre el sitio A para un nuevo aminoacil Trn

TERMINACIÓN

- Requiere una señal específica: un codón STOP

- UAA, UAG, o UGA en el sitio A provoca la actuación de los factores de terminación RF-1, RF2,
RF-3
- Estos factores ayudan a:
o hidrolizar el enlace terminal péptidotRNA
o Liberar el péptido y tRNA del ribosoma
o Disociar las subunidades del ribosoma para que comience de nuevo la etapa de inicio

MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES

- Algunas proteínas requieren modificaciones antes de alcanzar la conformación biologicamente

activa:
- Eliminación enzimática del grupo formilo del primer residuo (procariotas)
- Acetilación del residuo N-terminal (50% proteínas eucarióticas)
- Eliminación de la secuencia señal
- Adición de carbohidratos
- Modificación proteolítica (eliminación de secuencias para activar enzimas)
- Modificación de aminoácidos concretos con grupos fosfato, grupos carboxilo o grupos metilo
- Adición de grupos isoprenilo (como farnesil pirofosfato) a partir de intermedios de la ruta de
síntesis del colesterol
o El isopreno o sus derivados permiten el anclaje de proteínas a la membrana
- Adición de grupos prostéticos
- Formación de puentes disulfuro

3
DESTINO Y DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS

- Las células eucarióticas poseen muchos orgánulos y

compartimentos con funciones específicas. La
organización subcelular ayuda a la
compartimentalización de las rutas metabólicas
- Las proteínas se desplazan desde el lugar de síntesis a
su destino final, que puede ser:
o Fuera de la célula
o Formar parte de la membrana
o Entrar a un compartimento subcelular
- La mayoría tienen una secuencia señal
o En el extremo amino terminal en proteínas
destinadas a mitocondrias, cloroplastos o RE
o A menudo se elimina durante el transporte o
una vez que la proteína ha alcanzado su destino
- Las bacterias pueden dirigir proteínas a las membranas interna o externa, espacio periplásmático
entre estas membranas o al exterior cellular. Utilizan para ello secuencias señal en el extremo
amino

Péptidos sintetizados en el RE rugoso

- Las proteínas de los lisosomas, de las membranas y secretadas se sintetizan en ribosomas unidos
al RE
- Tan pronto el péptido emerge del ribosoma, la secuencia señal (en el extremo amino, 13-36 aas
de longitud) se une a la partícula de reconocimiento de la señal (SRP)
- El complejo SRP/ribosoma/RNA se dirige a la luz del RE
o Algunas modificaciones postraducción tienen lugar aquí (glicosilación, formación de
puentes disulfuro, etc.)
- Desde el RE las proteínas se transportan al aparato de Golgi en vesículas de transporte
- El destino final depende secuencias específicas o algún rasgo estructural

GLICOSIDACIÓN DE PROTEÍNAS

- Las glicoproteínas se forman uniendo un oligosacárido a la cadena lateral de un aminoácido. La

union puede ser de dos formas:
- Enlace N-glicosídico (nitrógeno de Asn o Arg)
o Comienza en el RER y concluye en el Golgi
- Enlace O-glicosídico (oxígeno de Ser, Thr, Tyr)
o Ocurre en el Golgi o citosol (para proteínas que no entran al RE)

Proteínas de mitocondrias y cloroplastos

- Se sintetizan en ribosomas libres en el citosol

- Se unen a chaperonas en el citosol y se dirigen hasta la traslocasa de la membrana externa del
orgánulo para dirigirse a su destino final (membrana externa, membrana interna, espacio
intermembrane o matriz)

4
Proteínas con destino al núcleo

- Las proteínas que se dirigen al núcleo se sintetizan en el citosol y poseen una secuencia de
localización nuclear (NLS)
o Secuencia interna corta y rica en aminoácidos básicos
o La NLS NO se elimina una vez la proteína ha alcanzado su destino
 Las proteínas nucleares pueden sufrir ciclos de entrada y salida del núcleo
- Se unen a las importinas α y β y a una GTPasa llamada Ran
- El complejo formado se dirige al poro nuclear y se produce el transporte al interior del núcleo
- Las proteínas ribosomales se sintetizan en el citosol, se importan al núcleo, se ensamblan para
formar las subunidades del ribosoma en el nucleolo y se exportan de vuelta al citosol
- La comunicación molecular entre el núcleo y el citosol require del movimiento de
macromoléculas a través de poros nucleares
- El poro nuclear o nucleoporo es uno de una serie de pequeños orificios en la membrana nuclear
que sirven como canal utilizado para el transporte de ácidos nucleicos y proteínas dentro y fuera
del núcleo

DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS

- Todas las células disponesn de sistemas especializados para la

degradación de proteínas
- La degradación impide la acumulación de proteínas defectuosas o
innecesarias
- La vida media de las proteínas varia de segundos a días, incluso
meses
o La hemoglobina tiene una vida media elevada
o Las proteínas defectuosas y las que tienen una vida corta se
degradan, tanto en bacterias como en eucariotas, por sistemas
citosólicos dependientes de ATP. Igual ocurre con proteínas
reguladoras que responden a necesidades cambiantes

Mecanismo de degradación

- En E. coli, Lon hidroliza proteínas defectuosas o de corta vida

- En eucariotas las proteínas se unen a la proteína ubiquitina
o La cascada de ubiquitinación requiere 3 enzimas (E1, E2 y
E3): E1 enzima activadora; E2 enzima para formación de
conjugados de ubiquitina; E3 enzima de ligación de
ubiquitina
- Las proteínas marcadas con ubiquitina se degradan en un gran
complejo denominado proteosome 26S
- Ubiquitina es una proteína muy conservada en todos los eucariotas
La síntesis de proteínas es la diana principal de muchos antibioticos y toxinas
naturales

- Las diferencias entre la síntesis de proteínas en bacterias y eucariotas, aunque sutiles, son
suficientes para que la evolución natural haya favorecido la aparición de compuestos que
explotan estas diferencias

5
ANTIBIÓTICOSO QUE BLOQUEAN LA TRADUCCIÓN

- Puromicina (eucariotas y bacterias)

o Producida por el hongo Streptomyces alboniger
o Su estructura es muy similar al extremo 3’ de un aminoacil-tRNA
o Se une al sitio A del ribosoma y se forma un enlace peptídico entre el péptido y
puromicina
o No puede participar en la translocación y se disocia, terminando prematuramente la
síntesis de proteínas

- Tetraciclinas (bacterias)
o Bloquean el sitio A del ribosoma

- Cloramfenicol y cicloheximida
o Bloquean la transferencia del peptidilo
o Cloranfenicol inhibe la síntesis de proteínas en ribosomas de mitocondrias, cloroplastos
y bacterias
o Cicloheximida bloquea la peptidil transferasa de ribosomas eucarióticos pero no de
mitocondrias, cloroplastos y bacterias

- Estreptomicina (bacterias)
o Provoca la lectura incorrecta del código genético a bajas concentraciones.
Concentraciones mayores inhiben la etapa de inicio

TOXINAS QUE BLOQUEAN LA TRADUCCIÓN

- Toxina diftérica
o Cataliza la ADP-ribosilación de un residuo de diftamida (histidina modificada) del eEF2
y lo inactiva
- Ricina
o Proteína extremadamente tóxica obtenida de semillas de ricino – Inactiva la subunidad
60S del ribosoma eucariótico al despurinar una adenosina específica del rRNA 28S

6
BIOLOGIA MOLECULAR

TEMA 9. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

PRINCIPIOS DE LA REGULACIÓN

- Procesos que influyen en la concentración en estado estacionario de una proteína

- Tipos de regulación del inicio de la transcripción
o Regulación negativa
o Regulación positiva
- Proteínas reguladoras
o Dominios de union al DNA
o Dominios de interacción proteína-proteína

Pautas para entender la regulación de la expresión génica

- El inicio de la transcripción es un punto de regulación fundamental en todos los organismos

- También es importante la regulación postranscripcional y de la traducción
- La regulación de la transcripción depende de contactos precisos entre proteína y DNA y también
proteína-proteína

- Genes constitutivos (Housekeeping gene)

o Sus productos se requieren en todo momento
o Expresión constitutiva (se expresan a un nivel más o menos constante en todas las células)
- Genes regulados
o Los niveles de expression aumentan o disminuyen con las necesidades del organismo
o Pueden ser genes inducibles
▪ Capaces de ser activados. El proceso se denomina activación
o También pueden ser genes reprimibles
▪ Capaces de ser desactivados. El proceso se denomina represión

El inicio de la transcripción se regula mediante proteínas que se unen a los promotores o cerca

- La RNA polimerasa se une a las secuencias promotoras que se localizan cercanas al sitio de inicio de
la transcripción
- La interacción RNA pol-promotor determina la velocidad de inicio de la transcripción
- Las proteínas reguladoras (factores de transcripción) modulan esta interacción, aumentandola
(activadores) o inhibiendola (represores)
- Las proteínas reguladoras, para modular el inicio de la transcripción, se unen a secuencias reguladoras

Secuencias consenso de los promotores que regulan la expresión de los genes en E. coli

- La mayoría de los promotores de bacterias incluyen dos regiones conservadas y centradas en las
posiciones –10 y –35 que interaccionan con el factor  de la RNA polimerasa
o Las sustituciones de bases en estas regiones tienen un efecto negativo sobre la afinidad de la
RNA pol por el promotor
- Algunos promotores también incluyen el elemento UP (promotor aguas arriba)
Mecanismos para regular la transcripción en bacterias

- Uso de factores σ
o Reconocen diferentes clases de promotores
o Permite la expresión coordinada de diferentes colecciones de genes

- Unión de otras proteínas (factores de transcripción) al promotor

1
 o Reconocen promotores de genes específicos
o Pueden unir pequeñas moléculas señalizadoras (llamadas efectores o ligandos)
o Pueden experimentar modificaciones postraducción
o Su afinidad hacia el DNA puede alterarse por unión del ligando o modificaciones
postraducción
o Permiten la expresión de genes específicos en respuesta a señales en el ambiente

EFECTORES

- Los efectores regulan la actividad de activadores y represores al introducir un cambio conformacional

- Los represores reducen la interacción RNA pol-promotor o bloquean a la polimerasa
o Se unen a una secuencia específica en el DNA denominada operador (bacterias)
▪ El operador generalmente se localiza cerca del promotor en bacterias, pero en
eucariotas pueden estar alejadas del promotor y se denomina silenciador
o La union del efector al represor puede aumentar o disminuir la afinidad del represor por el
operador y, por tanto, disminuir o aumentar la transcripción
o La regulación génica por represor es mucho menos común en eucariotas
- Los sitios de union de los activadores en el DNA se denominan potenciadores (enhancers)
- Con frecuencia, en bacterias, los potenciadores se localizan cerca del promotor
o Adyacentes a promotores débiles (la RNA pol se une débilmente) por lo que el activador es
necesario
- En eucariotas los potenciadores pueden localizarse distantes del promotor
o La regulación por activadores es común en eucariotas

Regulación positiva o negativa

- La regulación negativa implica a los represores

o El efector se une al represor y aumenta su afinidad por el DNA. El represor se une al DNA y
bloquea la transcripción
o Alternativa: el efector induce la disociación del repressor del DNA y la transcripción se induce
- La regulación positiva implica a los activadores
- Aumenta la actividad de la RNA polimerasa
o El activador se une en ausencia del efector (señal molecular) y tiene lugar la transcripción. En
presencia del efector, el activador se disocia del DNA y la transcripción se inhibe
o Alternativa: el activador se une en presencia del efector y se disocia en ausencia del efector

¿Cómo puede un activador, unido a un potenciador alejado varios miles de pb del promotor, facilitar la
unión de la RNA pol II al promotor? Por la formación de un lazo en el DNA

- Los activadores pueden regular la transcripción de un promotor que se encuentra localizado a miles
de pb de distancia
- Se require la formación de un lazo de DNA
- La formación del lazo se ve facilitada por proteínas denominadas reguladores arquitectónicos
- La interacción entre el activador y la RNA pol en el promotor está mediada por proteínas de
intermediación denominadas coactivadores

- En eucariotas las proteínas reguladoras se denominan factores de transcripción y pueden ser:

o Activadores
o Represores
- Las proteínas que NO se unen al DNA pero SI se unen a los factores de transcripción y regulan el
inicio de la transcripción se denominan correguladores y pueden ser:
o Coactivadores
o Correpresores

2
PUENTES DE HIDROGENO

- Unión de las proteínas al DNA

- El surco mayor del DNA tiene el tamaño adecuado para la hélice  y contiene grupos expuestos para
formar puentes de H

REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN BACTERIAS

Un operón es un grupo de genes que comparten un promotor y secuencias reguladoras – Los genes del operón
se transcriben en un solo mRNA policistrónico

OPERÓN LAC

- Se regulan el lacZ, lacY y lacA

- Sujeto de regulación negativa a través de un represor

- Cuando la glucosa es abundante y la lactosa escasa, las células sintetizan cantidades muy pequeñas de
las enzimas para el metaboliso de la lactosa
o El operon de la lactosa se encuentra reprimido
- Si la glucosa es escasa y la lactosa está disponible, las células expresan las enzimas para el
metabolismo de la lactosa
o No se produce represión del operon de la lactosa

Inhibición de la transcripción del operón lac por una proteína represora

- Un gen llamado lacI codifica un repressor denominado represor Lac

o Tiene su propio promotor (PI )
▪ La transcripción del represor es independiente de la transcrición de las enzimas que
regula el represor – El represor puede unirse a tres operadores (O1–O3 )
o El represor se une preferentemente al operador O1
▪ O1 es adyacente al promotor
▪ La union del represor previene la union de la RNA polimerasa al promotor
- El represor también se une a uno de los operadores secundarios y el DNA forma un lazo entre O1 y el
operador secundario
o Se reduce la transcripción, pero continua a un nivel basal, incluso con el represor unido

La alolactosa es el inductor del operon lac

- La alolactosa (un inductor) se une al represor y provoca su disociación del operador

o -galactosidasa no solo hidroliza la lactosa, también la isomeriza a alolactosa
o [Allolactosa]  cuando [Lactosa] 

El operón lac está sujeto a control positivo

- El operón lac está sometido a otro mecanismo de regulación denominada represión por catabolito
- Está regulada por la disponibilidad de glucosa
- Cuando la glucosa está disponible, los genes para el catabolismo de la lactosa están reprimidos
o Está mediada por cAMP y la proteína receptora de cAMP denominada CAP

Cuando la glucosa está ausente, la proteína CRP-cAMP estimula la transcripción del operón lac

- La proteína CRP-cAMP se une cerca del promotor

o Estimula la transcripción 50 veces
o El DNA se curva alrededor de la proteína
o El complejo abierto para la transcripción no se forma sin CRP-cAMP unido al DNA
3
 - CRP-cAMP solo ejerce su efecto cuando el repressor Lac se disocia
- cAMP se sintetiza cuando la [glucosa] es baja

En ausencia de lactosa la transcripción es mínima

- Si la lactosa no está disponible, independientemente de que la [glucosa] sea alta o baja, el represor
permanece unidono ha y transcripción

En presencia de lactosa, la transcripción depende de los niveles de glucosa

- El represor se disocia, pero la transcripción solo se estimula de forma significativa si aumenta la

[cAMP]

REQUERIMIENTOS PARA LA INDUCCIÓN INTENSA DEL OPERÓN LAC

- La lactosa debe estar presente para formar alolactosa que se une al represor y causa su disociación del
operador
o Se reduce la represión
- La [glucosa] debe ser baja para que el cAMP aumente, se una a CRP, y el complejo cAMP-CRP pueda
unirse cerca del promotor
o Se produce activación

- Cuando lactosa es baja, el represor está unido: →inhibición

- Cuando lactosa es alta, el repressor se disocia: →se permite la transcripción
- Cuando la glucosa es alta, CRP no se une: →la transcripción está mermada
- Cuando la glucosa es baja, cAMP es alto y CRP se une →activación