UT 10

CLONACIÓN
DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
 ¿qué vamos a ver?

01 03
COMPONENTES DE LA BIBLIOTECAS DE ADN
CLONACIÓN

02 04
FASES DE LA APLICACIONES
CLONACIÓN
 LA CLONACIÓN MOLECULAR

Como hemos visto, cuando se

trabaja con ácidos nucleicos, es
importante tener una cantidad
adecuada de ellos.
Esto puede realizarse mediante
una PCR o bien, mediante una
CLONACIÓN MOLECULAR
 LA CLONACIÓN MOLECULAR

Mediante este proceso se amplifican secuencias

de ADN genómico (del núcleo) o de ADNc, in vivo.
Mediante el uso de endonucleasas de restricción,
se crean moléculas de ADN recombinante, que se
introducirán en una célula huésped, por lo que al
replicarse, se obtendrán copias del ADN
recombinante ( y por tanto, del fragmento de
interés)
 LA CLONACIÓN MOLECULAR

MULTIPLICACIÓN
EN CULTIVO, DE
INSERCIÓN DEL LAS CÉLULAS CON
FRAGMENTO DE EL ADN
ADN EN UN VECTOR RECOMBINANTE

INTRODUCCIÓN RECUPERACIÓN
DEL VECTOR DEL FRAGMENTO
RECOMBINANTE EN DE ADN DE
UNA CÉLULA VIVA INTERÉS
HOSPEDADORA
 LA CLONACIÓN MOLECULAR
VENTAJAS
OBTENER CANTIDADES ILIMITADAS DE LA
SECUENCIAS DE INTERÉS Y ADEMÁS, ESTAS PUEDEN
SER DE GRAN TAMAÑO (millones de pares de
bases)

EN UN ÚNICO PROCESO SE PUEDE CLONAR PERMITE LA EXPRESIÓN DE GENES →

EL GENOMA ENTERO DE UN ORGANISMO→ APLICACIONES INDUSTRIALES
LIBRERÍAS GENÓMICAS
 01
COMPONENTES
DE LA
CLONACIÓN
 VECTORES DE CÉLULAS
CLONACIÓN HOSPEDADORAS

Moléculas de ADN
que se replican de Al replicarse,
forma autónoma amplifican el
dentro de una vector de
célula y que clonación que se
permiten que se les ha introducido
les introduzca Esto se produce en
ADN exógeno un cultivo
(inserto)
VECTORES
DE Consisten en moléculas de ADN
CLONACIÓN
que se replican de forma
autónoma en una célula, que se
denomina célula huésped. Esta
célula permite que se
introduzca en su interior un
ADN extraño y que este
mantenga su capacidad de
replicación autónoma
 Estos vectores deben permitir
VECTORES
que se inserte el ADN (inserto)
DE
CLONACIÓN
en ellos. Los lugares en los que
se inserta son secuencias diana
de enzimas de restricción.
Deben contener algún marcador
que permita distinguir qué
células tienen el vector. Los
marcadores más frecuentes son
genes de resistencia a
antibióticos
 TIPOS DE VECTORES
VECTORES
DE
CLONACIÓN

PLÁSMIDOS BACTERIÓFAGOS CÓSMIDOS

CROMOSOMAS VECTORES
FAGÉMIDOS ARTIFICIALES LANZADERA
 Es ADN bicatenario circular
VECTORES
DE de origen bacteriano
CLONACIÓN
(extracromosómico) que
puede replicarse de forma
autónoma.
Basándose en plásmidos
naturales, se han creado
plásmidos mediante
ingeniería genética.
PLÁSMIDOS

► Plásmido pBR322 (ADN pequeño) 20copias/célula

► Plásmido pUC18: (ADN hasta 10 kb. (inserto grande) 500
copias/célula)
VECTORES
Partes de un plásmido
DE
CLONACIÓN
Origen de Marcador de Región
replicación: selección promotora:
• Necesario • Solo las • Dirige la
para la células que expresión
replicación contienen el de
plásmido proteínas
del crecerán en el
plásmido medio de del ADN
PLÁSMIDOS
cultivo. P.ej: clonado
gen de
resistencia a
antibióticos
VECTORES
Partes de un plásmido
DE
CLONACIÓN

PLÁSMIDOS
VECTORES
Partes de un plásmido
DE
CLONACIÓN

PLÁSMIDOS

BR 322
VECTORES
Particularidad del plásmido UC 18
DE Contiene:
CLONACIÓN
► Gen para la resistencia a
antibióticos
► Gen con su promotor para la
expresión para la enzima ẞ-
galactosidasa (lac Z)
PLÁSMIDOS
► Polilinker que contiene varios
sitios sobre los que pueden actuar
varias enzimas de restricción
(contiene varias dianas de
restricción )
VECTORES
Particularidad del plásmido UC 18
DE
CLONACIÓN Gen lac Z → la bacteria que lo posee puede sintetizar la ẞ
galactosidasa → la colonia se volverá de color azul

Si se introduce el inserto (ADN exógeno) en mitad del gen

lac Z, ( que es el lugar donde se suele insertar) este se
inutiliza → la bacteria NO puede sintetizar la ẞ
galactosidasa → permanecerá de color blanco
PLÁSMIDOS
Si se añade al medio el antibiótico para el cual el plásmido
proporciona resistencia, las bacterias sin plásmido, morirán
VECTORES
Particularidad del plásmido UC 18
DE
CLONACIÓN LA BACTERIA
EL GEN LAC Z EL GEN LAC Z
ESTÁ INACTIVADO NO PORTA EL ESTÁ EN EL
POR EL INSERTO PLÁSMIDO PLÁSMIDO

BACTERIA BACTERIA
CON EL LA BACTERIA CON
PLÁSMIDOS
INSERTO EN HA MUERTO PLÁSMIDO
MITAD DEL (pero sin
GEN LAC Z inserto)
 El vector plasmídico, se puede diseñar de modo que la secuencia del gen
de interés a clonar se coloque específicamente en el marco de
VECTORES lectura del gen lacZ.
DE Al insertar la secuencia de esta manera, se interrumpe el gen lacZ y la
CLONACIÓN bacteria se vuelve incapaz de sintetizar la enzima β-galactosidasa
Las bacterias que tengan el plásmido pero éste NO TENGA la secuencia
recombinante, pueden romper el X-gal presente en el agar del medio,
tornándose sus colonias de color azul.
Las bacterias que han sido transformadas (tienen el inserto), no pueden
procesar X-gal y permanecen con su coloración blanca natural.
De este modo, las bacterias que porten el plásmido sin la secuencia
recombinante insertada en el lugar correcto, producirán β-
galactosidasa activa y serán de color azul, mientras que aquellas que
PLÁSMIDOS lleven el vector recombinante, serán blancas.
Las blancas que no porten el plásmido se eliminan, añadiendo un
antibiótico al medio para el cual el plásmido aporta resistencia, de modo
que podemos seleccionar las colonias recombinantes que portan el vector
con nuestra secuencia, sencillamente por su color.
 Colonias azules: portan el plásmido sin el inserto
de ADN
VECTORES Colonias blancas: se interrumpió la secuencia del
DE gen lac Z con el inserto de ADN, por lo que no
CLONACIÓN pueden producir la enzima β-galactosidasa debido
a que la región que sintetiza a la enzima se parte
para introducir la secuencia recombinante. ( o bien
no portan el plásmido)

PLÁSMIDOS
EL OBJETIVO

BACTERIAS
CON EL
PLÁSMIDO Y
EL INSERTO
EN SU LUGAR
ADECUADO.
 VECTORES
DE
Son virus capaces de infectar
CLONACIÓN bacterias. Cuando el virus se
introduce, procede a controlar el
metabolismo de la célula y replica
su cromosoma en el interior de la
célula .
Algunos fagos son capaces de
BACTERIÓFAGOS
O FAGOS
insertar su material genético
recombinándolo con el
cromosoma bacteriano.
Esto es lo que hace el fago λ.
 VECTORES
DE Para utilizarlo como vector,
CLONACIÓN
se recombina su material
genético, con el material de
interés que se quiere clonar.
Posteriormente se
introducirá en la célula y se
BACTERIÓFAGOS
O FAGOS replicará, replicando a su vez
el fragmento de ADN de
interés
 VECTORES
DE
Cuando el bacteriófago inserta
CLONACIÓN su cromosoma en el
cromosoma bacteriano se
produce el ciclo lisogénico
(se replica junto con la
bacteria). Es en estos
casos cuando se usa el
BACTERIÓFAGOS
O FAGOS
bacteriófago como vector de
clonación
Se permiten insertos de hasta
20Kb
 VECTORES
DE
CLONACIÓN

BACTERIÓFAGOS
O FAGOS
VECTORES
DE
CLONACIÓN
Es un vector híbrido: Es un
plásmido formado por una
parte del cromosoma del
fago λ (secuencias cos,
que se utilizan para su
CÓSMIDOS recircularización) y otras
PERMITE
partes de un plásmido. INSERTOS
DE HASTA
50KB
VECTORES
DE
CLONACIÓN ADN plasmídico

CÓSMIDOS
VECTORES
DE
CLONACIÓN La parte de plásmido
incluye también un
origen de replicación
(replicación autónoma)
CÓSMIDOS
un polylinker y un PERMITE
marcador de selección. INSERTOS
DE HASTA
50KB
VECTORES
DE
CLONACIÓN
Incluyen una parte de
plásmido con su origen
de replicación y un
origen de replicación del
un Fago (M13 o F1).
FAGÉMIDOS
Esto permite la
producción de cadenas
MONOCATENARIAS
VECTORES
DE
CLONACIÓN
Se utilizan en
experimentos de
secuenciación y para
FAGÉMIDOS
obtener sondas
monocatenarias
 Permiten transportar (y clonar)
VECTORES
DE insertos de gran tamaño.
CLONACIÓN
Útiles en la creación de genotecas
genómicas
Los más utilizados son:

CROMOSOMAS
►CROMOSOMAS ARTIFICIALES
ARTIFICIALES BACTERIANOS (BAC) transportan insertos
de hasta 300kb

► CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE
LEVADURAS (YAC) insertos de más de 1Mb
VECTORES
DE
CLONACIÓN
En este caso existen dos orígenes
de replicación (de 2
hospedadores distintos). Uno de
un plásmido bacteriano y otro de
una levadura o un virus animal .

Se incluyen marcadores genéticos

VECTORES
LANZADERA que permiten la selección en
ambos huéspedes.
VECTORES
DE Su finalidad es transportar
CLONACIÓN
insertos entre 2 hospedadores
distintos, para valorar
expresión génica.

Normalmente se amplifica el
VECTORES
inserto en una bacteria (que
LANZADERA
suele ser E. Coli) para luego
expresarlo en el segundos
hospedador.
 En ellas se introduce el
vector de clonación para que
CÉLULAS
HOSPEDADORAS

se produzca su amplificación
al replicarse.
La célula se cultiva con el
vector en medios adecuados.
Todas las células hijas
contienen la misma carga
genética que la original por
tanto son clones.
 CÉLULAS
Las células
HOSPEDADORAS
hospedadoras pueden
ser:

Células procariotas → Bacterias

Células eucariotas → Levaduras, células
vegetales y células animales (de
insectos o de mamíferos )
 Son las más utilizadas para
CÉLULAS
HOSPEDADORAS clonar plásmidos, fagos y
cósmidos.
Se utilizan cepas con
características concretas
por ejemplo sin
exonucleasas, para evitar
que degraden el vector.
BACTERIAS

la más usada es E. coli

cepa K12
 CÉLULAS Las levaduras se utilizan para
HOSPEDADORAS
clonar YAC.

Las células vegetales y

animales se utilizan para
introducir genes extraños en el
genoma de las células
CÉLULAS hospedadora, para que se
EUCARIOTAS
exprese en ella y obtener
organismos transgénicos
 02
FASES DE LA
CLONACIÓN
 CONSTA DE 3 FASES

FASE I: Creación del vector

recombinante

Fase II: Introducción del vector

en la célula hospedadora

Fase III: Selección e

identificación de los clones que
poseen la secuencia de interés
FASE I: Creación del vector Preparación del ADN
recombinante que se va a clonar

Tratando al ADN bicatenario con enzimas de restricción.

Estas enzimas restricción serán compatibles con el vector que se
va a utilizar (para poder cortarlo con las mismas)

Se debe tener en cuenta que la secuencia que se debe clonar no

tenga una secuencia compatible con esta enzima de restricción
(para que no se corte la secuencia objetivo y se destruya).
FASE I: Creación del vector Preparación del vector
recombinante de clonación

Se debe digerir con la misma enzima de restricción

que se utilizó para preparar el ADN que se va a
clonar.
FASE I: Creación del vector Introducción del ADN
recombinante extraño en el vector

Se mezcla el ADN extraño con el vector en las

concentraciones adecuadas y se incuban en presencia de
una ADN ligasa.
El proceso por el que se unen ambos se denomina
ligación.
Se puede realizar de 4 modos distintos
Fase II: Introducción del vector
en la célula hospedadora

► Transformación bacteriana
► Transfección
► Transducción
► Electroporación
 Transformación
Fase II: Introducción del vector
en la célula hospedadora bacteriana

Mediante un proceso químico se modifica la pared

bacteriana que de este modo permite que se introduzca el
ADN en su interior. Para ello las bacterias deben ser
competentes para aceptar este proceso.
La más utilizada es E.coli
Fase II: Introducción del vector
en la célula hospedadora transfección

Este proceso se da en células procariotas.

Se puede utilizar un vector recombinante, que se
introduce en el interior de la célula por endocitosis.
También se pueden utilizar lisosomas, que se fusionan
con la membrana y liberan su contenido al interior de la
célula
Fase II: Introducción del vector
en la célula hospedadora transducción

En este caso se utiliza un virus que posee el vector

recombinante en su interior. Con el virus se infecta el
cultivo celular.
Al infectarlo, los virus se introducirán en el interior de las
células.
Fase II: Introducción del vector
en la célula hospedadora electroporación

En la misma suspensión se encuentran las células y los

vectores recombinantes.
Se aplican impulsos de alto voltaje (breves) lo que
produce un aumento de la permeabilidad de la membrana.
Fase III: Selección e
identificación de los clones que
poseen la secuencia de interés

Cuando se ha terminado el proceso anterior,

Sin ADN

encontramos células sin moléculas de ADN, Con el

células con el vector recombinante, células vector

que portan moleculas no deseadas… Con

moléculas no

Por tanto deben seleccionarse las células de deseadas

interés en función de los marcadores que

lleve el vector
Fase III: Selección e
identificación de los clones que
poseen la secuencia de interés

GENES CON PROTEÍNAS GENES LETALES

RESISTENCIA A FLUORESCENTES
ANTIBIÓTICOS Se utilizan vectores con Las bacterias que
un gen que codifica una no portan el
Normalmente proteína fluorescente. inserto morirán al
ampicilina y Los insertos INACTIVAN tener el gen letal
el gen. sin el inserto en la
tetraciclina. Las colonias de mitad (por lo que
bacterias que porten el
estará activo.)
vector no emitirán
fluorescencia
Fase III: Selección e
identificación de los clones que
poseen la secuencia de interés

Se utilizan vectores con DOS genes de resistencia a

GENES CON antibióticos.
RESISTENCIA A El ADN se introduce en UNO de los genes de
ANTIBIÓTICOS resistencia. (p.e.tetraciclina) inactivándolo. De modo
que tendremos:
Normalmente ▪ Bacterias no transformadas: Sensibles a ampicilina y
tetraciclina
ampicilina y ▪ Bacterias con el vector recombinante: Resistentes a
ampicilina y sensibles a tetraciclina
tetraciclina. ▪ Bacterias que portan un vector no recombinante
. (resistentes a ampicilina y tetraciclina)
Fase III: Selección e
identificación de los clones que
poseen la secuencia de interés

Para seleccionar las bacterias

GENES CON 1º Crecimiento en cultivo con ampicilina →
RESISTENCIA A crecerán bacterias con vector.
ANTIBIÓTICOS 2º Se replica esta placa en una con tetraciclina→
solo crecerán bacterias que porten vector NO
Normalmente recombinante.
ampicilina y CONCLUSIÓN: Los clones recombinantes serán
tetraciclina. las bacterias que SI crecen en la placa con
. ampicilina y NO crecen en la placa con
tetraciclina
 03
BIBLIOTECAS
DE ADN
 GENÓMICAS

CROMOSÓMICAS
TIPOS
DE ADNc
 genómicas

Representación de todo el ADN

genómico de un organismo
Son colecciones de vectores
recombinantes que se han
clonado.
Incluyen el genoma completo de
un organismo
 genómicas

Para poder dar cabida a todo

el genoma, se utilizan fagos,
cósmidos, BAC o YAC.
 cromosómicas

Se construyen a partir de un
único cromosoma o de una
porción de él, obtenido a
partir de células en mitosis
 De ADN C

Obtenidas a partir de
ARNm, ya sea de un tejido
o de una población celular,
utilizando la
retrotranscriptasa inversa.
 De ADN C

Solo representan la
proporción de genes que
se están expresando
(en un tipo celular y en un estado
metabólico concreto)
 04
APLICACIONES
 INVESTIGACIÓN BÁSICA

INVESTIGACIÓN APLICADA
 INVESTIGACIÓN BÁSICA

Descifrar Estudios de Estudios de

secuencias Estudios diversidad expresión
génicas filogenéticos genética génica
 INVESTIGACIÓN APLICADA

vectores de expresión

para la creación de proteínas

recombinantes (insulina, vacunas,
hormona del crecimiento….),
creación de enzimas,
microorganismos que metabolizan
productos tóxicos….
 INVESTIGACIÓN APLICADA

insertando genes en células

vegetales o animales.
(organismos transgénicos y
organismos modificados
genéticamente (GMO)
mejorando los especímenes en agricultura,
o aumentando su resistencia a enfermedades
o aumentando la tasa de producción
 INVESTIGACIÓN APLICADA

En medicina tienen especial

interés
 REPASAMOS

https://quizizz.com/admin/quiz/
62665249f530b0001d259430
PÁGINA CON EL DETALLE DE LOS
GENOMAS DE DIFERENETS
ESPECIES

http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info
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