AREAS DE APLICACIÓN

Biología Celular: Microscopia (electrónica,

fluorescencia)

Biología Molecular (Proteínas, ARN y ADN)

Técnicas “ómicas” (Proteómica, Transcriptómica,

Genómica, Metabolómica)

Desarrollos Computacionales
 Para que sirven?

Investigación Básica

Diagnóstico.

Producción (“ingeniería genética”)

Caracterización (control de calidad hasta análisis forénsico)

Técnicas de Estudio de Biología Molecular: Ácidos Nucleicos

Clonado: aislamiento y amplificación de fragmentos de

ADN.

Hibridación: Detección, Caracterización y Amplificación.

Secuenciación: determinación de secuencias de genes y

genomas.

Manipulación: Tecnología del ADN Recombinante.

ESQUEMA
CLONADO

➢ La clonación = aislar una secuencia de

DNA de interés, insertarlo en un
VECTOR y obtener múltiples copias.
➢ Organismos procariotas.
➢ Propiedad básica del DNA que permite
el clonado: acoplamiento de cadenas
por complementariedad.
 Clonación
Clonación de ADN se hacen muchas copias de un fragmento de ADN de
interés. Puede consistir en insertar un gen blanco en una molécula de
ADN circular llamada plásmido.

El plásmido puede replicarse en bacterias para producir muchas copias

del gen de interés o se fabrica una proteína por ejemplo la insulina
recombinante (seres humanos y Escherichia coli)
 Vectores
Son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN de interés
ESTABLE : Posee secuencias que permiten su permanencia
en una célula huésped (integrado o como episoma)

MCS : (multiple cloning site) sitio para insertar el ADN a

clonar. Posee secuencias de corte para varias ER

MARCADORES DE SELECCIÓN: Confieren propiedades

fenotípicas a la célula huésped que permite seleccionar
a aquellas que reciban el vector.
MARCADORES DE INSERCIÓN (SCREENING): permite
identificar aquellos vectores que recibieron el ADN de
interés
 Tipos de vectores según su estructura
PLÁSMIDOS: Limite de clonado 0,1 - 10 Kb.

FAGOS o VIRUS: Derivados del bacteriófago λ o virus eucariotas (plantas o

de insectos). Límite de clonado 8 -25 Kb.

CÓSMIDOS: Combinación de fago λ y plásmido. Limite de clonado 35 - 50 Kb

BAC: (Bacterial Artificial Chromosome) Derivados del plásmido F. Límite de

clonado 75 - 300Kb

YAC: (Yeast Artificial Choromosome ). Cromosoma artificial de levadura.

Límite de clonado 100 - 1000 Kb
 Tipos de vectores según su función

Vectores de clonado: Aislamiento de fragmentos de DNA.

Vectores de expresión: Expresión de genes clonados.

Vectores especiales: Permiten el estudio de promotores y

secuencias regulatorias de la expresión génica
 Herramienta fundamental
O Las enzimas de restricción :
Endonucleasas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y luego cortan
los ácidos nucleicos por el esqueleto azúcar-fosfato.
Proporcionan una forma de cortar el DNA en forma específicas, produciendo una población
heterogénea de fragmentos.

Nomenclatura
EcoRI: E. Coli
BamHI: Bacillus amyloliquefaciens
 Herramienta fundamental
•Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (a distancia fija del
lugar de reconocimiento por ende, son secuencias al azar). secuencias relativamente
grandes que no presentan simetrías.
•Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o
palíndromes (de 4 o 6 pb)
✓ Corte plano: extremos romos
✓ Corte escalonado: extremos pegajosos o cohesivos
 Sitio de clonado multiple (mcs)

Región del vector que posee varias secuencias compatibles con sitios de corte
de enzimas de restricción.
Estos sitios son de corte único en todo el vector.
Normalmente esta asociado al marcador de screening.
 Ligación
Representa el proceso formación del
enlace fosfodiéster que se perdió
durante el proceso de restricción.
Lo realiza una enzima especializada
llamada ADN ligasa
 Clonación de ADN

Enzimas de restricción y de ADN ligasa.

Una enzima de la restricción
reconoce una secuencia específica y
corta el ADN.

Extremos de cadena sencilla cortos

que sobresalen.

Si dos moléculas tienen extremos

sobresalientes que se empatan,
pueden complementar sus bases y
unirse.

la ADN ligasa las une sellando los

espacios en el esqueleto del ADN.
 Transformación y selección bacteriana
Mediante transformación pueden introducir material genético en las bacterias en forma
estable, (plásmidos y otros tipos de ADN).
Dos formas:
Métodos químicos: Cl2Ca Eficiencia: 107 cel/μg DNA.
Métodos físicos: Electroporación Eficiencia: 1010 cel/μg DNA.
Es un proceso de despolarización de la membrana de corta duración y alta intensidad que
genera poros transitorios por los cuales entra el ADN
 Selección
Es el proceso que me permiten crecer SOLO aquellas células que poseen el vector (selección
positiva)
Para lograr esto, el vector posee: MARCADORES DE SELECCIÓN
TIPOS:
Resistencia a antibióticos: Ampicilina, tetraciclina, Kanamicina, Zeocina
Supresión de auxotrofía: gen que restaura alguna actividad metabólica vital Ej. Síntesis de
algún aminoácido.

➢ Cada bacteria sobreviviente

dará lugar a una colonia, de
bacterias idénticas que
contienen el mismo
plásmido.

➢ verificar que las colonias

contienen el plásmido
adecuado
 Screening
BUSCAR aquellas células que poseen el vector con el inserto de ADN deseado.

Técnicas que me permiten una búsqueda dirigida.

Técnicas:

❖ Marcador de screening: α-complementación, GFP (green fluorescent

protein, gen ccdB (sistema suicida), el producto del gen de interés.
(Western Blot o actividad enzimática)

❖ Secuencia del propio fragmento de interés: (Colony PCR, Mapeo de

restricción, Hibridación in situ ).
 Marcador de screening
Búsqueda del clon de interés visualizando un cambio fenotípico de la bacteria que halla
recibido el fragmento de ADN de interés en el vector.

El es un gen activo que esta asociado al MCS.

El sistema de a-complementación es el más utilizado y se basa en el gen de la enzima b-
galactosidasa (lacZ)
Debemos revisar las bacterias y usar solo aquellas
que tengan el plásmido correcto.

¿importa si el gen entra al revés en el plásmido?

 Hibridación
PCR

Variantes de PCR
Son técnicas que se basan en la
propiedad de
Southern Blot complementariedad de bases.

Northern Blot
 PCR (Polymerase Chain Reaction): desarrollada en 1986 por Kary Mullis.

La reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de temperatura que permiten la producción de

muchas copias de la región blanco.
el ADN amplificado se puede secuenciar visualizar por electroforesis en gel o clonar en un plásmido para
otros experimentos.
✓ DNA
✓ Buffer con Mg2+
✓ Cebadores/primers
✓ Dntps (nucleótidos)
✓ Taq polimerasa
✓ Termociclador
 Requisitos
➢ Conocer las secuencias blanco.
➢ Diseñar oligonucleótidos (primers) que determinan los límites
de la región amplificada.
➢ DNA polimerasa termoresistente (Thermus aquaticus, una
bacteria termofílica). Taq polimerasa.
➢ Un equipo que controle la temperatura - termociclador.
➢ Sistemas de visualización (geles agarosa, radiactivos,
fotométricos, colorimétricos).
➢ Muy sensible a la contaminación
➢ Inicialización: desnaturalizar el ADN, temperatura de
94-95°C durante 5-9 minutos.

CICLOS
➢ Desnaturalización: calentamiento a 94-95 °C
durante 30´´

➢ Templado: se produce la hibridación del primer, es

necesario bajar la temperatura a 50-65°C.

➢ Extensión: se sintetiza la nueva hebra de ADN

complementaria en dirección 5'→ 3', uniendo el
grupo 5'-P de los dNTPs con el grupo 3'-OH libre . Los
pasos 2,3,4 se repiten unas 25-35 veces.

➢ Elongación Final: ADN de cadena simple restante sea El número de

completada. Se lleva a cabo a una temperatura de 72
moléculas de ADN
a 74 °C de 5-15 minutos tras el último ciclo.
puede duplicarse en
cada ciclo.
 Pasos de la reacción:
A tener en cuenta:
➢ Para la Taq polimerasa, la temperatura óptima de actividad es 72
a 74°C.
➢ El tiempo de extensión depende de la longitud del fragmento de
ADN que se va a amplificar. (Taq polimerasa, agrega 1000
bases/minuto)
➢ La temperatura óptima de annealing es específica para cada
primer: depende de la LONGITUD y de su SECUENCIA

➢ Problemas
Temperaturas altas impedirán la unión del primer.
Temperaturas bajas llevarán a una unión inespecífica.
Hibridaciones internas de los primers o entre ellos.
 Temperatura de Hibridación

➢ Factor más determinante en la hibridación

Temperaturas demasiado altas no hibrida.
Temperaturas demasiado bajas hibridaciones inespecíficas.
➢ La temperatura óptima: suficientemente baja para para hibridación
específica del primer y secuencia complementaria, pero lo
suficientemente alta, para impedir hibridaciones no específicas.
➢ Esta temperatura puede calcularse en base a la temperatura de
fusión (melting temperature) o Tm del híbrido.
 VARIANTES DE PCR

✓ RT-PCR: real time PCR, número de copias.

✓ RT-PCR: transcripción reversa ligada a PCR, detección de
mRNA.
✓ PCR-RFLP: polimorfismo genético
✓ RAPDs: amplificación con random primers - polimorfismo
✓ PCR Nested: amplificación de una secuencia dentro de otra
previamente amplificada
✓ PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultánea
✓ Inverted PCR: para conocer secuencias flanqueadoras
✓ Long PCR : amplificación de fragmentos grandes 10 -20 kb.
 ➢ La electroforesis en gel es una técnica en La que corriente
eléctrica impulsa fragmentos de ADN a través de una matriz de
gel (agarosa o poliacrilamida).

➢ Típicamente se marcador de peso molecular.

➢ Las muestras de ADN se cargan en pozos en un extremo

de un gel y los fragmentos con carga negativa se mueven
hacia el electrodo positivo.

➢ Es estequiométrica la relación carga/masa, los fragmentos

pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes.

Muestras PM

➢ Preparado de muestras con buffer de corrida (Azul de bromofenol) que permite

ver el trayecto del ADN en la electroforesis.

➢ EL gel se tiñe con un intercalante de ADN (Bromuro de etidio) que fluorece al UV.
➢ los marcadores utilizados son altamente polimórficos, muchos alelos que varían en pequeños
incrementos de longitud.
➢ El ADN presenta regiones codificantes y no codificantes que pueden variar entre individuos
Patrones de bandas de hibridación específica.
➢ Las variantes de longitud VNTR (Repeticiones en Tándem de número Variable) unidades de repetición en
tándem en números variables.
.
➢ Las secuencias no codificantes están flanqueados por secuencias no redundantes y se hallan sitios
de reconocimiento para el corte por parte de endonucleasas de restricción.

➢ Pueden ser distintos "alelos" de un "locus" o si se analizan los de varios "loci" multilocus o multiplex

Minisatélites de ubicación localizada (single

locus)
➢ Técnicas para detectar la presencia de una secuencia de ácido
nucleico especifica en una mezcla a través de hibridación

➢ ADN Southern Blot. ARN Northern Blot,

➢ Se basa :
▪ Mezcla de ácidos nucleicos de diferentes tamaños (corte con enzimas
de restricción o por métodos químicos)
▪ Separación por diferentes tamaños técnicas electroforéticas.
▪ Detección de secuencia específica por hibridación Sonda
 Sondas
➢ Son oligonucleótidos sintéticos o fragmentos de DNA de simple
cadena complementarias a la región de DNA o RNA blanco.
➢ Contienen alguna “marca” que revela su unión (hibridación) a
la secuencia elegida, (P32 o sistemas luminiscentes).
Esquema del Southern Blot
Southern blot
✓ 1. Extracción y purificación del ADN.

✓ 2. Digestión del ADN con endonucleasas de restricción.

✓ 3. Electroforesis en gel de agarosa.

✓ 4. Desnaturalización=tratamiento con una solución alcalina para en el gel de agarosa y se obtienen fragmentos de ADN
monocatenario.

✓ 5. Transferencia=los fragmentos se transfieren luego a una membrana de nailon o nitrocelulosa. Se coloca el gel sobre un papel
de filtro saturado con buffer y luego colocando la membrana de filtro de nitrocelulosa en la parte superior del gel. Finalmente, se
colocan unos papeles de filtro secos encima de la membrana. Los fragmentos son empujados hacia la membrana del filtro de
nitrocelulosa por acción capilar y dan como resultado la impresión de contacto del gel.

✓ 6. Hibridación= la membrana se expone a una sonda de hibridación (fragmento de ADN con una secuencia específica). El ADN
de la sonda se marca incorporando radiactividad o una molécula con un tinte fluorescente o cromogénico.

✓ 7. Después de la hibridación, la membrana se lava para eliminar la sonda unida de forma inespecífica o sonda no unida.

✓ 8. La detección se realiza colocando la membrana de nitrocelulosa en contacto con una película fotográfica. El patrón de
hibridación se visualiza en una película de rayos X por autorradiografía (sonda radiactiva o fluorescente) o por el desarrollo de
color en si se usa un método de detección cromogénico.
 SOUTHERN BLOT

O Gel de agarosa 0.7% con 14 muestras O Placa radiográfica revelado con una sonda
corridas tras digestión con EcoRI. radiactiva para un detectar un gen de
interés.
 Aplicaciones

Caracterizar la identidad de genes específicos.

Investigar la organización molecular de las secuencias

genómicas. (filiación)

Detectar reorganizaciones y duplicaciones en genes

asociados a enfermedades genéticas humanas y a cáncer.

Detección marcadores genéticos. Ej. restriction site

polymorphism (RSP) y de mutaciones puntuales mediante
RFLP.
 SECUENCIACIÓN DE ADN

➢ La caracterización de un segmento de DNA clonado es la

determinación de su secuencia de nucleótidos.

➢ En 1965, Robert Holley determinó la secuencia de una

molécula de tRNA que contenía 74 nucleótidos. Se necesitó un

año de esfuerzo para realizar este trabajo.

➢ Un genoma humano en menos de 1 mes!!!!!!!!

➢ En 1977 Frederick Sanger (Nobel de Química) desarrolla la

técnica de secuenciación del ADN.

❖Es el proceso de determinar la secuencia de nucleótidos (A, T, C y G) de un fragmento de ADN.
❖Secuenciación de Sanger, se hacen fragmentos de diferentes longitudes.
❖Nucleótidos fluorescentes "terminadores de cadena" marcan los extremos de los fragmentos y permiten
la determinación de la secuencia.

En un nucleótido normal, el grupo hidroxilo 3' actúa

como un "gancho" que permite que un nuevo
nucleótido se añada a la cadena.
Preparación de los extendidos Preparación de la sonda
cromosómicos

Desnaturalización del ADN de cromosomas

y sonda

Hibridación

Lavados

Detección

Visualización
 Razas de maíces harinosos

FISH con sondas knobs. (A-F) Superposición DAPI (azul) / FISH. Ref. La punta de flecha roja indica un cromosoma con
morfología AB10. Las puntas de flecha amarillas muestran heterocigosis para la posición 6L. La punta de flecha blanca indica que los
knobs que hibridan solo con la secuencia de 180 pb. La punta de flecha naranja indica knobs hibridados solo con TR-1. Los números
indican los pares cromosómicos. Barras de escala = 10 µm.
❖ Las técnicas de nueva generación aumentan la velocidad y reducen el costo de la
secuenciación del ADN.

❖ Secuenciación genómica total romper el ADN del genoma en pedazos más pequeños y
ensamblar las secuencias en una única y larga "secuencia consenso".
❖ Hay una variedad de técnicas de secuenciación de nueva generación:

es como hacer un número muy grande de pequeñas reacciones de secuenciación de Sanger en

paralelo y a pequeña escala.

Los métodos de última generación permiten secuenciar grandes cantidades de ADN de forma mucho
más rápida y barata con que con la secuenciación de Sanger.

Karyogram for LTR retrotransposons clusters in Passiflora edulis (2n = 18). CLs 6 and 11
(Ty3/Gypsy/Chromovirus) (a, b); CLs 86 and 94 (Ty1/Copy/Maximus-SIRE) (c, d); CLs 36 and
135 (Ty3/Gypsy/Athila) (e, f); CL 43 (Ty1/Copy/Angela) (g) (Bar = 10 μm)
 Purificación de Proteínas : Cromatografía líquida
Esta técnica se basa en las propiedades físicas de las proteínas
Peso molecular (filtración en gel)

Punto isoeléctrico (intercambio iónico)

Hidrofobicidad (HIC, fase reversa)

Afinidad (proteínas de fusion, Ag-Ab, de ligando)

Purificación de Proteínas : Cromatografía líquida
➢ Permite la separación de moléculas diferentes en una muestra.
➢ Circulación de una fase móvil (que arrastra a la mezcla de
compuestos a separar), a través de una fase estacionaria.
➢ Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases
tengan los distintos compuestos presentes en la mezcla
resultará su separación.
➢ Fase estacionaria (FE): organizada en forma de una columna
con gran área superficial. Puede ser sólida o líquida.
➢ Fase móvil (FM): fluido que pasa a través de la fase estacionaria
y que arrastra la muestra para que interaccione con la FE.
Puede ser líquida o gaseosa.
 Cromatografía líquida: filtración en gel

✓ La FE formada por
perlas que son porosas.
✓ Mientras corre la FM en
una mezcla de
proteínas, las pequeñas
se retienen en los poros
y migran con menor
velocidad que las
grandes
 Cromatografía líquida: intercambio iónico
➢ La FE formada por perlas que están cargadas
➢ La mezcla de proteínas se encuentran en un buffer a pH
que deje cargadas a las proteínas.
➢ La mezcla se coloca sobre la columna y la FM mueve las
proteínas a través de las perlas cargadas.
➢ Aquellas proteínas que tengan la carga opuesta de las
perlas se quedan retenidas en la columna.
➢ Elución (remoción de las proteínas retenidas) utilizando un
buffer a pH que le cambie la carga a la proteína o con una
solución salina.
Cromatografía líquida: intercambio iónico
 Cromatografía líquida: hidrofobicidad
❑ La FE formada por perlas hidrofóbicas.
❑ La mezcla de proteínas se encuentran en un buffer salino
que exponga su hidrofobicidad.
❑ La mezcla se coloca sobre la columna y la FM mueve las
proteínas a través de las perlas hidrofóbicas.
❑ Las proteínas interaccionan con las perlas según su grado
de hidrofobicidad y quedan retenidas en la columna con
mayor o menor fuerza.
❑ Elución utilizando un buffer con un gradiente inverso de
solución salina (columna HIC o de interacción hidrofóbica) o
utilizando un gradiente creciente de solvente orgánico.
Cromatografía líquida: hidrofobicidad
 Cromatografía líquida: afinidad
✓ La FE formada por perlas que tienen pegado en forma
irreversible un ligando con el cual interacciona la proteína
de interés.
✓ La FM mueve las proteínas a través de las perlas
favoreciendo la interacción con el ligando, quedando
retenidas en forma especifica.
✓ Elución utilizando un buffer con una solución que cambie la
afinidad de la proteína por el ligando (pH, solución salina) o
eluyendo con el propio ligando disuelto en la FM.
✓ Diferentes tipos de ligandos (anticuerpos, sustratos, “tags”).
Cromatografía líquida: afinidad
Si se quiere obtener una proteina…
cromatografía de afinidad
Técnicas de Caracterización de proteínas
ELECTROFORESIS EN GEL DE SDS-POLIACRILAMIDA
(SDS-PAGE)

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL EN GEL

WESTERN BLOT

ELECTROFORESIS CAPILAR
Técnicas de Caracterización de Proteínas: Electroforesis
en gel de SDS-poliacrilamida
▪ El SDS (detergente iónico) carga las
proteínas negativamente.
▪ En condiciones reductivas, se
disocian las estructuras 4º y se
desnaturalizan las 3º.
▪ Los polipéptidos adoptan una
estructura extendida con relaciones
similares carga/ masa. Por ende
migran de acuerdo a su tamaño.
▪ Variante: condiciones no reductivas,
permite establecer composición de
subunidades unidas por puente
disulfuro
Técnicas de Caracterización de Proteínas: Electroforesis
bidimensional en gel
➢ Es para separar proteínas
de PM similares

➢ Primero se separan por

carga eléctrica (ENFOQUE
ISOELÉCTRICO)

➢ Luego por PM (SDS-PAGE)

Técnicas de Caracterización de Proteínas: Western Blot
❖ Permite detectar específicamente proteínas y que se encuentran
en baja cantidad en la muestra a ensayar.
❖ Procedimiento:
❖ Se hace una electroforesis en SDS.
❖ Se transfiere la corrida a una membrana porosa.
❖ Se impregna la membrana con un anticuerpo (Ab1)
específico para la proteína que se busca.
❖ Se incuba y se lava.
❖ Se agrega un segundo anticuerpo (Ab2) que se une al Ab1
fijado. El Ab2 está unido a una FOSFATASA ALCALINA que
cataliza una reacción cromógena.
❖ Se le agrega el sustrato a la fosfatasa y se visualiza un
precipitado púrpura en la banda de la proteína buscada.
Técnicas de Caracterización de Proteínas: Western Blot
 Terapia génica
Tratamiento que utiliza la transferencia de genes a la célula de un
paciente para curar una enfermedad.

La transferencia se suele realizar mediante el uso de vectores virales.

Tanto las enfermedades genéticas hereditarias como los trastornos adquiridos.

✓ Fibrosis quística, función de un gen de un

canal de cloruro producido en los
pulmones. se insertó copia del gen
funcional en un plásmido y se suministró a
las células pulmonares de los pacientes en
esferas de membrana.

✓ En inmunodeficiencias primarias la terapia

génica ha sido capaz de corregir la
presentación de la enfermedad en estos
pacientes y/o el cáncer, donde la terapia
génica aún está en fase experimental.
Transformación genética

Golden rice

Vaca que produce hormona Claveles transgénicos con diferentes coloraciones

de crecimiento humana de azul
 Producción de proteínas

Le damos a las bacterias una señal química

que les ordena producir la proteína blanco.

Las bacterias no tienen intrones y

no pueden empalmar transcritos
de ARN?????
Construcción de una planta transgénica
 Inhibe la enzima EPSPS la cual forma parte de la ruta del ácido shiquímico.
La inhibición de esta enzima impide que se sintetice el ácido corísmico, precursor de
los aminoácidos aromáticos (felinalanina, tirosina y triptófan)
Lepidópteros y coleópteros
a través de la expresión, en
sus tejidos, de proteínas
insecticidas. Los cultivos
resistentes a insectos
también se conocen como
cultivos Bt.
Bacillus thuringiensi y
cuyas esporas contienen
proteínas Cry específicas
que son tóxicas para
ciertos insectos. Estas
proteínas, se activan en el
sistema digestivo de la
larva y se adhieren a su
epitelio intestinal. Esto
provoca la parálisis del
sistema digestivo del
insecto plaga.