Tecnología del DNA recombinante

Introducción a la tecnología
del DNA recombinante
y a la clonación del DNA
La moderna era de la biotecnología comenzó
cuando se desarrollaron
las técnicas de clonación del DNA.
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Un grupo de investigadores
estudió la estructura del DNA
y su replicación en bacterias y
en bacteriófagos.

Gran parte de lo que

conocemos sobre la
replicación del DNA y sobre
las enzimas que sintetizan
DNA se ha aprendido
mediante el estudio de las
bacterias y los fagos.

Ej: ADN ligasa

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Definamos

El ADN recombinante (rADN) es una tecnología que utiliza enzimas

para cortar y unir secuencias de ADN de interés. Las secuencias de
ADN recombinado se pueden colocar en unos vehículos llamados
vectores que transportan el ADN hacia el lugar adecuado de la célula
huésped donde puede ser copiado o expresado.

La tecnología del DNA recombinante se

utiliza normalmente para hacer posible la
clonación de genes

Ingeniería genética a menudo se basa en la

tecnología del DNA recombinante y en la
clonación de genes para modificar el
genoma de un organismo
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Dos componentes esenciales que

hicieron posibles las técnicas de
clonación de genes y del DNA
recombinante: las enzimas de
restricción y el plásmido de DNA.
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En

Enzimas de
restricción

Un poco de
historia

Werner Arber Hamilton O. Smith

El crecimiento limitado de los fagos se
Aisló HindIII, la primera enzima de
producía porque algunas bacterias
restricción que pudo ser bien descrita y
contenían enzimas que podían cortar el
utilizada para la clonación del DNA
DNA de los virus en trozos pequeños,
evitando así la replicación viral.
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Enzimas de restricción

• Las enzimas de restricción son enzimas

cortadoras de DNA

• Se encuentran sobre todo en las bacterias

• También se denominan endonucleasas de

restricción (endo = «dentro de», nucleasa =
«enzima cortadora de ácido nucleico») ya que
cortan dentro de las secuencias de DNA.

• Cortan el DNA rompiendo el enlace fosfodiéster

(en el eje azúcar fosfato) que une los
nucleótidos adyacentes en una cadena de DNA.
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Funciones de las enzimas
de restricción

• Proteger el genoma

• Vigilar y reparar el ADN

• Solo reconocen secuencias

específicas dentro del ADN que se
denominan secuencias de
reconocimiento (4-8 nucleótidos).
Palíndromos
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Tipo de enzimas de restricción
• Tipo I: cortan el ADN lejos del sitio de
reconocimiento
• Tipo II: cortan el ADN en el sitio de Corte con extremos cohesivos
reconocimiento o pegajosos.

Corte con extremos romos

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Ejemplo de sitio de reconocimiento
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Práctica virtual

https://www.labtools.us/nebcutter-v2-0/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/
Experimento de Paul Berg 14

Unió DNA del cromosoma

de E. coli y DNA de un virus
de primate denominado
SV40

https://www.youtube.com/watch?v=u-_10gnpdxI
 Plásmidos o vectores de DNA 15

Plásmido de DNA es una forma

circular de DNA autorreplicante que
los científicos pueden manipular
para transportar y clonar otros
trozos de DNA.

Stanley Cohen
Cohen postulaba que se podía utilizar a los plásmidos
como vectores, partes de DNA que pueden aceptar,
Cohen estaba interesado en la biología molecular de las pequeñas partes transportar y replicar (clonar) otras partes de DNA.
circulares de DNA conocidas como plásmidos
 Crear DNA
recombinante

Cohen y Boyer trabajaron con dos

plásmidos bacterianos para clonar DNA con
éxito.
 17
Transformación de células bacterianas
y selección antibiótica de bacterias
recombinantes

El laboratorio de Cohen demostró la transformación,

un proceso para insertar DNA extraño en bacterias.

Incorporar moléculas de ADN foráneo dentro de una

célula huésped.

-transformación por electroporación: implica aplicar

un pulso breve (de un milisegundo) de electricidad de
alto voltaje para hacer agujeros minúsculos en la pared
celular bacteriana que permitan entrar al DNA.

Foto de plásmidos hecha con un

microscopio electrónico. (aumentada 14.285
https://www.youtube.com/watch?v=-z9yiCu2JjM veces)
 18

Selección
Durante la transformación, la mayoría de
las células no incorporan DNA. La
selección facilita la identificación de (la
selección a favor de) bacterias
recombinantes a la vez que evita el
crecimiento bacterias no transformadas y
bacterias que contienen plásmidos sin
DNA foráneo.

• Selección antibiótica
• Selección azul-blanca (gen lacZ
codifica β-galactosidasa (β-gal)
 19

Selección
Las bacterias no transformadas no pueden crecer
en presencia de ampicilina porque les falta el DNA
del plásmido que contiene un gen de resistencia a la
ampicilina

El agar también contiene un sustrato cromogénico

para la β-gal llamado X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-
β-D-galactopiranósido).

Xgal es similar a la lactosa en estructura y se vuelve

azul cuando lo rompe β-gal.

No recombinantes: producen β-gal y se vuelven

azules

Recombinantes: DNA foráneo insertado dentro del

gen lacZ, no se produce β-gal y estas células no
pueden metabolizar X-gal.
 20

Clonación de un gen en un plásmido

con selección azul-blanca.
 21

Características prácticas de los vectores de

clonación del DNA

Los plásmidos siguen siendo los vectores de clonación

más utilizados.

• Tamaño
• Origen de la replicación (ori)
• Sitio de clonación múltiple (MCS)
• Genes marcadores que se puedan seleccionar
• Secuencias del promotor de RNA polimerasa
• Secuencias de cebadores (primers u oligonucleótidos) para
la secuenciación del DNA

Foto de plásmidos hecha con un

microscopio electrónico. (aumentada 14.285
veces)
Tipos de vectores 22

Vectores como los

plásmidos bacterianos
no pueden ser
utilizados para todas
las aplicaciones en
biotecnología.
¿Cómo identificar y clonar 23
un gen de interés?

1. Crear bibliotecas de DNA

Las bibliotecas son

colecciones de fragmentos
de DNA clonados de un
organismo particular
contenidos dentro de
bacterias o virus como
hospedadores.
 24
¿Cómo identificar y clonar un gen de interés?

Hibridación de colonias: rastreo de la biblioteca con

una sonda de DNA para identificar el gen clonado de interés

https://www.youtube.com/watch?v=Il5qmeHIj6Q&t=33s

https://www.youtube.com/watch?v=F4C6M1ZWGfI
 25

¿Cómo identificar y clonar un gen

de interés?

Reacción en cadena de la polimerasa

 26

¿Cómo identificar y clonar un gen

de interés?

Clonación de productos de PCR

Aplicaciones de la tecnología del DNA recombinante 27
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