CRISPR 2

Plásmidos
- elementos gené,cos que existen exclusivamente o primordialmente fuera de un
cromosoma y se pueden replicar de forma autónoma.
- sirven de vector para clonar e insertar genes.
- Los plásmidos de clonación ,enen
1. polylinker" (also "mul,ple cloning site", MCS).
§ segmento corto de ADN que con,ene muchos (hasta ~20) si,os de
restricción que permite la inserción de genes de interés por enzimas
de restricción.
§ se encuentra en una variedad de vectores, incluidos vectores de
clonación para aumentar el número de copias de la secuencia de
interés.
2. marcadores de selección como genes
• le confieren a la bacteria resistencia a an,bió,cos.
i. Cuando se expresa el gen, permite que sólo las bacterias que
con,enen plásmidos crezcan en medios que con,enen ese
an,bió,co.
ii. este plásmido con,ene el gen de resistencia a ampicilina. Esto
indica que solo las bacterias con el plásmido pueden crecer en
un medio de cul,vo que tenga ampicilina.
• Estos genes de resistencia a los an,bió,cos brindan:
i. Manera fácil de detectar bacterias que con,enen plásmidos
ii. Brindan a esas bacterias la presión para mantener y replicar su
plásmido a lo largo de múl,ples generaciones.
3. Otras secuencias:
• El origen de replicación (ori): Secuencia de ADN que dirige el inicio de
la replicación del plásmido (por bacterias) mediante el reclutamiento
de maquinaria de replicación del ADN.
• Insert: el gen que uno quiere insertar/estudiar.
• Promotores y otras regiones par,culares.
Enzimas de restricción
- cortan dsDNA. (endonucleasas) Son el sistema immune innato de la bacteria.
- Reconocen secuencias específicas y su corte puede ocurrir en la misma secuencia de
reconocimiento o unas bases más lejos.
- Los cortes producen "s<cky" o "blunt" ends.
- Pueden ser:
o Isoschizomer:
§ enzimas que reconocen la misma secuencia que otra con la misma
especificidad. Hacen el corte en el mismo lugar. Pueden diferir en
condiciones de reacción y sensi,vidad a la me,lación.

o Neoschizomer:
§ reconocen la misma secuencia pero difieren en si,o de corte.
Directed evolu<on workflow.
- método u,lizado en la ingeniería de proteínas que imita el proceso de selección
natural para dirigir proteínas o ácidos nucleicos hacia un obje,vo definido por el
usuario.
- Pasos:
1. generación de una biblioteca de genes variantes.
a. gen de interés puede mutarse mediante mutaciones aleatorias,
transposones y DNA shuffling.
b. La mayoría de las mutaciones son perjudiciales, por lo que las
bibliotecas de mutantes ,enden a tener en su mayoría variantes con
ac,vidad reducida.
2. Screening
a. se u,lizan ensayos para medir la ac,vidad de la proteína y encontrar
variantes raras con mutaciones beneficiosas que mejoren las
propiedades deseadas.
3. Amplificación
a. secuencias gené,cas aisladas se amplifican mediante PCR o mediante
bacterias transformadas.
b. Se puede u,lizar la mejor secuencia individual o un conjunto de
secuencias como plan,lla para la siguiente ronda de mutagénesis.
- Los ciclos repe,dos de Diversificación-Selección-Amplificación generan variantes de
proteínas adaptadas a las presiones de selección aplicadas.
 Experimento

- Obje<vos:
o técnica de CRISPR-Cas 9 para cortar
§ gen lacZ del cromosoma bacteriano (codifica)à enzima B-galactosidasa
• Gen lacZ:
o parte del operón Lac
o una colección de genes que son necesarios para que la
bacteria u,lice lactosa como fuente de alimento.
• B-Galactosidase (lacZ) metaboliza Xgal
o Análogo de lactose que al metabolizarse produce:
§ Galactosa
§ 5-bromo—4-chloro-3-hydroxyindole-1
• Se oxida y dimeriza a 5,5’-dibromo-4,4’-
dichloro-indigo-2 (insoluble de color azul)

- Edición de genes
o 2 pasos:
1. Corte de doble hebra de DNA en la localización de interés
2. Uso de Sistema de Reparación de la célula para producer el cambio de la
secuencia de interés
o DNA chromosomal bacteriano es cortado, célula puede:
§ Reparar el corte
• Nonhomologous end joining (NHEJ)
o proteínas específicas conectan el corte de la doble hebra
o s,cky ends
• Homology directed rapair (HDR)
o una enzima arregla el corte mediante el uso de una plan,lla de
DNA (donor template)
o Los cienhficos diseñan la plan,lla de DNA que puede inlcuir la
sequencia de interés (blunt ends).
§ No se repara el corte y muere la célula
- En este experimento:
o Se u,lizará CRISPR-Cas9 para cortar el gen LacZ y se u,lizará grandes can,dades de
plan,lla del DNA (donor template) para inducir que la célula u,lice HDR para reparar
el corte.
o Bacteria a u,lizar:
§ E. coli HB101-pBRKa
§ Naturalmente expresa el gen LacZ funcional.
§ Ha sido alterada para que exprese Cas9 y un plásmido que con,ene unos
genes que permiten que la célula pueda u,lizar el Sistema de Reparacion de
HDR.
§ En esta bacteria, expresión del mecanismo de HDR es controlado por
“arabinose-inducible promoter”.
§ La bacteria fue modificada para que no puedan realizar NHEJ.
o Plásmidos
§ Las bacterias no producen normalmente el sgRNA y la plan,lla del DNA
(donor template) para editar el gen lacZ.
§ Tu transformarás la bacteria para introducir el sgRNA y la plan,lla con uno de
dos plásmidos:
• pLZDonor (control)- incluye la plan,lla de DNA que se u,lizará para
HDR y una sequencia que se inserta al gen lacZ e impide su función.
• pLZDonorGuide- incluye ambos la plan,lla de DNA, la sequencia que
se inserta al gen lacZ que impide su función y la secuencia de sgRNA.
Una vez se transcriba, el sgRNA va a dirigir a Cas9 para que corte LacZ.
o Todas las cepas crecieron en medios que con,enen los siguientes elementos:
§ Kanamycin: an,bio,co marcador de selección para la bacteria.
§ IPTG: induce expresión de β-gal.
§ X-gal: es hidrolizada por β-gal para producir un pigmento azul.
§ Arabinose: induce expresión del Sistema HDR.
§ Spec,nomycin: an,bio,co marcador de selección para la bacteria (se va a
transferir).