GENOTECAS GENOMICAS DE cADN

CONCEPTO DE GENOTECA

Una genoteca es una coleccin de clones

conteniendo fragmentos de DNA que comprenden la totalidad (o casi) de las secuencias de ese genoma.

Pasos de la clonacin celular

Se comienza con el aislamiento del ADN genmico (ADNg) Es digerido con enzimas de restriccin, genera una enorme cantidad de segmentos cortos de ADN, llamados fragmentos de restriccin Las molculas de ARN son convertidas en ADN por sntesis de ADN complementario (ADNc), mediante la enzima transcriptasa reversa.

 Estos fragmentos son incorporados a otras secuencias de ADN (vectores plsmidos o bacterifagos). Las molculas resultantes de esta unin se denomina ADN recombinante. Los vectores con sus fragmentos de restriccin se introducen en la clula hospedadora (bacterias principalmente, levaduras u otras clulas eucariotas), las cuales son sembradas en medios de cultivo

Animacin > construccin de genoteca

Elaboracin de genotecas
La genoteca puede ser de ADN genmico (ADNg) que es una coleccin de fragmentos de ADN genmicos clonados en un vector, que en conjunto representan la totalidad del ADN o genoma de un organismo. A partir de este tipo de genoteca se podr seleccionar el clon que posea un ADN recombinante especfico y cultivarlo posteriormente para amplificarlo

 La genoteca de ADNc es el conjunto de clones obtenidos a partir de los ARN mensajeros (ARNm), por lo que comprendern una seleccin del total de genes de la clula, ya que slo aquellos genes que estn siendo expresados son transcritos al ARNm. Una vez que la informacin est disponible en la forma de genoteca de ADNc, los segmentos procesados individualmente podrn ser aislados y examinados con relativa facilidad

Pasos para la elaboracin de genotecas

Obtencin del ADN y ARNm Los insertos pueden ser esencialmente de dos tipos: fragmentos de ADNg y ADNc obtenido a partir del ARNm.
Sntesis del ADNc La sntesis de los ADNc se logra utilizando un cebador de las molculas de ARNm de clulas eucariotas y la accin de la enzima transcriptasa reversa, la cual sintetiza una cadena complementaria de ADN por cadena de ARNm existente

 Vectores El vector es el vehculo que transporta un gen dentro de la clula receptora y es responsable de su replicacin. Y debe de cumplir con las siguientes caractersticas:
Ser capaz de replicarse dentro de la clula receptora. Un vehculo para clonacin necesita ser pequeo. Poseer marcadores para la seleccin de las bacterias que los capten. Poseer una o varias secuencias de restriccin en donde las endonucleasas de restriccin acten generando extremos para ligar los insertos.

Los plsmidos
Son pequeas molculas circulares de ADN de doble cadena que se replican en las bacterias con independencia del cromosoma bacteriano. Sin embargo, cuentan con enzimas y protenas codificadas por el hospedador para su replicacin y transcripcin.
Se utilizan como vectores de clonacin dependiendo de su tamao

Algunos plsmidos son capaces de replicarse por insertarse en el cromosoma de las bacterias formando los llamados episomas.

Los bacterifagos o fagos

Hasta 983, casi todas las clonaciones de ADNc se realizaban usando plsmidos como vectores y las genotecas eran usualmente mantenidas como una coleccin por encima de 105 colonias bacterianas transformadas.
Algunas veces esas colonias eran recolectadas, amplificadas en cultivo lquido y almacenadas a 70C. y en otras, eran mantenidas en la superficie de filtros de nitrocelulosa

 En ambos casos, los resultados eran insatisfactorios. Las genotecas eran difciles de preservar sin la prdida de viabilidad y la evaluacin por hibridizacin con mltiples sondas radiactivas, requera la replicacin de las colonias de un filtro de nitrocelulosa a otro.

 Con la obtencin ms eficiente de ADNc y la disponibilidad de adaptadores, entre otros avances, se consider posible aprovechar la alta eficiencia y reproducibilidad del empaquetamiento in vitro del ADN del bacteriofago , en la partcula viral.

Las genotecas resultantes pueden ser amplificadas y almacenadas indefinidamente sin prdida de viabilidad y pueden ser evaluadas fcilmente con cidos nucleicos y antibiticos

Los bacterifagos son virus que infectan especficamente a bacterias. Son estructuras simples que consisten en molculas de ADN