INVESTIGACION ORIGINAL
publicado: 21 de septiembre de 2018 doi:
Editado por:
Teresa Zotta,
Consiglio Nazionale delle Ricerche
(CNR), Italia
Revisado por:
Patrizio Tremonte,
Universidad de Molise, Italia
Lorena Ruiz,
Instituto de Productos Lácteos
de Asturias (IPLA), España
* Correspondencia:
Remco Kort
r.kort@vu.nl
† La dirección actual:
Peiman Milani,
Fundación Vista y Vida,
Kaiseraugst, Suiza
Sección de especialidad:
Este artículo fue enviado a
Microbiología alimentaria,
una sección de la revista
Frontiers in Microbiology
Recibido: 29 de mayo de 2018
Aceptado: 30 de agosto de 2018
Publicado: 21 de septiembre de 2018
Citación:
Parker M, Zobrist S, Donahue C,
Edick C, Mansen K,
Hassan Zade Nadjari M, Heerikhuisen M,
Sybesma W, Molenaar D, Diallo AM,
Milani P y Kort R (2018) Leche
naturalmente fermentada del norte de
Senegal: bacteriana
Composición de la comunidad
y enriquecimiento probiótico con
Lactobacillus rhamnosus.
Frente. Microbiol. 9: 2218.
doi: 10.3389 / fmicb.2018.02218
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10.3389 / fmicb.2018.02218
Leche fermentada naturalmente del norte
de Senegal: bacteriana
Composición de la comunidad y
Enriquecimiento probiótico con
Lactobacillus rhamnosus
Megan Parker 1, Stephanie Zobrist 1, Chantal Donahue 1, Connor Edick 1,
Kimberly Mansen 1, Mehdi Hassan Zade Nadjari 2, Margreet Heerikhuisen 2,
Wilbert Sybesma 3, Douwe Molenaar 4, Abdoulaye Moussa Diallo 5,6, Peiman Milani 1 † y Remco Kort 2,3,4,7 *
1 PATH, Seattle, WA, Estados Unidos, 2 Microbiología y Biología de Sistemas, Organización de los Países Bajos para la Investigación Científica Aplicada (TNO),
Ámsterdam, Países Bajos, 3 Fundación Yoba for Life, Amsterdam, Países Bajos, 4 Departamento de Biología Celular Molecular, Universidad VU de Ámsterdam, Ámsterdam,
Países Bajos, 5 Departamento de Sociología, Université Cheikh Anta Diop de Dakar, Dakar, Senegal, 6 Helite SARL, Dakar, Senegal, 7 ARTIS-Micropia, Amsterdam, Países
Bajos
Una variedad de alimentos fermentados con bacterias del ácido láctico sirven como alimentos básicos en muchas
comunidades africanas; sin embargo, sus perfiles bacterianos están mal caracterizados. La integración de probióticos que
promueven la salud en productos lácteos fermentados naturalmente podría tener un impacto profundo en la salud
humana. Aquí, caracterizamos la composición de la comunidad bacteriana de un producto lácteo fermentado naturalmente
( lait caillé) del norte de Senegal, preparado en cuencos de madera (lahals) con una biopelícula bacteriana para dirigir el
proceso de fermentación. Incorporamos un cultivo iniciador probiótico que contiene la cepa probiótica más documentada Lactobacillus
rhamnosus GG (nombre genérico de la cepa yoba
2012) en el proceso de fermentación local. Secuenciación de amplicones de ARNr 16S con código de barras de lait caillé muestras
indicaron que la comunidad bacteriana de lait caillé tiene una gran riqueza de especies con más de 100 géneros
bacterianos; sin embargo, pocos tienen gran abundancia. En contraste con las diversas composiciones bacterianas de
otros productos lácteos fermentados naturalmente caracterizados, la composición de lait caillé consiste
predominantemente en bacterias del ácido láctico Estreptococo y Lactobacillus, asemejándose a la composición
bacteriana del yogur normal. La composición de la comunidad bacteriana de lait caillé
varía geográficamente según la presencia de algunos géneros, incluyendo Lactoccoccus, Enterococcus, Bi fi
dobacterium, y Bacilo, pero esta tendencia no es consistente dentro de las comunidades de producción. La
diversidad de comunidades bacterianas es mucho mayor en el lahal biopelícula que en los productos lácteos
fermentados naturalmente, que a su vez es mayor que en los yogures comerciales. Adición de un cultivo iniciador
con L. rhamnosus
yoba 2012 para ordeñar en lahals condujo a un crecimiento sustancial de esta bacteria probiótica durante el proceso
de fermentación. Dos análisis de PCR cuantitativos independientes específicos para L. rhamnosus yoba 2012 indicó
un aumento de 20 a 60 veces en el número total de bacterias probióticas en el primer lote después de la inoculación.
Un aumento similar
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del probiótico se observó en una variación de lait caillé preparado con gránulos de mijo ricos en carbohidratos ( thiakry) añadido
antes de la fermentación. Este estudio muestra la viabilidad de integrar cepas probióticas promotoras de la salud en
alimentos fermentados naturalmente producidos en regiones con una alta prevalencia de desnutrición.
Palabras clave: leche fermentada naturalmente, lait caillé, comunidad bacteriana, probióticos, Lactobacillus rhamnosus yoba
2012, Lactobacillus rhamnosus GG
INTRODUCCIÓN
Durante miles de años, los alimentos fermentados han estado presentes en las dietas
tradicionales en todo el mundo y continúan siendo ampliamente consumidos. Históricamente,
las comunidades producían alimentos fermentados dentro del hogar, una práctica que
continúa hasta el día de hoy en muchos entornos. La capacidad de fermentar alimentos
permite a las comunidades consumir de forma segura tanto productos lácteos como verduras
independientemente de la temporada y prolongar la vida útil sin refrigeración ( Steinkraus,
1997 ). Además, la fermentación agrega valor a los alimentos al mejorar sus propiedades
organolépticas, enriqueciendo las propiedades nutricionales a través de una digestibilidad
mejorada e introduciendo beneficios para la salud de bacterias y levaduras viables, así como
modificaciones asociadas a la fermentación, incluida la degradación de antinutrientes y
toxinas ( Marco et al., 2017 ).
Uno de los alimentos fermentados tradicionales más comunes es la leche
fermentada naturalmente, que tiene una larga historia de consumo en África. En
muchas regiones de Senegal, la leche fermentada naturalmente se conoce como lait
caillé y forma un componente integral de la dieta diaria. Estudios etnográficos recientes
han documentado el papel de lait caillé en las dietas de alimentación complementaria de
lactantes y niños pequeños en el norte de Senegal ( Zobrist et al., 2017, 2018 ). La
comunidad microbiana de la leche impulsa el proceso de fermentación y es de gran
importancia para la vida útil, la seguridad, las propiedades nutricionales y
organolépticas del producto final. La leche fermentada naturalmente ofrece un medio
asequible de administrar bacterias probióticas con beneficios específicos para la salud,
particularmente en entornos de escasos recursos ( Franz et al., 2014 ). En el norte de
Senegal, donde el 18% de los niños menores de cinco años padece retraso en el
crecimiento, el 9% emaciación y el 18% insuficiencia ponderal ( Agence Nationale de la
Statistique et de la Démographie [ANSD], ICF, 2017 ), el consumo de leche fermentada
probiótica presenta una oportunidad prometedora para abordar las enfermedades
entéricas y la desnutrición entre los niños. Investigamos la viabilidad de integrar la cepa
probiótica Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), miembro de la Lactobacillus casei grupo,
en el proceso de fermentación natural de lait caillé.
La cepa LGG se ha utilizado como probiótico en más de 30 países y se ha
convertido en un probiótico paradigmático para la investigación de las interacciones
huésped-microbio ( de Vos, 2011 ). Sus beneficios para la salud están bien
documentados e incluyen la prevención y el tratamiento de trastornos
gastrointestinales, incluida la diarrea, y la estimulación de respuestas inmunitarias
que promueven la vacunación o previenen las alergias, entre otros beneficios ( Segers
y Lebeer, 2014 ). Además, el probiótico L. rhamnosus Se ha demostrado que la GG se
une y neutraliza las toxinas que se sabe que contaminan los alimentos, lo que reduce
su absorción en el tracto gastrointestinal ( Lahtinen y col., 2004 ). Otros beneficios de
LGG incluyen
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Composición y enriquecimiento de la leche fermentada
la prevención del deterioro, la mejora de la seguridad alimentaria y el aumento del
valor nutricional mediante la entrega de vitaminas ( Kort et al., 2015 ). Estudios previos
han demostrado que la inclusión de LGG en el proceso de fermentación evitó la
proliferación del patógeno alimentario. Cronobacter sakazakii en una matriz de sorgo y
suprimió eficazmente cinco patógenos alimentarios en un producto lácteo africano ( Mpofu
et al., 2015 ). Las evaluaciones sensoriales de la leche fermentada LGG en África
Oriental indicaron que las propiedades del producto final, incluida la textura,
viscosidad, cremosidad, sabor, acidez, dulzura y sensación en la boca, fueron bien
aceptadas por las comunidades locales ( Kort et al., 2015 ).
Durante la última década, hemos introducido la cepa probiótica LGG en el
continente africano con su nombre genérico.
L. rhamnosus yoba 2012 mediante el uso de un novedoso cultivo iniciador seco ( Kort y
Sybesma, 2012 ; Sybesma et al., 2013 ; Kort et al., 2015 ). Esta iniciativa ha permitido el
acceso a esta bacteria probiótica para 250.000 personas a través de la producción,
distribución y venta local de yogur probiótico en África Oriental ( Westerik et al., 2018 ).
En este estudio, examinamos las composiciones de la comunidad bacteriana en lait
caillé de seis ciudades y pueblos diferentes en el norte de Senegal y exploró cómo el
proceso de producción y la ubicación geográfica afectan a las comunidades
microbianas. Analizamos las comunidades bacterianas de lait caillé muestras
preparadas en cubos de plástico en pequeñas tiendas y en cuencos tradicionales de
madera ( lahals) dentro de los hogares. A continuación, comparamos la composición y
diversidad de estos lait caillé comunidades con los presentes en yogures comerciales
comprados de la misma región y dentro del lahal biopelículas; los lahal Las biopelículas
sirvieron como cultivo iniciador para la leche fermentada naturalmente dentro de la
madera doméstica. lahals. Aquí, usamos este proceso de fermentación tradicional en el
norte de Senegal y mostramos por primera vez que el probiótico L. rhamnosus se
propaga bien en leche fermentada naturalmente. Este estudio allana el camino para la
integración de cepas promotoras de la salud en alimentos fermentados naturalmente.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestreo de leche fermentada naturalmente
Recolectamos preparados tanto a nivel nacional como comercial lait caillé muestras
de comunidades de la provincia de Saint-Louis, en el norte de Senegal ( Figura 1). Las
muestras domésticas se prepararon dentro de las casas en cuencos de madera
tradicionales ( lahals) y las muestras de biopelícula se obtuvieron del interior del lahal
superficie de. Durante el proceso de preparación doméstica, típicamente, se
recolecta un litro de leche de vaca y se calienta en una olla de aluminio, casi hasta
el punto de hervir. La leche se retira del fuego y se deja enfriar antes de transferirla
a uno de los
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FIGURA 1 | Posición geográfica de los sitios del proyecto en el norte de Senegal. Los sitios estaban cerca
de la ciudad de Richard Toll, principalmente a lo largo de la orilla sur del río Senegal, que marca la
frontera entre Senegal y Mauritania. Los sitios incluyen las comunidades de Guilado, Medina Cheikh
Mountaga, Didjiery, Pathé Badio, Keur Mbaye Peuhl y Gaé. De cada uno de estos sitios, muestras de lait
caillé fueron recolectados de cuencos de madera lahals) de los hogares, a excepción de la ciudad de Gaé,
donde lait caillé las muestras se recolectaron de cubos de plástico en boutiques.
tradicional de la familia lahals y cubierto con una cubierta de paja. Dependiendo de
la temperatura estacional, la leche se deja fermentar en el lahal durante 12-24 h ( Figura
2A). Noventa y tres muestras de hogares lahal lait caillé Se recolectaron muestras
en cinco comunidades diferentes ( Figura 1): Didjiery n = 10), Keur Mbaye Peuhl ( n = 19), grasa y homogeneización de la leche fermentada con burgal de madera. ( SEGUNDO) lait caillé
Guilado ( n = 23), Medina Cheikh Mountaga ( n = 22) y Pathé Badio ( n = 19). A
diferencia de, lait caillé de entornos más periurbanos se prepara y vende
normalmente en pequeñas tiendas llamadas boutiques. Este proceso utiliza un
producto de leche en polvo en lugar de leche animal fresca. La leche en polvo se
mezcla con agua recién hervida en un gran cubo de plástico, que luego se tapa y se
deja fermentar durante un período de 12 h. Para habilitar el proceso de fermentación
boutique, a menudo se usa el retroceso. Esta técnica implica la reutilización de una
pequeña cantidad de previamente fermentado lait caillé para actuar como cultivo
inicial para el nuevo lote ( Figura 2B). Veintiséis cubo boutique lait caillé Se
recogieron muestras de la localidad de Gaé ( Figura 1).
Muestreo de biopelículas
Para estudiar las composiciones de biopelículas y sus diferencias dentro de una misma
comunidad, lahals fueron muestreados dentro de 10 hogares seleccionados al azar en
Didjiery. Cada muestra de biopelícula se recogió colocando un hisopo estéril en la mitad
de la pared interior del recipiente y usándolo para dibujar un círculo alrededor de la pared
interior, en espiral hacia abajo hasta que alcanzó el punto central del fondo.
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Composición y enriquecimiento de la leche fermentada
FIGURA 2 | Proceso de producción escalonado de la leche fermentada tradicional en el norte de Senegal. ( UNA) Proceso
de producción de lait caillé con leche de vaca en un lahal
como se practica en los hogares de Didjiery, Keur Mbaye Peuhl, Pathé Badio, Guilado y Medina Cheikh
Mountaga: (1) recolección de leche de una vaca; (2) filtración de la leche; (3) pasteurización de la leche por
calentamiento en leña; (4) fermentación de la leche en un lahal durante al menos 12 h; (5) eliminación de
proceso de producción con leche en polvo en balde de plástico en boutiques de la comunidad de Gaé: (1)
la leche en polvo se transfiere a un balde de plástico; (2) se agrega agua a la leche en polvo; (3) se
agrega agua caliente para diluir y calentar más la leche; (4) la leche se mezcla con un pequeño volumen
de lait caillé para iniciar la fermentación (retroceso); (5) el cubo se cubre con una toalla y la leche se
fermenta durante un período de 6 a 7 h. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito del miembro
de la comunidad Gaé para la publicación de estas imágenes.
del cuenco. Se recolectaron muestras duplicadas de cada lahal,
para un total de 20 muestras. Cada hisopo se colocó en un tubo de ensayo que contenía
500 µ l de la solución tampón de extinción ARN - más tarde (ThermoFisher Scienti fi c,
Waltham, MA, Estados Unidos) y enviada para extracción de ADN y secuenciación de
amplicones de ARNr 16S, como se describe más adelante.
Enriquecimiento con Lactobacillus
rhamnosus
Propagación de la bacteria probiótica L. rhamnosus yoba GG, también conocida
como la cepa genérica L. rhamnosus 2012 ( Kort y Sybesma, 2012 ; Sybesma et
al., 2013 ), se estudió en un total de nueve lahals de tres hogares diferentes en la
comunidad de
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Didjiery. Inoculamos el lait caillé con el cultivo iniciador, que contiene L. rhamnosus
yoba 2012 y S. thermophilus C106 ( Kort et al., 2015 ), y tomaron muestras 12 h
después de la fermentación. Como control, el proceso de fermentación natural se
realizó durante el mismo período sin el cultivo iniciador. Para probar el efecto de
los carbohidratos adicionales en la propagación de L. rhamnosus
yoba 2012, utilizamos thiakry con gránulos de mijo, que se añadieron a la
leche junto con el iniciador en la lahal antes del período de fermentación de 12
h. Las muestras se recolectaron, enviaron y procesaron como se describe para
los demás lait caillé muestras.
Extracción de ADN
Las muestras de leche fermentada naturalmente se enfriaron directamente en tubos
con tapón de rosca de 2 ml en RNA-later (ThermoFisher Scienti fi c) y se enviaron a
TNO Zeist, Países Bajos. Posteriormente, 10 µ l de muestra se transfirió a un nuevo
tubo con tapón de rosca de 2 ml que contenía 300 µ l de tampón de lisis (Agowa Mag
Mini DNA Isolation Kit, LGC Ltd., Reino Unido), 500 µ l perlas de circonio (0,1 mm;
productos BioSpec, Bartlesville, Oklahoma, Estados Unidos) y 500 µ l de fenol saturado
con Tris – HCl (pH 8.0; Carl Roth GmbH, Alemania). La rotura mecánica de las células
bacterianas se realizó batiendo las perlas durante 2 min en un disruptor de células
mini-beadbeater-8 (Merlin Bio-products, Breda, Países Bajos) en el fraguado rápido
(homogeneizar). Después de batir las perlas, las muestras se enfriaron en hielo antes
de una etapa de centrifugación de 10 min a 10.000 rotaciones por minuto. Después de
otro paso de extracción de fenol de la fase acuosa, 300 µ l de la fase acuosa se
transfirió a un nuevo tubo de centrifugación prellenado con 600 µ l vinculante bu ff er y
10 µ l perlas magnéticas (Agowa). Después de mezclar, la suspensión se dejó durante
30 minutos para permitir la unión del ADN cromosómico a las perlas magnéticas.
Después de lavar las perlas, el ADN se eluyó de las perlas con 65 µ l según el protocolo
de extracción de ADN de AgowaMagmini.
Secuenciación de amplicones con código de barras
La cantidad de ADN bacteriano presente en las muestras se determinó mediante una
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) utilizando cebadores específicos
para el gen del ARNr 16S bacteriano ( Ciric y col., 2010 ). La secuenciación de amplicones
de ARNr 16S con código de barras de la región hipervariable V4 y el procesamiento de
datos se realizaron de acuerdo con los métodos descritos en detalle por Zaura y col.
(2017) . Brevemente, se llevó a cabo la secuenciación del amplicón 16S rRNA V4 de 200
pg de ADN con cebadores que incluían los adaptadores Illumina y una clave de secuencia
de índice de muestra única de 8 nt ( Kozich y col., 2013 ). Las bibliotecas de amplicones se
combinaron en cantidades equimolares y se purificaron utilizando el kit de extracción
Qiaquick Gel (Qiagen). La secuenciación de amplicones en pares se realizó en la
plataforma Illumina MiSeq (Illumina, Eindhoven, Países Bajos). Los datos de la secuencia
se procesaron con Mothur versión 1.36.1 ( Schloss et al., 2009 ). Se asignaron nombres
taxonómicos a todas las secuencias utilizando el clasificador bayesiano ingenuo del
Ribosomal Database Project (RDP) ( Wang et al., 2007 ).
PCR cuantitativa
La propagación del probiótico L. rhamnosus en lait caillé
Las muestras fueron seguidas por qPCR utilizando 7.500 Fast Real-Time
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Composición y enriquecimiento de la leche fermentada
PCR System (Applied Biosystems) mediante el uso de un protocolo previamente
informado y cebadores diseñados ( Sybesma et al., 2013 ). Brevemente, las
combinaciones de cebador-sonda para las reacciones cuantitativas en cadena de la
polimerasa (qPCR) se diseñaron específicamente para dos genes de L. rhamnosus GG,
denominado PCR1, el spaC
gen (LGG_00444) y PCR2, el L. rhamnosus Gen de copia única específico de GG
(LGG_00154). Las sondas TaqMan contenían la sonda de aglutinante de surco menor
(MGB) en combinación con un atenuador no fl uorescente y un indicador. Las
concentraciones de ADN se dedujeron de una curva de calibración realizada mediante
el uso de una serie de diluciones de concentraciones conocidas de L. rhamnosus ADN
genómico GG.
Análisis de los datos
Los mapas de calor se crearon utilizando el paquete de software MeV (Visor de
experimentos múltiples) versión 4.9.0 ( Saeed et al., 2003 ) para mostrar la abundancia
relativa de géneros de bacterias dentro y entre muestras individuales. El mapa de
calor muestra los 50 géneros más abundantes y se basa en datos de secuencias de
amplicones V4 de rRNA 16S normalizados obtenidos de lait caillé muestras de seis
comunidades en el norte de Senegal ( Figura 3). El número de observaciones para
cada género bacteriano en este mapa de calor se representó en una escala de arco
iris de negro a azul y de verde a rojo. Distribuciones de frecuencia de la Streptococcus-Lactobacillus
el dominio Figura 4), y la fracción de géneros específicos ( Figura 5) se calcularon después de la
exclusión de todos los géneros que solo ocurrieron una vez en una muestra. Los índices de
Shannon ( Archivo complementario S3) se calcularon para todas las muestras utilizando todos
los géneros bacterianos identificados.
Disponibilidad de datos
Se puede acceder a todas las lecturas de datos brutos de ARNr 16S de las muestras
secuenciadas en este estudio bajo el nombre del proyecto 'Composición de la comunidad
bacteriana de la leche fermentada naturalmente del norte de Senegal' en el BioProyecto
NCBI número PRJNA482953. Las fichas técnicas relevantes se publican como Archivos
complementarios S1, S2.
RESULTADOS
Composición de la comunidad bacteriana en la leche
fermentada naturalmente
La composición de un total de 120 lait caillé Se analizaron muestras de seis comunidades
mediante secuenciación de amplicones con códigos de barras. La mayoría de estas
muestras (93) se obtuvieron de lait caillé
preparado en lahals en hogares de las comunidades Didjiery ( n = 10), Keur Mbaye
Peuhl ( n = 19), Guilado ( n = 23), Medina Cheikh Mountaga ( n = 22) y Pathé Badio ( n
= 19). Se recolectó un número menor de muestras de lait caillé preparado en
boutiques en cubos de plástico de la ciudad de Gaé ( n = 26). Las ubicaciones
geográficas de estas comunidades se han indicado en Figura 1, y los métodos de
preparación paso a paso desde la leche hasta el producto fermentado natural se
muestran en Figura 2. En general, las composiciones de la comunidad bacteriana
de las 120 muestras se indican en un mapa de calor en Figura 3, con la relativa
abundancia de
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Parker y col. Composición y enriquecimiento de la leche fermentada

FIGURA 3 | Mapa de calor de los 50 principales géneros bacterianos promedio de cada comunidad. El mapa de calor se basa en datos de secuencia de amplicón V4 de ARNr 16S normalizados obtenidos de ADN
bacteriano aislado de 120 lait caillé muestras de seis comunidades del norte de Senegal. Se recolectaron muestras de cubos de plástico en boutiques de Gaé ( n = 26), y de lahals en hogares de Didjiery ( n = 10), Keur
Mbaye Peuhl ( n = 19), Pathé Badio ( n = 19), Guilado ( n = 23), y Medina Cheikh Mountaga ( n = 22). El número de observaciones para cada género bacteriano se representó en una escala de arco iris de negro a azul
y de verde a rojo. La saturación se fijó en un valor de 60 (1% del máximo).

géneros indicados en una escala codificada por colores de negro a rojo. Después de la
exclusión de los géneros que ocurren solo una vez en una muestra, el número total de
géneros identificados es igual a 122. Entre ellos, los 50 géneros con la mayor abundancia
promedio se muestran en el mapa de calor ( Figura 3).
Aunque se ha identificado una amplia variedad de géneros, el
lait caillé La comunidad bacteriana está dominada por Estreptococo
y Lactobacillus en todas las muestras. Estos dos géneros constituyen, en promedio, el
61,2% y el 31,5%, respectivamente, de la comunidad bacteriana total. Esta
composición se asemeja al yogur normal, que es el producto de la fermentación de la
leche controlada por dos especies de los mismos dos géneros bacterianos. De
acuerdo con la naturaleza incontrolada de su fermentación, el lait caillé La comunidad
bacteriana no solo contiene una amplia variedad de géneros diferentes, sino también
una considerable variación de producto a producto. En el nivel de filo taxonómico
superior, la composición promedio comprende miembros bacterianos de Firmicutes
(96,7%), Proteobacteria (2,9%) y Actinobacteria (0,3%). Aparte de Estreptococo y
Lactobacillus, los Firmicutes están representados por una variedad de otras bacterias
comunes del ácido láctico, que incluyen Lactococcus ( 2,5%),
Weisella 0,4%), Enterococcus ( 0,4%), Leuconostoc ( 0,06%),
Vagococcus ( 0,03%) y Pediococcus ( 0,02%). Entre las proteobacterias, las
bacterias del ácido acético Acetobacter ( 1,6%),
Acinetobacter ( 0,4%) y enterobacterias Escherichia / Shigella
(0,1%) ocurren en abundancias relativamente altas. El tercer filo de Actinobacteria está
representado por el género Kocuria ( 0,3%), así como el género Bi fi dobacterium, este
último solo en un pequeño número de muestras.
Estreptococo y Lactobacillus
Dominar la leche fermentada naturalmente
los lait caillé las muestras están dominadas por un número limitado de géneros. Esto es
evidente a partir de las fracciones máximas por género en cualquiera de las muestras ( Archivo
complementario S3).
En orden decreciente, identificamos las bacterias del ácido láctico
Estreptococo ( máximo 99,5%; presente en el 100% de las muestras),
Lactobacillus ( máximo 91,6%; presente en el 100% de las muestras),
Lactococcus ( máximo 33,4%; presente en el 81,5% de las muestras) y la bacteria
del ácido acético Acetobacter ( máximo 26,6%; presente en el 95,0% de las
muestras). Un género notable es el láctico.

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Parker y col. Composición y enriquecimiento de la leche fermentada

FIGURA 4 | los Streptococcus-Lactobacillus dominio. Gráfico de las fracciones de Lactobacillus vs. las fracciones de Estreptococo en el lait caillé muestras. Las seis comunidades están indicadas por diferentes
colores y códigos de símbolos. La línea de puntos indica dónde f Lactobacillus + f Streptococcus = 100%. El tamaño de los símbolos indica la fracción de Lactococcus.

bacteria ácida Leuconostoc, que ocurre en una fracción máxima de solo 1.2% para cada género, incluida la Tasa de Descubrimiento Falso ( q-
pero ocurre en más de un tercio de las muestras. valor) calculado según el método Benjamini-Hochberg ( Archivo complementario S4). Los
Por lo tanto, la leche fermentada naturalmente en el norte de Senegal parece ser el cuatro géneros en la tabla con un q- valores inferiores al 0,5% se muestran en
resultado de la fermentación de dos géneros bacterianos dominantes. Estreptococo y Lactobacillus
diagramas de caja con las fracciones de cada género representadas en una escala
( Figura 4). La mayoría de las muestras se distribuyen cerca de la línea donde f logarítmica ( Figura 5 y
Lactobacillus + f Streptococcus = 100% (es decir, están completamente dominados por Tabla 1). Keur Mbaye Peuhl, Pathé Badio y Didjiery tienen fracciones más altas de Lactococcus.
Todas las muestras de estas tres comunidades contienen consistentemente Lactococcus.
Las muestras de las otras comunidades productoras contienen Lactococcus solo en
Estreptococo y Lactobacillus). De hecho, en el 78% de las muestras, la suma de Lactobacillus
y Estreptococo fracciones supera el 90%. Además, Figura 4 indica que todas las una fracción de las muestras. Además, encontramos variación de comunidad a
muestras con una alta fracción de Lactococcus ( indicado por el tamaño de los puntos) comunidad para los géneros Enteroccoccus, Bacillus,
tienen una fracción relativamente baja de Lactobacillus. También es evidente a partir de
esta trama que un alto dominio de Lactobacillus correlaciona negativamente con la y Bi fi dobacterium. El perfil de fracción por comunidad de
presencia de altas fracciones de otros géneros que Enterococcus se parece al de Lactococcus, posiblemente como resultado de factores
ambientales similares en estas comunidades. El género formador de esporas Bacilo está
Estreptococo. Estreptococo es dominante (más del 50%) en 9 de cada 10 presente en abundancia relativamente alta en la mayoría de las muestras en Gaé, la
muestras de la comunidad de Didjiery. Lactococcus está presente en una fracción única comunidad donde la leche fermentada naturalmente se preparó en cubos de
inferior al 1% en el 77% de las muestras. Números elevados (más del 1%) de Lactococcus
plástico. El genero Bi fi dobacteria se identificó con baja abundancia en un pequeño
ocurren solo en 11 de 19 muestras de Keur Mbaye Peuhl, en 9 de 19 muestras de número de muestras en tres comunidades, con la mayor frecuencia en Keur Mbaye
Pathé Badio y en 4 de 10 muestras de Didjiery. Peuhl.

Correlación de géneros con comunidades de Diversidad en Lahal Biopelículas y Leche

producción Fermentada
La correlación de fracciones de géneros en fermentados naturalmente Comparamos la composición de la comunidad bacteriana en los productos lácteos dentro de las seis
comunidades de producción fue la lahal biopelícula a la de la leche fermentada naturalmente investigada sistemáticamente mediante la aplicación de un producto de prueba de
Kruskal-Wallis ( Figura 6). En contraste con los fermentados naturalmente

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Parker y col. Composición y enriquecimiento de la leche fermentada

FIGURA 5 | Fracción de géneros específicos en lait caillé muestras por comunidad. Parcelas de caja para géneros por comunidad de producción. Solo géneros con un q < Se muestra el 5% (ver Tabla 1). (UNA) fracción de Lactococcus por

comunidad; ( SEGUNDO) fracción de Enterococcus por comunidad; ( C) fracción de Bacilo por comunidad; ( RE) fracción de

Bi fi dobacteria por comunidad.

Leche, Estreptococo fue en promedio mucho menos abundante que
Lactobacillus en las biopelículas (16 vs 34%). Sin embargo, todos los géneros principales
identi fi cados en la leche fermentada naturalmente también estaban presentes en el biofilm,
incluidas las bacterias del ácido láctico.
Weisella 2,6%), Pediococcus ( 3,4%), Lactococcus ( 0,8%) y bacterias del ácido
acético Acetobacter ( 7,0%) y Gluconobacter
(1,0%). Se observó una abundancia mucho mayor en el biofilm de las
bacterias formadoras de esporas. Clostridium ( 3,0%) y Bacilo 3,0%). Lo más
llamativo fue el predominio en la biopelícula de actinobacterium Kocuria ( 14%), Estreptococos y Lactobacillus, estaban presentes altos niveles de otros géneros
género que ocurre en el 87% de los lait caillé muestras, aunque en baja
abundancia ( Archivo complementario S5). En general, el biofilm muestra
una distribución de géneros mucho más uniforme que los productos lácteos
fermentados naturalmente ( Figura 6).
de los índices de diversidad promedio de Shannon ( Archivo complementario S6).
Aparte de los iniciadores de fermentación, las biopelículas para el lahals y el
método de retroceso comúnmente utilizado para el lait caillé producción en cubos:
algunos comerciantes utilizan iniciadores en forma de tabletas para la inoculación
de la fermentación de la leche, que están disponibles en el mercado local. También
evaluamos la composición bacteriana en estas tabletas ( Archivo complementario
S5) e identificó que, además de
bacterianos, incluyendo Geobacilo y Anoxybacillus,
formadores de esporas termofílicos, que a menudo se encuentran como contaminantes
en entornos de procesamiento de leche ( Zhao y col., 2013 ).

Una comparación adicional de las composiciones de la comunidad bacteriana entre las

muestras analizadas en este estudio indica que la diversidad en la leche fermentada Propagación de probióticos Lactobacillus
naturalmente de tazones de madera no es significativamente diferente de la leche rhamnosus en lait caillé
preparada en baldes de plástico en las tiendas, mientras que el yogur comercial muestra Investigamos el enriquecimiento de lait caillé con la bacteria probiótica L.
una diversidad mucho menor. Como era de esperar, la última composición de la rhamnosus yoba GG, con el nombre genérico
comunidad bacteriana consta solo de Lactobacillus y Estreptococo. L. rhamnosus yoba 2012 Kort y Sybesma, 2012 ). Agregamos el cultivo
iniciador probiótico seco que contiene L. rhamnosus
Estas diferencias de composición observadas también son evidentes yoba 2012 y S. thermophilus C106 ( Kort et al., 2015 ) y

Fronteras en microbiología | www.frontiersin.org 7 Septiembre de 2018 | Volumen 9 | Artículo 2218

Parker y col.
FIGURA 6 | Composición media de la microbiota de lahal biopelícula y leche fermentada. Los gráficos circulares indican los géneros predominantes (> 0,5%) de hogares. lahal biopelículas (10 muestras), hogar lahal
lait caillé 93 muestras de 5 comunidades), el cubo boutique lait caillé 26 muestras de Gaé) y yogures comerciales (6 muestras).
tomó muestras inmediatamente después de agregar el cultivo iniciador solo y después
de agregar el cultivo iniciador con gránulos de mijo (un alimento local conocido como thiakry)
como fuente adicional de carbohidratos. Tomamos una segunda muestra después de
un período de fermentación de 12 h. En nuestro experimento de control negativo (sin
cultivo inicial agregado), no observamos ningún producto amplificado (o solo una
cantidad menor por debajo de 5 fg / µ l × 10 2 fg / µ l) en el experimento de qPCR con
ambas combinaciones de cebadores. Tras la adición del cultivo iniciador seco,
observamos sistemáticamente niveles más altos al inicio y un aumento constante de 30
a 60 veces en la cepa probiótica después del proceso de fermentación de 12 h ( Tabla
2). La proporción de productos amplificados de PCR1 / PCR2 es en todos los casos
cercana a uno, indicativo de la presencia del spaC gen en la mayoría de las bacterias
LGG en la leche fermentada. La presencia del spaC El gen con fi rma la estabilidad del
genoma, ya que este gen se pierde a frecuencias relativamente altas al propagarse en
la leche, lo que afecta las propiedades probióticas de la cepa ( Sybesma et al., 2013 ).
No parece haber un efecto significativo en el crecimiento promedio de la bacteria
probiótica cuando los carbohidratos en forma de thiakry Los gránulos de mijo se
agregan antes del proceso de fermentación ( Tabla 2). Las reacciones de PCR con
ambas combinaciones de cebadores, utilizadas para PCR1 y PCR2 para L. rhamnosus,
proporcionan resultados muy similares. Juntos, los experimentos proporcionan una
clara evidencia de la propagación de
L. rhamnosus en el contexto del proceso natural de fermentación de la leche.
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Composición y enriquecimiento de la leche fermentada
DISCUSIÓN
Este trabajo ilustra que las comunidades bacterianas de más de 100 muestras
domésticas de leche fermentada naturalmente en el norte de Senegal ( lait caillé) están
sin excepción altamente dominados por los géneros Lactobacillus y Estreptococo. Estudios
sobre las composiciones de la comunidad microbiana de los productos lácteos
fermentados naturalmente, incluido el mabisi de Zambia ( Schoustra et al., 2013 ), dahi
de la India ( Shangpliang et al., 2018 ), y varios otros ( Jans et al., 2017 ) - también
indique las composiciones de la comunidad que incluyen Lactobacillus y Estreptococo. Pero,
en la mayoría de esos casos, estas dos bacterias del ácido láctico no dominan.
Consideramos varios factores que son importantes en la configuración de la
comunidad bacteriana de la leche fermentada naturalmente, incluida la
composición de la leche, la composición bacteriana del inóculo, la lahal biopelícula
y factores abióticos. Como podemos discriminar fermentaciones lácticas entre el
tipo "termófilo" y el mesófilo, es probable que las temperaturas relativamente altas
presentes durante el proceso de fermentación sean el factor principal que permita Estreptococo
y Lactobacillus dominar los otros géneros presentes ( Figura 3). De hecho, las
temperaturas óptimas de crecimiento para S. thermophilus y L. delbrueckii
subsp. bulgaricus son 44 ◦ y 43 ◦ C, respectivamente, mientras que el rango de
temperatura de crecimiento óptimo para mesófilos Lactococcus lactis cepas es mucho
menor, entre 27 ◦ y 33 ◦ C ( Adamberg y col., 2003 ). Nuestras investigaciones de sonda de
temperatura en lahal
8 Septiembre de 2018 | Volumen 9 | Artículo 2218
Parker y col. Composición y enriquecimiento de la leche fermentada

TABLA 1 | La correlación de (fracciones de) géneros con las seis comunidades de producción se investigó
aplicando una prueba de Kruskal-Wallis para cada género.

t = 12 h / t = 0 h

dieciséis
qpCR2

N/A
0,5

0.4

34

38

60

28

27
rankID Taxón (género) Kw- prueba. pag- valor q- valor

0.2.30.1.2.6.1 Lactococcus 0,0000000 0,0000000

0.2.2.1.3.1.3 Bi fi dobacteria 0,0000829 0,0026409

0.2.30.1.1.2.4 Bacilo 0,0000642 0,0026409

t = 12 h / t = 0 h
0.2.30.1.2.3.2 Enterococcus 0,0000866 0,0026409

qPCRl

N/A

N/A

1,5

35

47

19

64

33

32
La siguiente tabla muestra el resultado, incluida la Tasa de Descubrimiento Falso (valor q), calculada
según el método Benjamini-Hochberg. Se han enumerado los cuatro géneros con el valor q más bajo.

S.S. # número de hogar; PCR1, PCR cuantitativa con cebadores que coinciden con el gen spaC de L. rhamnosus; PCR2, PCR cuantitativa con cebadores específicos de L. rhamnosus; NA, no disponible como resultado de la contaminación de la muestra.
qPCRl / qPCR2
t = 12 h
El proceso de fermentación confirmó temperaturas excepcionalmente altas que no cayeron por

N/A
0,9

0,7

0,9

0,9

0,8

0,9

0,9

1.0
debajo de 30 ◦ C dentro de las primeras 14 h después de agregar la leche pasteurizada (solo

enfriada a 43 ◦ C) ( Archivo complementario S7).

Nuestra explicación se ve reforzada por la composición de las comunidades

bacterianas en la leche fermentada naturalmente en lahals

qPCRl / qPCR2
muestreado 12 h después de la inoculación, que consistió casi exclusivamente en los

t=0h

N/A

N/A

N/A

0,9

0,7

0,7

0,9

0,8

0,8
géneros Estreptococo y Lactobacillus, como se analiza más adelante.

TABLA 2 | PCR cuantitativa que muestra la propagación de Lactobacillus rhamnosus 2012 en lait caillé factor de aumento de 30 a 60 veces en el contenido de ADN por unidad de volumen durante un período de 12 h).
Aunque nuestra metodología de secuenciación de próxima generación del amplicón 16S
rRNA V4 carece de la resolución para identificar la mayoría de las especies bacterianas sin

PCR2 (fg / µ l)

1.11E + 02

1.89E + 02

2.96E + 05

5.53E + 05

3.33E + 04

5.32E + 05

2.77E + 05

6.52E + 05
ambigüedades, identificamos las especies más abundantes en lait caillé comparando las

N/A
correspondientes secuencias de amplicones de ARNr 16S V4 de Lactobacillus y Estreptococo

t = 12 h
( Archivo complementario S2) con la herramienta de búsqueda de alineación local

PCRl (fg / µ l)
básica (BLAST) contra la base de datos de rRNA 16S para bacterias y arqueas. Las

9.46E + 01

1.24E + 02

1.77E + 02

2.67E + 05

5.07E + 05

2.78E + 04

4.93E + 05

2.58E + 05

6.22E + 05
secuencias más abundantes coincidían exactamente con las de las dos conocidas
especies de yogur. L. delbrueckii
y Streptococcus thermophilus. Curiosamente, una revisión reciente identi fi Streptococcus
infantarius como bacteria del ácido láctico predominante en varios productos lácteos
PCR2 (fg / µ l)

2.25E + 02

5.02E + 02

8.79E + 03

1,47E + 04

2.08E + 03

8,91E + 03

9,85E + 03

2.41E + 04
fermentados de diferentes países africanos ( Jans et al., 2017 ). Sin embargo, no N/A

identificamos una coincidencia con el ARNr 16S de esta especie entre los más
abundantes Estreptococo secuencias en las composiciones bacterianas de lait caillé, que
t=0h

puede resultar de las temperaturas de fermentación relativamente altas que favorecen

el crecimiento de S. thermophilus.
PCRl (fg / µ l)

1.15E + 02

7.71E + 03

1.07E + 04

1.44E + 03

7.74E + 03

7.74E + 03

1.97E + 04
0

En el caso del predominante Lactococcus secuencias, encontramos una combinación perfecta

con la especie Lactococcus lactis, una cepa mesófila, conocida como la principal especie
fermentadora del suero de leche. Una limitación adicional de nuestro estudio es que los hongos
S.S. #

no están incluidos en nuestro análisis de composición, aunque se sabe que están involucrados
en fermentaciones lácticas fúngicas, donde las bacterias del ácido láctico y las levaduras
Lahal #

producen leches alcohólicas (kefir) y leches mohosas (viili) ( Tamang y col., 2016 ). Su presencia
1

podría ser sustancial como cepas de levadura de

Kluyveromyces, Saccharomyces, y Candida crecer bien en leche fermentada natural

a temperaturas superiores a 30 ◦ C ( Kebede et al., 2007 ). Las interdependencias
metabólicas de L. delbrueckii y
Probiótico L. rhamnosus yoba 2012 y thiakri

Streptococcus thermophilus durante la conversión de la leche en yogur se han

estudiado ampliamente ( Sieuwerts et al., 2008 ). Hasta qué punto ambos géneros
Probiótico L. rhamnosus yoba 2012

realmente interactúan o llevan una coexistencia independiente no se puede

concluir de nuestro estudio, ya que esto depende de sus preferencias de
sustrato, interacción con otras cepas y recuentos absolutos de estas especies en
las fermentaciones. Además, la alta densidad de Lactobacillus
Lait caillé

correlaciona inversamente con la presencia de fracciones elevadas de géneros distintos de Estreptococo.

Controlar

En consecuencia, las muestras con un alto

Fronteras en microbiología | www.frontiersin.org 9 Septiembre de 2018 | Volumen 9 | Artículo 2218

Parker y col.
fracción de Lactococcus de las comunidades de Keur Mbaye Peuhl y Pathé Badio
suelen tener bajas fracciones de Lactobacillus
( Figura 4). Por lo tanto, posiblemente, Estreptococo o coexiste con
Lactobacillus o Lactococcus ( posiblemente en fermentaciones a temperaturas
relativamente más bajas), pero la coexistencia de altas fracciones de Lactobacillus y Lactococcus
(34%) que Streptoccocus ( dieciséis%). Sorprendentemente, en promedio también contiene mayores
no se produce.
Entre los géneros menos abundantes, identificamos una serie de bacterias del ácido
láctico comunes, que incluyen Lactococcus, Weisella, Enterococcus, Leuconostoc,
Vagococcus, y Pediococcus, que pueden crecer en la leche fermentada naturalmente
después de períodos prolongados de incubación a temperaturas por debajo de 30 ◦ C.
Además, identificamos las bacterias formadoras de ácido acético Acetobacter y
Gluconobacter en muchos lait caillé muestras. Estos géneros probablemente juegan un
papel en la formación de ácido acético a partir del etanol producido por levaduras.
Además, se identificaron varias enterobacterias en las muestras, incluidas Escherichia /
Shigella, Salmonella, y
Enterococcus. Estos géneros no necesariamente plantean un problema de seguridad
alimentaria, ya que se identifican comúnmente en la leche fermentada natural y en su
mayoría no son patógenos ( Shangpliang et al., 2018 ). Uno de los géneros más notables
que se ha identificado con frecuencia, particularmente en las comunidades Keur Mbaye
Peuhl y Pathé Badio, es el actinobacterium Kocuria. Aunque este género ha sido
identificado previamente en la leche no fermentada de rumiantes ( Li et al., 2017 ), es
tentador especular que su presencia en los productos lácteos fermentados naturalmente
está relacionada con la inoculación del lahal biopelículas, ya que estas biopelículas
contienen cantidades relativamente grandes del género Kocuria ( 14% en promedio,
Archivo complementario S2).
Investigamos si había poblaciones bacterianas dependientes de la comunidad
entre las siete comunidades que estudiamos ( Figura 5).
De acuerdo con estudios previos ( Schoustra et al., 2013 ), encontramos muy poca
evidencia para comunidades específicas sobre la base de la distribución geográfica.
La imagen que surge de los diagramas de caja en Figura 5 es que la variación de la
ocurrencia de géneros es alta, tanto entre comunidades de producción como dentro
de ellas. Algunos géneros ocurren en fracciones más altas en algunas muestras,
pero no siempre de manera consistente dentro de una comunidad de producción.
Aparte de la presencia más frecuente de Lactococcus y Enterococcus con una
abundancia relativamente alta en las muestras, en tres de las seis comunidades, no
hay evidencia clara de la composición microbiana típica por región. los
Lactococcus y Enterococcus los géneros suelen estar implicados en las
fermentaciones de la leche. Lactococcus se sabe que fermenta la leche en productos
lácteos distintos del yogur, como queso, crema agria y suero de leche ( Marco et al.,
2017 ). Aunque la presencia de
Enterococcus se ha considerado como una indicación de higiene insuficiente durante el
procesamiento de la leche, el género también contiene una serie de especies probióticas y se
sabe que está involucrado en el desarrollo del sabor durante el proceso de fermentación de la
leche, lo que posiblemente da como resultado un sabor específico en Enterococcus- que contiene
productos lácteos fermentados Gira ff a, 2003 ).
En gran medida, el inóculo natural (iniciador) controlará la composición
bacteriana del lait caillé producto final, ya que obviamente proporciona la fuente de
bacterias, de las cuales sólo una cantidad limitada podrá propagarse en la leche
como resultado de las condiciones ambientales específicas. De hecho, todos los
principales géneros bacterianos que identificamos en el lahal biopelícula fueron
Fronteras en microbiología | www.frontiersin.org
Composición y enriquecimiento de la leche fermentada
presente en el lait caillé, aunque en diferentes abundancias (comparar
Figuras 3, 6). Sin embargo, la biopelícula es mucho más diversa, como se desprende de los
índices de diversidad de Shannon ( Archivo complementario S6) y contiene en promedio
mayores cantidades de Lactobacillus
cantidades de bacterias formadoras de esporas del género
Bacilo y Clostridium, que puede persistir en el biofilm.
Finalmente, probamos la viabilidad de integrar características de salud
probiótica en lait caillé. Para hacer esto, incorporamos un cultivo iniciador probiótico
seco que contiene L. rhamnosus yoba 2012 y S. thermophilus C106 en el proceso
de fermentación local ( Kort et al., 2015 ). Los resultados indicaron que el probiótico
fue capaz de propagarse en el rico ambiente bacteriano dentro del lahals. Dado que
el probiótico L. rhamnosus yoba 2012 no es capaz de un crecimiento independiente
en la leche, asumimos que el crecimiento del probiótico es eficiente en el lait caillé como
resultado de la suficiente actividad de las cepas proteolíticas, incluida la
S. thermophilus Cepa C106 presente en el cultivo iniciador ( Kort et al., 2015 ).
Recopilamos y analizamos datos de microbiota para evaluar los efectos de la adición
de L. rhamnosus yoba 2012 sobre poblaciones microbianas en lait caillé datos no
mostrados). Sin embargo, no pudimos sacar ninguna conclusión firme de estos análisis, ya
que los datos de secuenciación del amplicón V4 no permitieron discriminar a nivel de
especie para separar de manera inequívoca L. rhamnosus del otro Lactobacillus especies
presentes en la muestra. Además, recopilamos el lait caillé muestras después de un
período relativamente corto de 12 h de fermentación, mientras que la mayoría de las otras lait
caillé Los productos evaluados en el estudio habían sido fermentados durante períodos de
tiempo más largos. Por lo tanto, identificamos casi exclusivamente los géneros
Lactobacillus y Estreptococo. Esto está en consonancia con la noción de que los
primeros géneros de Lactobacillus y Estreptococo fermentar la leche y que la diversidad
de la comunidad bacteriana en la leche fermentada naturalmente aumentará después de
las primeras 12 h de fermentación.
Como nuestros análisis de microbiota no nos permitieron monitorear el crecimiento
del probiótico Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 durante el proceso de fermentación,
llevamos a cabo experimentos de PCR cuantitativa con cebadores específicamente
dirigidos contra esta bacteria probiótica. Estos experimentos revelaron niveles
relativamente altos de L. rhamnosus yoba 2012 en leche fermentada naturalmente
después de una sola ronda de fermentación. Queda por ver si la cepa probiótica es
capaz de invadir el lahal biopelículas y se mantienen en la comunidad bacteriana
durante múltiples rondas de fermentación. De lo contrario, se debe comprar un cultivo
iniciador novedoso para cada fermentación, haciendo que la introducción del L.
rhamnosus
probiótico más sostenible para las aplicaciones comerciales de
lait caillé que las producciones a pequeña escala a nivel doméstico en
lahals.
Beneficios para la salud de L. rhamnosus GG incluyen la prevención y el tratamiento
de infecciones gastrointestinales y diarreas. Esto es muy relevante en el África
subsahariana, donde las enfermedades diarreicas ocasionaron más de 300.000 muertes
de niños menores de cinco años en 2015 ( Troeger y col., 2017 ). Adicionalmente, L.
rhamnosus
Se ha demostrado que la GG estimula las respuestas inmunitarias, se une a las toxinas, suprime los
patógenos y mejora la seguridad alimentaria. Este estudio allana el
10 Septiembre de 2018 | Volumen 9 | Artículo 2218
Parker y col.
camino para la futura integración de tales propiedades probióticas promotoras de la salud en
alimentos fermentados localmente.
CONTRIBUCIONES DE AUTOR
MP, PM y RK diseñaron el estudio, analizaron los datos y redactaron el manuscrito.
MP, AMD, PM y RK llevaron a cabo el trabajo de campo y el muestreo en el norte de
Senegal. DM realizó un análisis de datos y preparó Figuras 4, 5. MHZ realizó los
experimentos de qPCR. MH llevó a cabo la secuenciación de amplicones y el
procesamiento de datos. WS y RK desarrollaron el cultivo iniciador probiótico. Todos
los autores leyeron, corrigieron y aprobaron el manuscrito final.
FONDOS
Este proyecto fue apoyado por la subvención OPP1110874 de la Fundación Bill &
Melinda Gates, Seattle, WA, Estados Unidos.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a las comunidades del norte de Senegal por su apoyo con el
trabajo de campo de muestreo y fermentación.
REFERENCIAS
Adamberg, K., Kask, S., Laht, TM y Paalme, T. (2003). El efecto de
temperatura y pH sobre el crecimiento de bacterias del ácido láctico: un estudio de pH-auxostato.
En t. J. Food Microbiol. 85, 171-183. doi: 10.1016 / S0168-1605 (02) 00537-8
Agence Nationale de la Statistique et de la Démographie [ANSD], ICF (2017).
Senegal. Enquête Démographique et de Santé Continue (EDS Continue 2016).
Rockville, MD: ANSD e ICF.
Ciric, L., Pratten, J., Wilson, M. y Spratt, D. (2010). Desarrollo de una novela
Método qPCR multi-triplex para la evaluación de la estructura de la comunidad bacteriana en poblaciones
orales. Reinar. Microbiol. Reps. 2, 770–774. doi: 10.1111 / j.1758-
2229.2010.00183
de Vos, WM (2011). Soluciones de sistemas por bacterias del ácido láctico: de paradigmas a
práctica. Microb. Hecho celular. 10 (Suplemento 1): S2. doi: 10.1186 / 1475-2859-10-S1-S2 Franz, C.,
Huch, M., Mathara, JM, Abriouel, H., Benomar, N., Reid, G., et al.
(2014). Alimentos fermentados africanos y probióticos. En t. J. Food Microbiol. 190, 84–96. doi: 10.1016 /
j.ijfoodmicro.2014.08.033
Gira ff a, G. (2003). Funcionalidad de los enterococos en productos lácteos. En t. J. Alimentos
Microbiol. 88, 215-222. doi: 10.1016 / S0168-1605 (03) 00183-1
Jans, C., Meile, L., Kaindi, DWM, Kogi-Makau, W., Lamuka, P., Renault, P.,
et al. (2017). Productos lácteos fermentados africanos: descripción general de los microorganismos
de importancia tecnológica predominantes Streptococcus infantarius variantes y posibles
aplicaciones futuras para mejorar la seguridad alimentaria. En t. J. FoodMicrobiol. 250, 27–36. doi:
10.1016 / j.ijfoodmicro.2017.
03.012
Kebede, A., Viljoen, B., Gadaga, H. y Narvhus, J. (2007). Supervivencia y crecimiento
de levaduras en sethemi, leche fermentada naturalmente sudafricana. Food Technol. Biotechnol. 45,
21-26.
Kort, R. y Sybesma, W. (2012). Probióticos para todo el mundo. Trends Biotechnol. 30, 613–615. doi: 10.1016
/ j.tibtech.2012.09.002
Kort, R., Westerik, N., Mariela Serrano, L., Douillard, FP, Gottstein, W., Mukisa,
IM, et al. (2015). Un nuevo consorcio de Lactobacillus rhamnosus y
Streptococcus thermophilus para un mayor acceso a alimentos fermentados funcionales.
Microb. Hecho celular. 14: 195. doi: 10.1186 / s12934-015-0370-x
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Composición y enriquecimiento de la leche fermentada
MATERIAL SUPLEMENTARIO
El material complementario de este artículo se puede encontrar en línea en:
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.
2018.02218 / full # material-suplementario
ARCHIVO S1 | Se lee la secuencia de la hoja de datos sin procesar. La hoja de datos contiene todas las lecturas de
secuencia para todos los taxones hasta el nivel de género identi fi cado en las muestras de leche fermentada
naturalmente de las seis comunidades, cultivos iniciadores recolectados, yogures comerciales y lahal biopelículas.
ARCHIVO S2 | Secuencias únicas de la hoja de datos sin procesar. La hoja de datos contiene todas las secuencias únicas
de ARNr 16S V4 para todos los taxones hasta el nivel de género identificado en las muestras de leche fermentada
naturalmente de las seis comunidades, cultivos iniciadores recolectados, yogures comerciales y lahal biopelículas.
ARCHIVO S3 | Fracción máxima, fracción de muestras, fracción promedio y fracción mediana para cada
género.
ARCHIVO S4 | Prueba de Kruskal-Wallis para la correlación de cada género en productos lácteos fermentados
naturalmente y las seis comunidades de producción, incluida la Tasa de Descubrimiento Falso ( q- valor) calculado
según el método Benjamini-Hochberg.
ARCHIVO S5 | Mapas de calor de las composiciones de la comunidad bacteriana de las tabletas iniciadoras (10) y lahal biopelículas
(20).
ARCHIVO S6 | El rango de índices de Shannon (H ') en las muestras de biopelículas, hogares lait
caillé, cubo boutique lait caillé, y yogures comerciales.
ARCHIVO S7 | Perfiles de temperatura promedio de incubaciones nocturnas de hogares lait caillé fermentaciones
de tres diferentes lahals grabado en la comunidad de Didjiery.
Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK y Schloss, PD
(2013). Desarrollo de una estrategia de secuenciación de doble índice y un proceso de curación para analizar los
datos de la secuencia de amplicones en la plataforma de secuenciación MiSeq illumina. Apl. Reinar. Microbiol. 79,
5112–5120. doi: 10.1128 / AEM.01043-13
Lahtinen, SJ, Haskard, CA, Ouwehand, AC, Salminen, SJ y Ahokas,
JT (2004). Unión de una flatoxina B1 a los componentes de la pared celular de Lactobacillus rhamnosus cepa
GG. Complemento alimenticio. Contam. 21, 158-164. doi: 10.1080 / 02652030310001639521
Li, Z., Wright, AG, Yang, Y., Si, H. y Li, G. (2017). Composición única de la comunidad de bacterias y
co-ocurrencia en la leche de diferentes rumiantes. Sci. Reps.
7: 40950. doi: 10.1038 / srep40950
Marco, ML, Heeney, D., Binda, S., Cifelli, CJ, Cotter, PD, Foligne, B., et al.
(2017). Beneficios para la salud de los alimentos fermentados: microbiota y más. Curr. Opin. Biotechnol. 44,
94-102. doi: 10.1016 / j.copbio.2016.11.010
Mpofu, AA, Linnemann, AR, Nout, MJ, Zwietering, MH, Smid, EJ y den
Besten, HM (2015). Inactivación de patógenos bacterianos en yoba mutandabota, un producto
lácteo fermentado con el probiótico Lactobacillus rhamnosus
yoba. En t. J. Food Microbiol. 217, 42–48. doi: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2015.
09.016
Saeed, AI, Sharov, V., White, J., Li, J., Liang, W., Bhagabati, N., et al. (2003).
TM4: un sistema gratuito de código abierto para la gestión y el análisis de datos de microarrays.
Biotecnología 34, 374–378.
Schloss, PD, Westcott, SL, Ryabin, T., Hall, JR, Hartmann, M., Hollister,
EB y col. (2009). Presentamos mothur: software de código abierto, independiente de la plataforma y
apoyado por la comunidad para describir y comparar comunidades microbianas. Apl. Reinar.
Microbiol. 75, 7537–7541. doi: 10.1128 / AEM. 01541-09
Schoustra, SE, Kasase, C., Toarta, C., Kassen, R. y Poulain, AJ (2013).
Estructura de la comunidad microbiana de tres productos fermentados tradicionales de Zambia:
mabisi, chibwantu y munkoyo. Más uno 8: e63948. doi: 10.1371 / journal.pone.0063948
Segers, ME y Lebeer, S. (2014). Hacia una mejor comprensión de
Lactobacillus rhamnosus GG: interacciones del anfitrión. Microb. Hecho celular. 13 (Supl.
1): S7. doi: 10.1186 / 1475-2859-13-S1-S7
Septiembre de 2018 | Volumen 9 | Artículo 2218
Parker y col.
Shangpliang, HNJ, Rai, R., Keisam, S., Jeyaram, K. y Tamang, JP
(2018). Comunidad bacteriana en productos lácteos fermentados naturalmente de Arunachal Pradesh y Sikkim
de la India analizados mediante secuenciación de amplicones de alto rendimiento. Sci. Reps. 8: 1532. doi:
10.1038 / s41598-018-19524-6
Sieuwerts, S., de Bok, FA, Hugenholtz, J. y van Hylckama Vlieg, JE (2008).
Desentrañar las interacciones microbianas en las fermentaciones de alimentos: del enfoque clásico al
genómico. Apl. Reinar. Microbiol. 74, 4997–5007. doi: 10.1128 / AEM.00113-08
Steinkraus, KH (1997). Clasificación de alimentos fermentados: revisión mundial de
técnicas de fermentación caseras. Control de alimentos 8, 311–317. doi: 10.1016 / S0956-7135 (97)
00050-9
Sybesma, W., Molenaar, D., van IJcken, W., Venema, K. y Kort, R. (2013).
Inestabilidad del genoma en Lactobacillus rhamnosus GG. Apl. Reinar. Microbiol.
79, 2233–2239. doi: 10.1128 / AEM.03566-12
Tamang, JP, Watanabe, K. y Holzapfel, WH (2016). Diversidad de
microorganismos en alimentos y bebidas fermentados a nivel mundial. Frente. Microbiol.
7: 377. doi: 10.3389 / fmicb.2016.00377
Troeger, C., Forouzanfar, M., Rao, PC, Khalil, I., Brown, A., Reiner, RC, et al.
(2017). Estimaciones de la morbilidad, mortalidad y etiologías de las enfermedades diarreicas a nivel mundial,
regional y nacional: un análisis sistemático para el estudio de la carga mundial de morbilidad 2015. Lancet Infect.
Dis. 17, 909–948. doi: 10.1016 / S1473-3099 (17) 30276-1
Wang, Q., Garrity, GM, Tiedje, JM y Cole, JR (2007). Ingenuo bayesiano
clasificador para la asignación rápida de secuencias de rrna en la nueva taxonomía bacteriana. Apl.
Reinar. Microbiol. 73, 5261–5267. doi: 10.1128 / AEM. 00062-07
Westerik, N., Kort, R., Sybesma, W. y Reid, G. (2018). Lactobacillus
rhamnosus alimentos probióticos como herramienta para el empoderamiento en toda la cadena de valor en
África. Frente. Microbiol. 9: 1501. doi: 10.3389 / fmicb.2018.
01501
Zaura, E., Brandt, BW, Prodan, A., Teixeira de Mattos, MJ, Imangaliyev, S.,
Kool, J. y col. (2017). Sobre la red ecosistémica de saliva en adultos jóvenes sanos. ISME J. 11,
1218-1231. doi: 10.1038 / ismej.
2016.199
Zhao, Y., Caspers, MP, Metselaar, KI, de Boer, P., Roeselers, G., Moezelaar, R.,
et al. (2013). Factores abióticos y microbióticos que controlan la formación de biopelículas
Fronteras en microbiología | www.frontiersin.org
Composición y enriquecimiento de la leche fermentada
por formadores de esporas termofílicos. Apl. Reinar. Microbiol. 79, 5652–5660. doi: 10.1128 /
AEM.00949-13
Zobrist, S., Kalra, N., Pelto, G., Wittenbrink, B., Milani, P., Diallo, AM,
et al. (2017). Resultados de la aplicación de técnicas de análisis de dominio cultural e implicaciones para el
diseño de intervenciones de alimentación complementaria en el norte de Senegal. Alimentos Nutr. Toro. 38,
512–527. doi: 10.1177 / 0379572117720749
Zobrist, S., Kalra, N., Pelto, G., Wittenbrink, B., Milani, P., Diallo, AM y col.
(2018). Uso del mapeo cognitivo para comprender las decisiones de alimentación de lactantes y niños pequeños
senegaleses. Matern. Child Nutr. 14: e12542. doi: 10.1111 / mcn. 12542
Declaración de conflicto de intereses: RK y WS son los fundadores de la fundación Yoba for Life (2009), una
organización sin fines de lucro, acreditada por las autoridades fiscales holandesas como una institución pública
benéfica (PBI), que tiene como objetivo promover la producción y el consumo local de productos fermentados en
África. . Los productos fermentados africanos elaborados con la cultura de arranque Yoba no son comercializados
por la fundación como tal, pero la fundación Yoba for Life estimula la producción y la propiedad locales, permitiendo
actividades generadoras de ingresos para los pequeños empresarios africanos en el sector alimentario. La
fundación Yoba for Life distribuye y vende sobres listos para usar con cultivos iniciadores bacterianos secos a precio
de costo, a través de una red de socios y voluntarios para facilitar la producción local de productos lácteos y a base
de cereales mediante fermentación bacteriana controlada. La cultura del iniciador Yoba contiene L. rhamnosus
yoba 2012, que es la variante genérica de L. rhamnosus GG.
Los autores restantes declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales
o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Copyright © 2018 Parker, Zobrist, Donahue, Edick, Mansen, Hassan Zade Nadjari, Heerikhuisen, Sybesma,
Molenaar, Diallo, Milani y Kort. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la
Licencia de atribución Creative Commons (CC BY). Se permite el uso, distribución o reproducción en otros
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12 Septiembre de 2018 | Volumen 9 | Artículo 2218